脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神经营养因子家族的一员，在神经元的存活和分化、突触发育和可塑性以及许多认知功能中起着重要的调节作用(1,2). 神经营养素的合成和分泌受神经元活动的调节，这一发现提示神经营养素可能调节大脑中活动依赖性神经可塑性(三). 事实上，现在有大量证据表明，谷氨酸能突触活动诱导的BDNF分泌对长期增强（LTP）至关重要(4)神经电路的学习和记忆功能的细胞基底。
BDNF蛋白首先在内质网中合成为前体蛋白，即前体BDNF，然后通过去除信号肽将其转化为前BDNF并进一步裂解生成成熟的BDNF(5). 使用BDNF前体和成熟体的特异性抗体进行的免疫染色和电子显微镜研究表明，前BDNF与成熟BDNF在突触前轴突末端的分泌颗粒中共定位(6)表明卵裂可能发生在分泌颗粒中。然而，在某些实验条件下，前BDNF可能在细胞外被加工成成熟的BDNF(7,8). 含有BDNF和前BDNF的分泌颗粒在神经元兴奋时可以进行胞吐，这一点在细胞培养中可以通过ELISA或神经元中表达的荧光蛋白标记的BDNF轻易证明(9,10). 除了分泌颗粒外，神经元胞浆内的神经营养素也可能存在于内胚小室中，这是由神经元本身或其他邻近细胞分泌的细胞外神经营养素的内吞摄取所致。神经营养素最初被发现是靶组织衍生的因子，通过与神经元表面受体结合发挥作用，包括原肌球蛋白相关激酶B（TrkB）和泛神经营养素受体p75(11). 神经营养素与其受体结合导致细胞质信号传导以及神经营养素受体复合物的内化。这些内吞的神经营养素受体复合体以“信号内体”的形式保持活性，可以在神经元细胞质内长距离运输，以在神经元内发挥其调节功能(12–15). 在本研究中，我们检测了这些内体可能在突触后树突处进行活性依赖性胞吐的可能性，从而提供了突触BDNF的额外来源。
为了通过内吞途径标记含有BDNF的内体，有必要监测BDNF在神经元中的转运。尽管YFP标记的BDNF已被用于研究外源性BDNF的内化(16)，这种荧光蛋白标记的BDNF不适合在高时空分辨率下实时跟踪含BDNF的内体。在本研究中，我们使用了与量子点（QD）相连的BDNF，量子点是具有良好光稳定性的荧光纳米粒子(17)并且可以在具有高信噪比和前所未有的持续时间的活细胞中进行跟踪。这种方法已被用于检测突触小泡的内吞循环(18)和含有神经营养素的内体的轴突运输(19,20). 在本研究中，我们使用培养海马神经元内BDNF-QDs的延时成像来监测这些内体的细胞内转运和定位。此外，在含有荧光猝灭剂的溶液中，细胞质QD荧光突然消失，这表明含有QD的内体胞吐。先前的研究表明，细胞外假递质、可溶性荧光标记物和膜结合荧光脂质染料可以被加载到内胚体中，内胚体在膜去极化时会发生胞吐(21–25). 然而，由受体介导的内吞作用形成的内吞体是否同样受活性调节尚不清楚。此外，Ca2+-不同内质体囊泡群体的依赖性和胞吐动力学可能受到不同囊泡相关蛋白的差异调节。
在本研究中，我们探讨了突触结合蛋白（Syt）和复合蛋白（Cpx）在调节含BDNF内体活性诱导的胞吐中的作用。作为所有钙的通用辅因子2+-已检查的触发性囊泡融合反应(26)，已知Cpx通过与Ca相互作用，对囊泡胞吐具有激活和阻断功能2+传感器Syt和组装在质膜上的SNARE复合物(27). Syt的不同亚型在不同类型的神经分泌中发挥不同的调节作用，可能是通过其差异钙2+敏感。通过调控培养海马神经元中各种Syt和Cpx亚型的表达，我们发现Syt6和Cpx1/2在BDNF内体活性依赖性胞吐中起着重要的调节作用。这些结果支持这样的观点，即含BDNF的内体可能是细胞外BDNF来源，用于活动依赖性突触调制，Syt6特异性调节含BDNF-内体的胞吐。
结果
胞内BDNF-QDs的细胞内定位。
为了研究内吞BDNF的细胞内处理和分泌，我们使用链霉亲和素结合QDs（QD655s）(材料和方法和图S1)与生物素化BDNF相关的。BDNF-QDs的生物活性已通过TrkB过度表达3T3细胞中诱导的TrkB磷酸化和海马神经元中Erk1/2磷酸化显示出来(19). 体外培养13–16天（DIV）的培养海马神经元用1 nM BDNF-QD处理10分钟(). 神经元荧光成像显示，胞体和神经突起中有许多明亮和闪烁的点状突起。通过胞外添加荧光猝灭剂QSY 21羧酸-琥珀酰亚胺酯（QSY21）验证了BDNF-QDs的细胞内定位，该猝灭剂有效地猝灭了与培养底物和细胞表面结合的胞外BDNF-WDs的荧光(28) (图S2A类). 树突和轴突中均观察到内吞的BDNF-QDs，它们分别被鉴定为微管相关蛋白2（MAP2）染色的厚突起和轴突特异性标记Smi-312标记的薄突起(). 在所有病例中，我们发现树突中BDNF-QD点的密度显著高于轴突中的密度。相反，当使用未修饰的BDNF和QD的混合物培养细胞时，很少观察到内化的QD(). 此外，当神经元在TrkB-Fc蛋白（10μg/mL）的存在下与BDNF-QDs孵育时，内化BDNF-Qs的数量可以忽略不计，TrkB-F蛋白是一种可溶性的Fc-标记的TrkB，与细胞表面TrkB竞争BDNF结合(29). 因此，BDNF-QDs的内化依赖于BDNF与细胞表面的结合。
