星形胶质细胞钙信号转导与癫痫

癫痫是一种复杂的脑部疾病

癫痫是一个多因素神经系统疾病家族，在全球范围内影响着至少5000万人(Ngugi等人，2010年;瑟曼等人，2011年). 癫痫发作是由遗传和后天因素引起的癫痫的临床表现，如创伤、围生期损伤、感染后病变和肿瘤。癫痫发作反映了一种高度同步的神经元放电，这种放电出现在局限的脑部部位，即致痫灶，然后继发性扩散到大脑的大部分(Avoli等人，2002年;杰弗里斯1990;Pinto等人，2005年;Traub和Wong 1982年;Trevelyan等人，2006年). 因此，癫痫可以被视为神经元过度同步的紊乱，从根本上与产生超兴奋性的兴奋性和抑制性活动之间的不平衡有关。为了支持这一观点，在实验动物模型中，反复发作是通过增强兴奋性和/或削弱抑制性活动而诱发的。

在过去十年中，癫痫研究取得了重大进展，我们对可能导致神经元过度兴奋的实验条件有了一定的了解。例如，编码电压门控钠的基因突变⁺，加利福尼亚州²⁺和K⁺通道，以及那些参与抑制性突触传递（Cl⁻通道）与所谓的特发性癫痫相关(McNamara等人，2006年). 鉴于直接调节细胞膜兴奋性的离子通道功能障碍会导致神经元过度兴奋失控，这一观察结果并不令人惊讶。

然而，我们对导致脑组织癫痫的细胞事件的了解在很大程度上并不令人满意。例如，来自特定区域的特定神经元子集是如何以及为什么突然被激活的，并显示出癫痫放电的广泛同步活动？发作事件表现为癫痫发作的细胞相关性，偶尔发生，似乎不可预测。它之前可能会有一系列发作间期放电，但也可能在之前没有任何神经元过度活动的情况下发生。这些观察引出了以下基本问题：触发发作转变从而导致癫痫发作的信号的性质是什么？尽管在这一领域进行了大量的实验研究，但癫痫发生、传播和停止的机制仍不明确。

初步调查结果

钾的细胞外浓度⁺离子（[K⁺]_o（o）)是调节脑网络中神经元兴奋性的重要因素⁺]_o（o）从强烈的神经元放电中衍生出来的放电实际上倾向于去极化神经元细胞并促进癫痫样放电的发展。[K中10–12 mM的峰值⁺]_o（o）在以癫痫疾病为特征的超同步神经元活动中达到，并被认为在黄疸发生中起重要作用(Heinemann等人，1977年;Pedley等人，1976年).

星形胶质细胞作为癫痫发生的调节剂的作用最初是在20多年前提出的，在很长一段时间里，这种作用主要集中在星形胶质细胞缓冲细胞外钾的能力上⁺或神经递质（癫痫发作时过量释放）。K系列⁺主要负责星形胶质细胞K的通道⁺缓冲容量是一类内向整流钾（Kir）通道。已经确定了16种不同的Kir通道亚单位，Kir4.1和Kir2.3是研究最深入的通道(Neusch等人，2006年;Olsen和Sontheimer 2008)). 与其他K不同⁺允许大K的通道⁺从去极化细胞流出的Kir通道具有介导小K的特性⁺去极化细胞流出，超极化电位大量流入。重要的是，Kir4.1通道在静息电位下具有较高的开放概率(Ransom和Sontheimer，1995年)以及与[K成比例的通道电导⁺]_o（o）(纽曼1993;Sakmann和Trube 1984). 这些特征使星形胶质细胞能够清除大量的K⁺从细胞外空间。值得注意的是，Kir4.1通道在不同脑区的星形胶质细胞上表达(Higashi等人，2001年;Ishii等人1997;Li等人，2001年;Poopalasundaram等人，2000年;Takumi等人，1995年)并调节K的大部分⁺这些细胞中的电流(Seifert等人，2009年).

