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乳腺癌研究。2015; 17(1): 101.
2015年8月5日在线发布。 数字对象标识：10.1186/s13058-015-0621-0
预防性维修识别码：PMC4531540型
PMID：26243145

人类乳腺癌细胞将巨噬细胞培养为M2激活状态

索菲亚·索萨,通讯作者 雷吉斯·布里恩, Minnamaija Lintune公司, 保丽娜·克伦奎斯特, Jouko Sandholm公司, 朱卡·蒙科宁, 皮尔科·利萨·凯洛昆普·莱赫蒂宁, 苏珊娜·劳蒂亚, 奥利·泰宁宁, 海基·琼苏, 多米尼克·海曼,和Jorma A.Määttä
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

介绍

免疫系统在癌症进展中起着重要作用。在实体肿瘤中，5-40%的肿瘤由肿瘤相关巨噬细胞（TAM）组成，根据肿瘤类型，TAM的数量通常与不良预后相关。TAM通常类似于M2巨噬细胞。与具有促炎和抗癌功能的M1巨噬细胞不同，M2巨噬细胞具有免疫抑制作用，有助于基质重塑，因此有利于肿瘤生长。TAM在乳腺癌进展中的作用尚不完全清楚。

方法

通过免疫组织化学和自动图像分析算法对一大组人类原发性乳腺肿瘤（562个组织芯片样本）的巨噬细胞浸润（CD68）和活化状态（HLA-DRIIα，CD163）进行评估。使用Kaplan-Meier生命表方法和Cox多元比例风险模型比较各组之间的生存率。通过以下方法评估乳腺癌细胞的巨噬细胞教育体外在存在或不存在乳腺癌细胞条件培养基（MDA-MB231、MCF-7或T47D细胞系）和M1或M2诱导细胞因子（分别为IFN-γ、IL-4和IL-10）的情况下，外周血单个核细胞（PBMC）的分化。通过流式细胞术（CD14、CD16、CD64、CD86、CD200R和CD163）、ELISA（IL-6、IL-8、IL-10、单核细胞集落刺激因子M-CSF）和酶学（基质金属蛋白酶9、MMP-9）分析获得的巨噬细胞。

结果

临床上，我们发现大量CD163+M2-巨噬细胞与快速增殖、低分化、雌激素受体阴性和组织学导管类型密切相关(第页<0.001）。我们展示了体外乳腺癌细胞分泌因子调节巨噬细胞向M2表型分化。此外，更具侵袭性的间充质样细胞系MDA-MB231分泌高水平的M-CSF，使巨噬细胞倾向于免疫抑制性更强的M2c亚型。

结论

本研究表明，人类乳腺癌细胞影响巨噬细胞分化，TAM分化状态与无复发生存率相关，因此进一步强调TAM同样会影响治疗效果和患者预后。

电子辅助材料

本文的在线版本（doi:10.1186/s13058-015-0621-0）包含对授权用户可用的补充材料。

介绍

转移通常用“种子和土壤”理论来解释。从概念上讲，这意味着癌细胞（种子）经历上皮到间充质的转变（EMT），侵入血管，成为循环肿瘤细胞（CTC），迁移、渗出，经历间充质到上皮的转变，并最终作为播散性肿瘤细胞（DTC）在远处定植。”“土壤”与肿瘤微环境元素有关，这些元素有助于这些过程，使遥远的位置允许CTC或DTC定植[1].

免疫系统是癌细胞/肿瘤微环境串扰的主要参与者。在实体肿瘤中，5-40%的肿瘤由肿瘤相关巨噬细胞（TAM）组成。该领域大约80%的出版物报告了TAM与预后不良之间的关系[2,三]. 在人类中，巨噬细胞极化是一个连续体，跨越从经典激活的M1巨噬细胞到交替激活的M2巨噬细胞的两个极端。M1巨噬细胞来源于干扰素γ（IFN-γ）或脂多糖（LPS）刺激，并分泌炎性细胞因子（如IL-6、IL-12、活性氧（ROS）、活性氮（RN）和TNF-α）。经验证的人类M1巨噬细胞的表面标志物包括高水平的CD14和CD16、CD64、CD86和HLA-DRα[4,5]. M2巨噬细胞，可进一步分为M2a、M2b和M2c巨噬细胞。M2a巨噬细胞由IL-4或IL-13刺激产生，并释放基质重塑细胞因子。CD200R和CD86的高表达是M2a巨噬细胞的有效表型标记[4,5]. M2b巨噬细胞是免疫复合物与IL-1β或LPS刺激相结合识别的结果，与M2a巨噬细胞一样，它们参与伤口愈合。免疫抑制性M2c-巨噬细胞是IL-10、TGF-β（转化生长因子β）、糖皮质激素或免疫复合物丰富环境的产物。M2c巨噬细胞进一步产生IL-10和基质重塑因子，如基质金属蛋白酶（MMPs）[4,5]. CD163表达升高是M2c极化的有效标记[5].