BDNF-QDs在培养海马神经元中的内化及其在细胞质室中的定位。(A类)BDNF-QD设计示意图。生物素化的BDNF首先与链霉亲和素偶联的QD655s连接，然后将其应用于细胞外培养的神经元以进行内吞。(B类)海马神经元内吞BDNF-QDs（红色）的荧光图像，MAP2（蓝色）和Smi-312（绿色）的免疫染色，分别定位于躯体软骨区和轴突。（比例尺，20μm）(C)在常规培养基（CTL）和补充对照IgG Fc、BDNF清除剂配体TrkB Fc或非偶联BDNF和QDs的培养基中，轴突和树突中内化的BDNF QDs的数量(n个=4种培养物，每种条件下每种培养物8–16个神经元*P（P）通过单向方差分析和Tukey事后HSD测试得出<0.001）。误差线，SEM(天和E类)枝晶样品(天)和轴突(E类)显示BDNF-QDs（红色）相对于突触后标记物PSD-95免疫染色点的分布(天，绿色）或突触前标志物Syp(E类，绿色）和MAP2（蓝色）。箭头：共定位的BDNF量子点和突触标记物。（比例尺，10μm）(F类)含有内化BDNF-QDs（红色）的神经元中早期内体标记物EEA1（绿色）和MAP2（蓝色）的联合免疫染色。方框区域以较高的分辨率显示在右侧。（比例尺，20μm）（放大倍数，～4×4。）(G公司和H（H）)样品枝晶的荧光图像(G公司)和轴突(H（H）)含有内化BDNF-QDs（红色）和表达BDNF-EGFP（绿色）。（比例尺，20μm）
为了表征内吞BDNF的细胞分布，我们在BDNF-QD孵育10分钟后固定神经元，并用抗突触后蛋白PSD95和突触囊泡相关蛋白突触素（Syp）的抗体对细胞进行免疫染色。我们发现树突中的BDNF QDs亚群（15.6±1.6%）与PSD95点状共定位，轴突中的BDNF QDs亚群（29.8±3.0%）与Syp点状共定位(). 因此，尽管只有少量含有BDNF-QD的囊泡似乎位于树突和轴突的突触位点，但其百分比远高于PSD95或Syp点在这些过程中占据的平均面积（~8%）(图S3C)这表明内吞BDNF-QD优先位于突触部位。其他免疫染色研究表明，约50%的BDNF-QDs与早期内体蛋白EEA1共定位()，表明BDNF-QDs通过内吞作用进入细胞，并驻留在内吞小室中。
还比较了内吞和内源性合成BDNF的细胞内分布。BDNF-EGFP质粒转染的神经元(材料和方法)与BDNF-QDs孵育1h，在外猝灭剂QSY21存在下用EGFP和QD655荧光检测活神经元。我们发现BDNF-EGFP以类似于BDNF-QDs的点状分布在树突和轴突中，尽管BDNF-QA点状较小且较圆(). 此外，BDNF-QDs和BDNF-EGFP puncta基本上没有重叠，因为定量荧光测量表明QD和EGFP荧光之间没有相关性[皮尔逊相关系数=−0.096±0.009（SEM），n个=4个独立培养基]，表明内吞和内生合成的BDNF位于不同的细胞内隔间。
内源性BDNF-QDs的细胞质转运。
先前的研究表明，BDNF/TrkB内体在内化后在轴突中向细胞体进行达因依赖性的逆行运输(30). 为了研究内源性BDNF-QD在轴突和树突的转运，将10–16 DIV上的海马神经元灌流BDNF-QDs 2 min，然后使用含有QSY21的盐水灌流培养物30 min，然后在QSY21存在下进行延时成像。如BDNF-QDs轴突转运的代表性轨迹和波形图所示(和电影S1)，大多数转运的BDNF-QD被发现处于逆行方向（朝向细胞体），并有间歇性停顿，这与之前的报告一致(19) (). 相反，树突中的BDNF-QDs在顺行方向和逆行方向之间表现出频繁的改变，导致极为有限的净易位(). 许多BDNF-QD（树突中为69.8±5.4%，轴突中为64.5±2.1%，n个=7个神经元）在标准观察期（30–60分钟）内被固定。轴突和树突的平均移位速度（按需速度）在0.1–0.3μm/s范围内()与主动电机驱动运输一致。
BDNF-QDs的轴突和树突转运。(A类)用BDNF量子点处理10分钟的海马神经元的图像，并立即通过延时成像检查内吞的BDNF量子点的转运轨迹。（比例尺，20μm）(B类)线性化轴突和树突段样品的Kymography图（用黄色方框标记A类). 轴突中大多数BDNF-QD(左侧)逆行移动（朝向细胞体），少数呈顺行移动（箭头）。相反，枝晶中的BDNF-QD(居中和赖特)顺行和逆行方向移动。（比例尺，20μm）(C)BDNF量子点在轴突或树突中以三种转运模式花费的时间的平均百分比，来自所有脑脊髓电图的数据(n个=来自四种10-13 DIV培养物的7个神经元）。(天)在标准观察时间（30分钟）内，所有检测神经元的BDNF-QDs在轴突和树突的平均净移位距离。误差条，SEM(*P（P）<0.01学生t吨测试）。(E类)在所有波形图中观察到的轴突和树突顺行和逆行运输的平均速度。误差线，SEM。