作为[K+]的关键监管机构_o（o）网络兴奋性星形细胞Kir通道可能是癫痫新治疗方法的靶点。然而，尽管过去十年在动物模型和人类癫痫中进行的研究表明，K⁺星形胶质细胞网络中的缓冲易导致神经元超兴奋和癫痫发作(Wallraff等人，2006年)，进一步的研究似乎有必要充分了解细胞外钾的清除是否有缺陷⁺星形胶质细胞是过量钾的主要因素⁺癫痫组织的特征性堆积。

癫痫样活动发生中的神经递质

通过Ca的发现²⁺-依赖性谷氨酸释放的星形胶质细胞可直接兴奋邻近神经元群(Parpura等人，1994年)并有利于突触外N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体激活介导的同步活动(Fellin等人，2004年)最初的观察结果是否暗示钙的作用更直接²⁺-癫痫样活动产生中的依赖性神经递质。这一假设的间接支持来自随后对脑切片和体内说明钙的频率显著增加的制剂²⁺癫痫活动期间星形胶质细胞的振荡(Fellin等人，2006年;Tian等人，2005年)以及抗惊厥药物的减少(Tian等人，2005年). 在颞叶癫痫动物模型中，介导Ca的mGluRs的星形细胞表达²⁺振荡也被发现增加(Aronica等人，2000年;Ulas等人，2000年). 这些数据表明，神经元活动的过度同步性是癫痫放电的特征，这可能至少部分源于星形胶质细胞的过度活动。为了支持星形胶质细胞在癫痫发生中的作用，有报道称，发作性去极化偏移（PDS），即癫痫发作之间记录的发作间期事件的细胞相关性，具有河豚毒素（TTX）抗性，并由星形胶质细胞释放的谷氨酸介导(Tian等人，2005年). 然而，这一结论受到了其他人的质疑(Fellin等人2006;Fellin and Haydon 2005年)世卫组织证明，神经元NMDA受体的星形胶质细胞激活对于发作间期或发作期事件的发生是不必要的，并引发了关于这些胶质细胞在局灶性癫痫发生中的作用的争议(丹布罗西奥2006;Seifert等人，2006年;Wetherington等人，2008年). 在局灶性癫痫切片模型中获得的最新结果表明，星形胶质细胞对局灶性发作样发作性放电而非发作间期放电的产生有贡献(Gomez-Gonzalo等人，2010年). 在这个模型中，我们最近开发了从大鼠和小鼠内嗅皮层（EntCx）获得的薄片制剂(Gomez-Gonzalo等人，2010年;Losi等人，2010年)-通过向含有NMDA的玻璃吸管施加短暂的压力脉冲，随后的两次NMDA刺激在一小群V-VI层神经元中触发了强烈的活动。在4-氨基吡啶（4-AP，50–100μM）存在下(佩雷奥和阿沃利1989;Perreault和Avoli，1991年;Rutecki等人，1987年)和0.5 mM Mg²⁺，双NMDA刺激可靠地诱发局灶性发作放电。值得注意的是，经常观察到单一NMDA刺激无效。因为在这个模型中，我们预先知道局灶性癫痫发作的时间和地点(Gomez-Gonzalo等人，2010年;Losi等人，2010年)，我们有独特的机会研究早期在病灶部位发生的细胞事件，并使神经元在那里产生癫痫放电。我们发现，在双重而非单一NMDA刺激后，大量星形胶质细胞显示出大量对TTX敏感的钙²⁺发作性分泌物开始前升高²⁺星形胶质细胞的升高不仅仅是神经元活动的结果，它在局灶性发作放电的产生中起到了致病作用。确实，在Ca之后²⁺BAPTA（通过用含有BAPTA的移液管修补单个星形胶质细胞而引入星形胶质细胞合胞体）抑制了发作性放电产生部位星形胶质细胞的升高，双NMDA刺激诱导的神经元过度活动发作未能产生发作性放电。在BAPTA存在的情况下，双NMDA脉冲的招募神经元数量显著低于对照组(Gomez-Gonzalo等人，2010年)这表明，当一组神经元的过度活动发作，如双NMDA脉冲刺激的过度活动发作，持续与附近的星形胶质细胞接触时，反馈信号，即Ca²⁺-谷氨酸和/或D-丝氨酸的依赖性释放产生，导致大量神经元被招募到一个连贯的同步活动中。如果这种反馈信号作用于易于癫痫发作的脑网络，那么在我们的切片模型中，这种情况是通过降低细胞外镁含量而建立的²⁺应用4-AP或苦毒毒素，有助于将神经元推向发作放电阈值(Gomez-Gonzalo等人，2010年;Losi等人，2010年). 因此，起始位点不仅由NMDA激活的神经元代表，还由涉及星形胶质细胞的募集过程中二次激活的神经元表示。与这一观点一致，研究还发现，当NMDA脉冲与TFLLR选择性刺激星形胶质细胞共同应用时，单个NMDA脉冲（反复未能激活发作放电）变得有效(Gomez-Gonzalo等人，2010年). 据报道，这种肽在星形胶质细胞中触发钙²⁺通过激活凝血酶蛋白酶激活受体-1（PAR-1）升高和谷氨酸释放(Gomez-Gonzalo等人，2010年;Lee等人，2007年;Shigetomi等人，2008年). 值得注意的是，在啮齿动物和人脑中，PAR-1受体存在于某些特定的神经元群体中，例如海马颗粒细胞，但在星形胶质细胞中显著表达(Junge等人，2004年). 然而，在啮齿类动物CA1海马区和EntCx中，尚未获得神经元中存在PAR-1受体的功能证据(Gomez-Gonzalo等人，2010年;Lee等人，2007年)免疫细胞化学实验结果显示，在大鼠中，EntCx PAR-1受体的表达仅限于星形胶质细胞(Gomez-Gonzalo等人，2010年). 因此，PAR-1特异性激活剂TFLLR可以合理地用于这些区域以刺激钙²⁺星形胶质细胞选择性升高。