BDNF-QDs的活性诱导内吞作用。
为了确定BDNF-QDs的内吞作用是否会受到神经元活性的影响，我们在6 DIV上用PSD95-GFP转染海马培养物，然后在12-15 DIV上将培养物暴露在含有BDNF-Qs的溶液中10分钟，是否进行提高神经元活性的处理。与BDNF-QDs孵育后10分钟内，对神经元进行时间推移成像。在没有提高活性的治疗的情况下，我们发现17.2±1.9%的BDNF-QDs与PSD95-GFP点状物共定位(图S3A类). 由于这一百分比远高于PSD95-GFP占据的树枝状区域的百分比（7.8±0.5%），内化的BDNF-QD并不是随机分布在树枝状晶中，而是优先定位于PSD95-GFP位点。当使用含有45 mM KCl或200μM甘氨酸的BDNF-QD培养基（分别诱导NMDA受体去极化或增强激活）提高神经元活性时，与PSD95-GFP点状物共定位的BDNF-QD数量显著增加(图S3A类和C). 因此，神经元活动增强了突触后位置的优先BDNF-QD内吞作用，或在内吞作用后立即在这些位置捕获含有BDNF-QD的内体。
为了进一步检测BDNF-QD沿轴突的内化位点，我们用Syp-GFP转染神经元以标记突触前位点。我们发现33.8±3.9%的BDNF-QDs与Syp-GFP共定位+站点(图S3B类). 在45 mM KCl存在下孵育BDNF-QDs后，共定位的百分比增加到44.0±3.0%，表明活性也增强了BDNF-Qs在突触前部位的内吞定位。此外，轴突中BDNF-QD摄取总量没有显著增加（0.032±0.005/μm2对照组与0.025±0.004/μm245 mM KCl）。总之，这些结果表明，神经元活动增强了BDNF量子点的内化及其在突触前和突触后位点的定位。
突触后位点BDNF量子点的活性依赖性胞吐作用。
为了检测含有BDNF-QDs的内体的胞吐，我们监测了在细胞外QSY21存在下先前装载的BDNF-QDs的荧光突然消失，这在含有BDNF-QD的内体与质膜融合后熄灭了QD荧光(). 在本研究中，我们将DIV 12-16海马神经元暴露于含有BDNF-QDs的溶液中60分钟，然后用含有QSY21的盐水灌注培养物，并在没有或存在细胞外电刺激的情况下，对内吞的BDNF-WDs进行延时成像（采样率为0.2 Hz）。轴突/树突的同一性由轴突形态确定，并在某些情况下通过体树突标记MAP2和轴突标记Smi-312的免疫染色进一步证实(图S4A类). 荧光钙证实了电刺激在触发神经元放电中的有效性2+使用指示剂钙橙成像。如所示图S4B类θ-脉冲刺激（TBS，每5 s间隔12个脉冲串，每个脉冲串由10个100-Hz脉冲串组成，每串由5个2-ms脉冲组成，间隔200 ms）导致钙橙荧光立即增加30%，反映了神经元的放电(31). 我们发现少量（12.6±1.7%）BDNF-QDs在刺激后消失，表明树突分泌含BDNF-QD的内体。
钙2+-BDNF-QDs在突触后位点活性诱导分泌的依赖性。(A类)检测内吞BDNF-QDs分泌的实验设计示意图。在海马神经元内吞BDNF-QDs后，向培养物中添加膜非导荧光猝灭剂QSY 21（灰色）。由于细胞外QSY21的荧光猝灭，QD荧光突然消失，表明BDNF-QDs的分泌。(B类)包含内化BDNF-QDs并表达PSD95-GFP的示例神经元的图像。白线标记了四个树突段，如所示C以线性化的方式。（比例尺，10μm）(C)顶部的图像显示BDNF-QD和PSD95点状物沿四个树突段的分布。黑色箭头，与PSD95-GFP斑点共定位的BDNF量子点。下面的Kymograph轨迹显示了上述四个片段QD荧光随时间的变化。黄色带，TBS期。黄色箭头：与PSD95-GFP点同位的BDNF-QD消失的时间。红色箭头：PSD95-GFP处BDNF-QD消失的时间−地点。(天)对位于PSD95-GFP的BDNF-QD在整个成像过程（13分钟）中分泌的BDNF-QD百分比进行量化+和PSD95-GFP−站点(n个=来自六种培养物的38个神经元）。黄色波段：TBS时期。(E类)PSD95-GFP分泌的BDNF-QD百分比摘要+和Cd存在下的阴性位点2+或各种谷氨酸受体阻滞剂在TBS之前（蓝色）、期间（红色）和之后（绿色）。误差条表示所有面板中的SEM(n个=6种培养物*P（P）成对<0.05t吨测试）。
为了进一步检测BDNF-QD释放位点是否位于突触，我们将表达PSD95-GFP的载体转染培养的5-6 DIV海马神经元，以标记突触后位点，并在延时成像前将神经元暴露于12-16 DIV含有BDNF-Qs的溶液中60分钟。我们发现大多数PSD95-GFP点（95%）不动，与Syp免疫染色共定位或并置（1像素内，1像素=267nm），与突触后位点一致。此外，我们发现只有约9.5%的BDNF-QD与PSD95-GFP punta共定位()，表明1小时后PSD95-GFP位点没有BDNF-QDs的明显浓度。然而，在所有在实验12分钟内消失的PSD95共定位BDNF-Qs中，38.3±9.6%在TBS 1分钟内消失（黄色箭头在和中的黄色开圆圈电影S2). 相反，那些未与PSD95-GFP点状物共定位的BDNF-QD在12分钟内以明显的随机方式消失，与TBS无关（). 这些结果表明，突触后树突状位点的胞内BDNF分泌对TBS的敏感性远高于非突触位点。
对钙的依赖性2+流入和谷氨酸受体激活。
检测刺激诱导的BDNF-QDs释放是否依赖于钙2+我们用含有20μM Cd的细胞外液灌注培养物2+，阻断质膜钙2+通道，在成像期间。对于BDNF-QD与PSD95-GFP puncta共定位，我们发现在PSD95时BDNF-QA的释放百分比+TBS期间的位点减少到与PSD95相似的低水平−站点，与TBS前后发现的站点类似(). 因此，Ca2+突触后位置含有BDNF-QD的小泡的胞吐需要对神经元活动作出反应。
我们还研究了谷氨酸受体的AMPA和NMDA亚型的作用，它们可能因突触前和突触后神经元对TBS的反应而被激活。当AMPA或NMDA受体被6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮（CNQX）或d日-（−）-2-氨基-5-戊酸磷酸(d日-APV），分别为PSD95时BDNF-QD释放的百分比+TBS期间的位点减少到与镉类似的低水平2+处理(). 阻断AMPA和NMDA受体与阻断任一类型的谷氨酸受体具有相同的效果。这些结果支持了Ca2+通过NMDA受体的内流对于突触后树突部位BDNF量子点的活性诱导释放至关重要，NMDA受体的激活因AMPA受体的激活而被膜去极化所促进。
Syt6发生活性诱导分泌+地点。
突触囊泡融合与涉及Syt和Cpx的其他形式的神经分泌有共同的SNARE介导的融合机制(32). 为了检测Syt家族的一个特定成员是否参与突触后位置内吞BDNF的活性依赖性分泌，我们从大鼠胚胎第19天海马克隆了Syt1、Syt4、Syt6、Syt7、Syt9、Syt11、Syt12和Syt17(表S1)并在分离的海马神经元中单独表达各种GFP标记的Syt亚型。在这些亚型中，Syt4、Syt6、Syt9和Syt12均在轴突和树突中表达；Syt1、Syt7和Syt17主要位于轴突；Syt11主要在树突中表达。我们发现Syt17-GFP与PSD95点状突起并列共定位的百分比最高（27.8±4.3%）(图S5)表明其突触前定位。此外，Syt6-、Syt9-和Syt12-GFP显示中间值（10-12%），Syt1-、Syt4-和Syt11-GFP与PSD95 punta的共定位最低（<5%）。
在将表达八种Syt-GFP之一的12-16个DIV神经元暴露于BDNF QDs 1小时后，进行延时成像（用1分钟TBS观察12分钟），以检查在神经元中表达的Syt-GFP的不同亚型共定位和不共定位的位点的BDNF-QD释放。在八个组中，我们发现与Syt6-GFP斑点共定位的内吞BDNF-QDs的百分比最高(). 此外，Syt6-GFP表达神经元释放的BDNF-QDs总量显著增加（13.6±2.4%）。在TBS期间，Syt6-GFP位点BDNF-QD释放的百分比也要高得多（37.8±9.9%）()此外，在显示Syt1、Syt4、Syt9和Syt12 punta(). 因此，树突处与Syt6相关的BDNF-QDs以活性依赖的方式释放，表明Syt6作为特定的Ca2+-促进含BDNF内体胞吐的传感器。
BDNF量子点的分泌主要发生在Syt6位点。(A类)海马神经元线性化树突段的代表性图像，包含内化BDNF-QDs并表达Syt6-GFP。白色箭头、共同定位的BDNF-QD和Syt6-GFP punta。（比例尺，10μm）(B类)在所有检查的树突中与Syt-GFP点共定位的内吞BDNF-QDs的平均百分比(n个=Syt1、-4、-6、-9、-12的三到六个12–15 DIV培养物中的3–5个神经元；Syt7、-11、-17的两种培养物）。误差线，SEM(C)BDNF-QD运动的线性树枝状段和波形图示例。(上部)黑色箭头，BDNF-QD与Syt6-GFP punta共定位。(下部)黄色带，TBS周期。箭头标记与（黄色）或不与（红色）Syt6-GFP斑点共定位的BDNF量子点的消失时间。(天)Syt6-GFP在1分钟时间段内释放的BDNF QDs的平均百分比（对每个神经元进行归一化）+或Syt6-GFP−检测的所有DIV 12-16神经元中的位点(n个=来自五种培养物的27个神经元）。误差线，SEM(E类)Syt-GFP发布的BDNF-QD的平均百分比+或Syt-GFP−表达六种Syt亚型之一的所有神经元在TBS之前（蓝色）、期间（红色）和之后（绿色）的位置(n个=所有Syt1、-4、-6、-9、-12各3-5个培养基；Syt11的2种培养基）。误差条，SEM(*P（P）成对<0.01t吨测试）。