我们发现，NMDA/TFLLR联合应用激活的神经元数量明显高于NMDA单独激活的神经元，这与限制性脑部位的临界神经元数量需要被强烈激活以产生发作性放电的观点一致。最有趣的是，我们还发现，当星形胶质细胞的贡献因抑制Ca而减少时²⁺与BAPTA实验一样，这些细胞中的信号可以通过三次而不是两次NMDA脉冲应用来恢复发作性放电(Gomez-Gonzalo等人，2010年). 对后一个观察结果的合理解释是，连续三次NMDA刺激直接激活了大量神经元，并诱发了足以产生癫痫样放电的相关神经元活动水平，绕过了星形胶质细胞在募集过程中的作用。如果根据其他实验中获得的结果来解释这一单一结果，则可能的结论是，星形胶质细胞的贡献并不是绝对必要的，但它对发作性放电的产生可能很重要。相反，如果将三个NMDA脉冲的实验结果与所有其他结果分开解释，唯一可能但最终错误的结论是星形胶质细胞在癫痫发作中没有作用。这些观察结果强调了在得出星形胶质细胞如何对大脑网络的显著复杂性作出贡献之前，全面评估神经-星形胶质细胞相互信号传递的重要性。ATP-介导的Ca是星形胶质细胞的另一个可能有助于控制癫痫传播的集体属性²⁺波在星形胶质细胞网络中传播。与这一假设相一致，最近的一项研究提供了证据表明，局部Ca²⁺细胞外间隙减少引起钙²⁺通过连接蛋白43半通道释放ATP介导星形胶质细胞中的波(Torres等人，2012年). 最有趣的是，这种星形细胞ATP通过作用于海马中间神经元亚群中表达的P2Y1受体来增强抑制传递(Torres等人，2012年). 考虑到在癫痫发作期间细胞外钙释放²⁺星形细胞ATP的释放可能会增强抑制传递，从而作为抗惊厥反馈机制，阻止癫痫发作的传播。