Syt6敲除受损活动诱导的突触后BDNF-QD释放。
为了进一步探讨各种Syt亚型在BDNF-QD释放中的作用，我们使用特异性siRNAs对培养的海马神经元进行了功能丧失实验，以对抗发现位于树突的四种Syt亚型别Syt4、Syt6、Syt11和Syt12的表达（见上文）。通过Western blotting和免疫染色在培养的293T细胞中证实了靶向这四种Syt亚型的siRNA载体的敲除效率(图S6B类和第7部分B–D类和F类). 抗Sy4的siRNA（siSyt4）和抗Syt6的两种siRNA形式中的任何一种分别下调海马神经元内源性Syt4和Syt6一或siSyt6b条)通过免疫染色进一步证实(图S6C和第7部分E类和G公司). 接下来，我们将siSyt4、siSyt6、siSyt11或siSyt12与PSD95-GFP一起转染DIV 5-6神经元，并检测TBS诱导的12-16 DIV BDNF-QDs释放+在转染siSyt6的神经元中，TBS期间的位点减少到基础水平一或siSyt6b条(). 相反，没有一个神经元转染了siSyt4、siSyt6秒（siSyt6的加扰序列b条)siSyt11、siSyt12或控制载体UI4对TBS诱导的PSD95释放有任何显著影响+站点(). 此外，siSyt6的击倒效应b条可以通过共表达siSyt6来预防b条-耐Syt6客户尽职调查(). 因此，Syt6的特异性下调消除了突触后位点BDNF-QDs的活性驱动释放。这些发现进一步支持了以下观点：Syt6是一种亚型，专门参与调节突触后部位内吞BDNF的活性依赖性分泌。
Syt6的下调选择性地损害了突触后部位BDNF-QD的释放。(A类)Syt6的示意结构，带有用于生成siRNA结构的位点（siSyt6一，siSyt6b条和siSyt6秒用蓝色的方块标记。(B类)PSD95-GFP 1分钟时间段内释放的BDNF-QD的平均百分比+或PSD95-GFP−转染siSyt6的DIV 12-16神经元中的位点一或控制矢量。黄色波段，TBS时段。误差线，SEM(n个=来自八种培养物的3-7个神经元）。(C)PSD95-GFP每分钟释放BDNF-QD的平均百分比+或PSD95-GFP−转染Syt6和对照载体不同形式siRNA的神经元中的位点，在TBS之前（蓝色）、期间（红色）和之后（绿色）。误差条，SEM(n个=3-10个培养基*P（P）<0.05和**P（P）<0.01学生t吨测试）。(天)PSD95-GFP每分钟释放BDNF-QD的平均百分比+或PSD95-GFP−不同Syt亚型在TBS之前（蓝色）、期间（红色）和之后（绿色）下调的神经元中的位置。误差条，SEM(n个=4–8种培养基*P（P）<0.05（学生）t吨测试）。
内源性合成BDNF的活性诱导分泌。
最近有报道称，Syt4定位于含有内源性合成BDNF的囊泡，BDNF由轴突和树突分泌，以响应神经元去极化(33). 为了进一步研究调节内吞性BDNF释放的机制是否也适用于内源性合成的BDNF，我们用BDNF-EGFP融合蛋白转染培养的海马神经元，以观察电刺激后BDNF的释放事件(34)并检测了Syt4或Syt6的过表达或敲低的影响。我们将Syt4、Syt6、siSyt4或siSyt6与BDNF-EGFP一起转染到DIV 5-6神经元，并在13-16 DIV上通过延时成像（采样率为0.2 Hz）检测TBS诱导的BDNF-EGFP释放，表明含有BDNF-EGFP的小泡的胞吐(和电影S3). Ca高程2+在TBS期间，同时监测EGFP荧光的减少，在TBS结束时（TBS后0–30秒）达到最大值（峰值）(). 此外，Syt4的敲除增加，而过表达减少了TBS诱导的BDNF-EGFP的分泌，表明Syt4抑制树突中BDNF-EGFP的分泌(). 相反，Syt6的过度表达或敲除对TBS诱导的BDNF-EGFP分泌没有显著影响。总之，这些实验表明，Syt4和Syt6分别对内源性合成BDNF和内吞BDNF的分泌起特定的调节作用，并且它们的调节作用是相反的：Syt4抑制分泌，Syt6促进分泌。
Syt4，而不是Syt6，调节树突中BDNF-EGFP的活性诱导分泌。(A类)在TBS应用前30 s、应用后3 s和60 s拍摄的转染对照载体和BDNF-EGFP的海马神经元的代表性图像。箭头，显示TBS后荧光减弱的BDNF-EGFP点。（比例尺，10μm）(B类)装箱区域I和IIA类以更高的分辨率显示。（放大倍数为1.12×1.12。）(C)BDNF-EGFP和Ca平均值的代表性踪迹2+对照神经元树突处的橙色荧光变化（如图所示A类和B类)，TBS时段用横线标记。荧光水平通过TBS之前的标准化(n个= 10). 误差条，SD(天)对照组和Syt4-和Syt6-过度表达神经元树突中BDNF-EGFP点状荧光的平均痕迹(n个=每组4个培养基）。误差线，SEM(E类)对照组和siSyt4或siSyt6转染神经元树突中BDNF-EGFP点状荧光平均值的痕迹(n个=3-5个培养基）。误差线，SEM(F类)TBS诱导树突中BDNF-EGFP点状荧光的平均峰值降低，归一化为TBS前的荧光强度。误差棒，SEM(n个=3-5个培养基*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.005, ***P（P）<0.001（通过单向方差分析和Tukey事后检验）。
复合物下调损害活动依赖性分泌。
为了确定Cpx是否参与内吞BDNF的活性依赖性分泌，我们检测了TBS诱导的Cpx1/2敲除神经元BDNF-QDs的释放。当DIV 5-6海马神经元转染microRNA-based siRNA载体时(35)，siCpx，以及表达PSD95-GFP的载体，我们发现内源性Cpx1/2的免疫染色在13-15 DIV的这些神经元中有效下调，但PSD95-GFP puncta与对照未转染细胞相似(). 在16分钟的观察期内，BDNF-QD释放的总百分比增加了两倍(). 然而，发布位于PSD95-GFP的BDNF-QD+在TBS期间，Cpx击倒神经元的位点减少(). 这种siCpx效应可通过同时共表达siRNA-resistant全长Cpx1（Cpx重量)，但不是通过突变形式的Cpx1（Cpx400万)无法绑定SNARE复合体。这些结果表明，Cpx1是BDNF-QDs在突触后位点活性依赖性胞吐所必需的，但它可以作为一个“钳夹”来阻止对接内体的自发胞吐，这让人想起它在调节突触小泡分泌中的作用(36).
复合物下调减少了刺激诱导的BDNF-QD和BDNF-EGFP在突触后位置的分泌。(A类)用Cpx1/2 siRNA（siCpx）和PSD95-GFP共同转染的代表性培养物中的海马神经元图像。在siCpx转染的神经元（箭头，上部)，但不在同一字段中的未转染细胞中（箭头）。箭头：用PSD95-GFP转染的神经元；箭头：未转染的神经元。（比例尺，20µm）(B类)通过测量神经元的免疫染色强度来定量Cpx表达水平，如A类将相对Cpx蛋白水平标准化为同一图像场中未转染神经元的相对Cpx蛋白水平。误差线，SEM(n个=3种独立文化*P（P）=0.003（成对）t吨测试）。(C)对照组或Cpx下调神经元在标准成像期间释放的BDNF-QD总量的百分比(n个=3个独立实验*P（P）=0.003（成对）t吨测试）。(天)PSD95-GFP每分钟释放BDNF-QD的平均百分比+或PSD95-GFP−转染指定质粒的神经元在TBS之前（蓝色）、期间（红色）和之后（绿色）的位置。误差条，SEM(n个=每种情况下3-4个独立培养基*P（P）<0.01和**P（P）<0.001（学生）t吨测试）。(E类)对照组中TBS诱导的树突中BDNF-EGFP点状平均荧光示踪，siCpx，siCpx+Cpx重量或siCpx+Cpx400万转染神经元(n个=每种培养基3个）。误差线，SEM(F类)TBS诱导树突中BDNF-EGFP点状荧光的平均峰值降低，归一化为TBS前的荧光强度。误差棒，SEM(n个=每种培养基3个*P（P）<0.001（通过单向方差分析和Tukey事后检验）。
为了检测Cpx是否参与内源性合成BDNF的活性诱导分泌，我们用BDNF-EGFP融合蛋白和siCpx转染培养的海马神经元，并检测TBS诱导的12–16 DIV上BDNF-EGFP的释放()表明Cpx抑制树突中BDNF-EGFP的分泌。同时表达siRNA-resistant Cpx1（siCpx+Cpx重量)但不是突变型Cpx400万因此，与Cpx对BDNF-QD胞吐的影响一致，这些结果表明Cpx是分泌内源性合成BDNF所必需的。
讨论
一般认为，含BDNF的高尔基后颗粒的胞吐是提供突触调节BDNF主要途径。在这项研究中，我们发现细胞外BDNF-QDs可以被培养的海马神经元以TrkB依赖的方式内吞(). BDNF量子点的内吞优先定位于树突上的突触后位点，去极化促进了内吞过程(图S3). 以TBS形式对培养物进行重复的细胞外刺激，仅在PSD95时可显著增加内吞BDNF-QDs的释放+突触后位点()这种释放需要激活突触AMPA和NMDA受体(). 在所检测的各种Syt亚型中，我们发现TBS诱导的BDNF-QDs释放仅通过Syt6的过度表达而显著促进()并且仅被Syt6击倒而被抑制(). 有趣的是，Syt6并不调节内源性合成BDNF的活性诱导分泌(). 进一步研究表明，Cpx1/2促进了BDNF-QDs的活性诱导释放()，但抑制了整体非活性BDNF-QD释放()与突触小泡胞吐的结果一致。综上所述，这些结果揭示了在突触提供活性依赖性BDNF分泌的新的内吞途径及其独特的调节机制().