星形胶质细胞在癫痫发作中的复杂作用如图所示图1该图由不同高度的条组成，这些条表示在星形胶质细胞贡献不存在（左侧，灰色条）或存在（右侧，黑白条）的情况下，在不同NMDA刺激强度下激活的神经元的质量。在两种不同的实验模型中，即苦毒毒素模型和4-AP模型（均使用低细胞外镁²⁺)也会报告（虚线）。苦毒毒素模型可以被视为具有低阈值癫痫放电的模型，正如该模型中自发发生的反复癫痫放电所表明的那样。4-AP模型可以被视为高阈值模型，实际上，它缺乏自发癫痫活动。在BAPTA实验中，星形胶质细胞Ca²⁺选择性阻断抬高，单次NMDA脉冲触发苦毒毒素的发作性放电，但在4-AP模型中没有。在后一种高阈值模型中，三个脉冲可以诱发发作性放电，但两个NMDA脉冲（巴a、 b、c). 图右侧的条形图显示了星形胶质细胞对发作放电产生的贡献，这是在没有BAPTA的实验中评估的。单次NMDA脉冲未能激活显著的星形胶质细胞反应。因此，与在BAPTA实验中观察到的结果相比，它的效果没有变化，它在低阈值模型中导致了发作性放电，但在高阈值模型中没有引起发作性放电（bard日). 相反，在双NMDA脉冲作用下，星形胶质细胞被大量激活，并将其信号传导回神经元（白色条带和条带中的弯曲箭头e（电子）)严重增加了神经元的整体激活。在这些条件下，高阈值模型也达到了发作放电阈值。当单一NMDA应用（无效就其本身而言)与TFLLR介导的星形胶质细胞活化（bar（f）)，同时刺激星形胶质细胞单独地仅在低阈值模型（bar）中有效诱发发作性放电克).

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图1

星形胶质细胞钙缺乏和存在时发作性放电的产生²⁺两种不同的局灶性癫痫切片模型的高度。

灰条，神经元在没有星形胶质细胞贡献的情况下通过一个、两个或三个NMDA脉冲刺激激活（BAPTA实验）；黑-白条，由一个或两个NMDA脉冲刺激激活的神经元（黑条）和星形胶质细胞成分（白条）。这里的曲线箭头用于说明星形胶质细胞信号，它可以显著增强神经元的激活。虚线表示4-AP/低镁的冲击放电阈值²⁺和苦毒毒素/低镁²⁺模型。

总之，当临界数量的神经元进入非常强烈的活动阶段时，就达到了产生局灶性发作放电的阈值。通过放大同步活动神经元的招募，星形胶质细胞对设定发作性放电产生阈值至关重要。然而，它们的贡献可能因神经元的一般兴奋性水平而异，通过使用包含神经元过度刺激的协议，至少在实验上可以绕过它。这方面的一个典型例子是通过非常强烈的神经元刺激（即三NMDA脉冲刺激，图1，巴c（c）)在实验中，由于BAPTA阻断了星形胶质细胞的激活，双NMDA脉冲未能引起发作性放电(Gomez-Gonzalo等人，2010年). 显然，为了揭示星形胶质细胞对癫痫活动的贡献，需要准确地确定实验条件。当评估星形胶质细胞对突触可塑性变化的贡献时，如长时程增强（LTP），同样需要考虑。我们的结果表明，星形胶质细胞对多种不同LTP形式的产生的贡献表现为额外的复杂性这只能通过精心设计的实验来理解。事实上，类似于三个NMDA脉冲实验产生的发作性放电（其中星形胶质细胞的作用可能无关），如果系统因过度刺激突触传递而“饱和”，那么调节突触强度的所有细微影响都将变得无关。与此结论一致，在水通道蛋白-4基因敲除小鼠中，通过θ波刺激诱发的LTP显著降低，而高频刺激诱发的LTP不受影响(Skucas等人，2011年). 鉴于水孔蛋白-4通道主要在星形胶质细胞中表达，并在那里与Kir 4.1和Kir 5.1通道进行功能性耦合，这些结果进一步支持了上述结论，并加强了关于调节作用突触传递中的星形胶质细胞。

本次审查中所述的原始工作得到了欧盟卫生组织F2-2007-202167、意大利Telethon和Cariparo基金会对GC的支持，以及对PGH的拨款R01 NS037585和R01 NS043142。