图示兴奋性突触BDNF的分泌、摄取和转运的图表。含有BDNF的高尔基后颗粒是突触分泌BDNF主要来源。分泌的BDNF与TrkB受体的结合导致突触前或突触后神经元将BDNF-TrkB复合物内吞入“信号内体”。突触激活不仅会导致含BDNF颗粒的胞吐，也会导致含内吞BDNF的内体胞吐，这需要激活突触AMPA和NMDA受体。与含有BDNF的高尔基后颗粒的胞吐所需的Syt4不同，Syt6对于含BDNF内体的活性诱导胞吐至关重要。突触后树突内吞的BDNF可能会发生局部胞吐，以便在摄取部位附近再次使用，而轴突末端形成的含BDNF的内体可能会向突触前神经元的体细胞和树突部位进行长距离逆行运输。
BDNF-QD的接收、运输和本地化。
我们使用培养神经元与BDNF-QDs的短暂孵育来诱导BDNF-Qs的内吞摄取，并在清除细胞外BDNF-QAs后16分钟内进行荧光成像。基于BDNF-QDs在所有树突分支中的相对随机分布，以及BDNF-Qs到达胞体后由于长时间中断而导致轴突-树突转运速度较慢，我们推断BDNF-量子点的摄取发生在轴突和树突上。此外，由于与突触后标记物PSD95共定位的大多数BDNF-QD是不动的，因此含有BDNF-QA的内体可能直接在突触后位点或突触外位点形成，但很快被困在突触上。
突触后BDNF的摄取和含BDNF内体的积累与突触调制特别相关。因为含BDNF的内体可能具有生物化学活性(12–15)它们可以在突触后细胞质中发挥BDNF-TrkB信号的长期定位作用。活动内体也可以在突触外区域传播BDNF-TrkB信号。鉴于沿树突观察到的可移动BDNF-QD的小净移位，树突到轴突的转运可能非常有限。另一方面，使用分区多孔培养系统的研究表明，在稍后的时间，在树突中发现了在轴突末端内吞的BDNF-QD(37)表明存在轴突-树突转运。这一发现与BDNF在发育过程中应用的体内研究结果一致爪蟾视顶盖导致双极细胞以轴突运输依赖的方式逆行增强对视网膜神经节细胞的输入(38)TBS在视网膜顶盖突触诱导的LTP表现为BDNF依赖性逆行扩散至双极细胞-视网膜神经节细胞突触(39). 因此，含有BDNF的内体的逆行转运和树突处内体BDNF的分泌提供了一种机制，通过这种机制，神经元输出突触的活性依赖性调节可以在突触前和突触后对树突处的输入突触进行协调调节。
关于BDNF量子点的突触定位，我们发现15.6±1.6%的BDNF量子点位于免疫染色的PSD95+站点()和17.2±1.9%的BDNF-QD与PSD95-GFP putta共定位()与BDNF-QDs培养的神经元短暂孵育（10分钟）后，沿着树突。如果内吞的BDNF-QD沿着树枝晶随机分布，则这些百分比高于预期，因为PSD95-GFP点状物沿树枝晶所占的面积仅为7.8±0.5%(图S3C). 这一发现表明，内吞的BDNF-QDs在树突突触后位置显示出一些优先定位。然而，在用BDNF-QDs延长培养神经元的培养时间（60分钟）的实验中，我们发现只有约9.5%的BDNF-QAs与PSD95-GFP位点共定位(). 这可能是由于内吞BDNF-QDs在1小时内的横向再分配引起的。为了避免光损伤，我们实验中的成像时间保持在30分钟内。这个有限的时间窗口阻止了我们跟踪单个BDNF-QD从内吞到随后活性诱导释放的过程。因此，我们无法直接确定在突触后位点形成的含有BDNF-QD的内体是否会被转运到其他树突部位进行胞吐。
Syt和Cpx的调节功能。
我们的结果表明，TBS促进了BDNF-QDs在PSD95的释放+突触后位点，但对突触外位点的释放没有影响，其中Ca2+突触激活引起的兴奋将在很大程度上消失。在没有外加电刺激的情况下，BDNF-QDs的自发释放可能通过一种融合机制发生，这种融合机制需要Syt亚型对细胞质钙的静息水平起作用2+最近的研究表明，海马神经元神经递质释放的同步和异步阶段分别由Syt1和Syt7通过快速钙离子选择性调节2+-Syt1和钙的缓慢形式促进依赖性释放2+-Syt7介导的触发释放，其功能通常被Syt1阻断(40). 在本例中，类似的双重Syt调节也可能对内胚体BDNF的分泌起作用。然而，仍有可能是由于突触外释放事件的频率较低，使得siRNA的作用无法检测到，所以缺乏对BDNF-QDs突触外释药的siRNA敲除作用。
我们目前的结果表明，下调Cpx1/2后，树突内吞BDNF-QDs的总释放量增加。这种升高可能归因于自发活动非依赖性释放的增加，因为TBS诱导的突触后部位释放大大减少。这一发现与Cpx与SNARE蛋白结合作为钳夹阻止对接小泡自发融合的观点一致(27,36)，为响应活动而拆除夹钳需要钙的作用2+-传感系统(41). 进一步支持Cpx在突触后胞吐中发挥作用的观点来自于发现突触后Cpx调节LTP期间AMPA受体向突触的传递(42). 在本研究中，Syt6是Ca2+专门促进突触后位点含BDNF内体融合的传感器。
Syt6在BDNF-QDs活性诱导释放中的作用与Syt4在BDNF分泌颗粒分泌中的作用相反。在海马神经元和Syt4基因敲除小鼠中，发现Syt4抑制轴突和树突中去极化诱发的BDNF释放(33). 这一结果与我们的发现一致，即Syt4基因敲除增加，过度表达减少了BDNF-EGFP活性诱导的分泌(). 我们的研究还表明，Syt6促进BDNF-QDs的活性诱导释放，但未检测到对BDNF-QAs自发释放的影响，可能是因为自发释放事件的频率较低。此外，Syt6的过度表达和敲除分别提高和消除了TBS诱导的BDNF-QD释放，而不影响TBS诱导BDNF-EGFP的分泌。Syt6和Syt4的不同作用可能归因于这两种蛋白质之间的结构差异。Syt4和Syt6都由位于氨基末端的一个短的囊内序列、一个跨膜区、一个中心连接序列和两个称为C2A和C2B的羧基末端C2-结构域组成(43). 在Syt6中，C2-结构域预计会结合2到3个Ca2+离子通过两个柔性环中的四到五个酸性残基。与Syt6相比，Syt4的C2A结构域缺乏钙所需的典型天冬氨酸残基2+结合，并且C2B结构域不能结合Ca2+尽管它包括所有必需的Ca2+-绑定序列(44). 这些结构差异可能导致Syt与内体、分泌颗粒、SNARE蛋白以及钙的差异性结合2+这两种囊泡对活性诱导的胞吐的敏感性。Ca的进一步表征2+-胞吐过程的依赖性也可能揭示通过这两种不同途径触发BDNF分泌所需的神经元活动模式。
虽然我们已经观察到轴突内吞BDNF-QDs()，总数量远低于枝晶处的数量。因此，我们将注意力集中在树突的BDNF-QD分泌上。利用培养的海马神经元表达荧光标记的BDNF进行的研究表明，BDNF在轴突和树突分泌(45,46). 然而，在突触前致密核小泡中发现了BDNF及其前肽，但在成年小鼠海马突触后树突中没有发现(6)，提示BDNF的一种顺行作用模式。先前的研究表明，突触前或突触后神经元释放的细胞外BDNF可以通过与突触后神经细胞树突上的TrkB受体结合而再循环回突触部位(46,47). 在本研究中，我们进一步表明BDNF可以通过生理相关的TBS在突触后位点内化和释放。事实上，细胞外提供的重组BDNF已被发现在Schaffer侧支CA1突触缺乏突触后合成的情况下促进晚期LTP(16). 因此，除了内源性BDNF分泌颗粒外，含有BDNF的内体还可以作为二级储存位点，用于未来的活动诱导分泌和突触调节。
材料和方法
对于BDNF-QD的延时成像，0.5μL的1μM生物素化BDNF(19)与0.5μL的1μM Qdot655链霉亲和素结合物（Invitrogen）在4℃孵育过夜，形成BDNF-QD复合物。将DIV 12-16海马神经元分别置于含有1或0.2 nM BDNF-QD的2%BSA的细胞外溶液中培养10或60分钟。将装有BDNF-QD细胞的盖玻片转移到含有4μM QSY 21羧酸琥珀酰亚胺酯（QSY21；Invitrogen）的溶液中的场刺激室。使用Micro-Manager控制的14位EMCCD摄像机以0.2 Hz的频率采集时间间隔图像（采集时间，200 ms）(48)或在TBS期间使用NIS-Elements显微镜成像软件（尼康仪器）（12列，间隔5秒，每列由5个5赫兹脉冲组成，每列5个2毫秒脉冲，频率为100赫兹）。采集后，用NIH ImageJ软件处理图像进行观察和分析。
其他有关载体构建、细胞培养、免疫染色、BDNF-QDs制备、电刺激、延时成像和统计分析的详细实验程序包括在SI材料和方法所有动物实验方案均由加州大学伯克利分校动物护理和使用委员会批准。