TAM是由肿瘤细胞招募和培养的巨噬细胞群，因此暴露于IL-10、TGF-β、M-CSF（单核细胞集落刺激因子）[6]和其他免疫抑制刺激[7]，与M2型关系更密切[8]. 在肿瘤微环境中，TAM将优先执行营养和免疫抑制任务，而不是免疫效应器任务[三,9,10]. 因此，TAM促进上皮生长和侵袭，这是发育和癌症的共同特征[三,9]. Wickoff等人已经证明，乳腺肿瘤在TAM和癌细胞之间存在旁分泌环。TAM表达单核细胞集落刺激因子受体（M-CSFR，也称为CSF-1R或cFMS），该受体结合癌细胞分泌的单核细胞聚集刺激因子（M-CSF，也称为CFF-1）。相反，TAMs分泌表皮生长因子（EGF）并激活癌细胞上的EGF受体（EGFR）。这允许两种细胞类型的共同迁移，从而增强运动能力，并随后入侵健康的周围组织和静脉注射[11,12]. 此外，乳腺癌细胞白细胞受体、血管细胞粘附分子1（VCAM1）与TAMα4整合素结合也解释了VCAM1存活率增加的原因+富含白细胞环境中的肿瘤细胞[13].

就像它们的表型和与肿瘤细胞的相互作用一样，TAM相对于缺氧区域的位置是控制肿瘤生长的关键参数。除了参与癌细胞侵袭的血管周围TAM外[11,12]，TAM也被招募到缺氧区域[14]. 在这些无血管区域内，TAM改变其基因表达谱，有利于肿瘤前M2表型[15]. 这可以解释为什么在早期阶段[16]肺癌[17]，冒号[18]和胃[19]正常氧环境中的巨噬细胞表现为M1表型，预后良好。

乳腺癌免疫组织病理学研究的样本数量有限（分别为53和120个），显示浸润巨噬细胞数量逐渐增加（CD68+)从正常乳腺组织到良性增生性乳腺疾病、导管原位癌（DCIS）和浸润性导管癌[20,21]. 两项较大的研究（分别为1322和168）证实CD68+巨噬细胞与较高的肿瘤分级、雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）阴性、人上皮生长因子受体2（HER-2）阳性和基础表型相关，但导致CD68表达不是独立的预后因素的结论[22,23]. 另一项乳腺癌队列研究（n=144），观察巨噬细胞总数（CD68）+)和M2巨噬细胞（CD163+)发现CD163也与其他预后标志物相关[24]. 它表明CD68+肿瘤间质中的细胞而非肿瘤巢中的细胞是肿瘤特异性生存率降低的独立预后因素，说明肿瘤中TAM的定位不仅仅是其存在。三阴性/基底样乳腺肿瘤间质CD163表达增加+和CD68+细胞和相对于CD68更高比例的CD163。这表明成熟的M2巨噬细胞和可能不成熟的髓源性细胞（MDC，以及CD163）占优势+)在三阴性疾病中[24].

一些临床研究发现乳腺癌中巨噬细胞浸润与血管生成之间存在关联[22,25–28]. 然而，就预后而言，一致认为需要对巨噬细胞亚群进行更大规模的研究。本研究旨在填补这一空白。我们着眼于一大组乳腺癌患者（n=562）样本中M1和M2标记物的表达，寻找与肿瘤进展的可能关联。此外，通过研究乳腺癌条件培养基（CM）存在下人类巨噬细胞的体外分化，我们旨在发现TAM教育的可能机制。为了实现这些目标，我们重新审视了来自一个大队列的组织微阵列[29]不同亚型、级别和侵袭性的早期人类乳腺肿瘤，并使用不同的乳腺癌细胞系。

方法

人体样本

TMA样本（FinXX研究1199名患者中的562名，NCT00114816[29])进行了回顾性研究。亚队列的临床病理特征如表所示1使用福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤样本进行TMA。使用1.0 mm的组织圆柱体通过每个供者肿瘤块的组织学代表区域制作肿瘤块。从每个供体块中，切割2-4个核心，制备15个TMA块，每个块包含61-84个肿瘤样本和2-3个肝脏样本作为阳性对照。

表1

患者人口统计和相关临床特征

因子整个系列CD68型一 P（P） b条 CD163型一 P（P） b条 HLA-Drα一 P（P） b条
≤369>369≤167.5>167.5≤107>107
n=562个n=277n=274n=270n=267n=280n=275
年龄，年
≤502139511310598112100
>503491821610.0931651690.6021681750.378
肿瘤大小中位数
≤22毫米283144132137129140138
>22毫米2781321420.3481321380.5451391371
不适用。1
节点状态
第0页65273728333728
第N页+4972502370.1692422340.4682432470.267
组织学类型
管道399181211171213204192
小叶的110664369334760
其他5330200.0103021<0.00129230.274
组织学分级
1级46331326162025
2级26413811915397127132
3级2501061400.00191152<0.0011311180.518
不适用。2
ER状态
积极的405215181214171191207
否定15762930.0035696<0.00189680.065
HER-2状态
积极的170858372939377
否定3921921910.9201981740.0401871980.183
生物组
ER+，HER-2−314165142173123139168
ER+、HER2+91503941485239
ER-、HER2+79354431454138
ER-，HER2−7827490.0152551<0.00148300.032
基辅67
≤20 %27114911615896124140
>20 %2421041340.00592144<0.0011261160.252
不适用。49

结果以患者人数表示。一所使用的截止值对应于整个序列中阳性细胞数量的中值。b条缺口试验。急诊室雌激素受体，HER-2型人表皮生长因子受体2，不适用。无法使用的

免疫组织化学分析

使用标准免疫组织化学技术对TMA块的切片（4-μm）进行染色，以检测CD68（抗SA2抗体克隆3C6，Abcam，英国剑桥）、CD163（克隆10D6，Novocastra，纽卡斯尔，英国）和HLA-DRα（Dako，Glostrup，丹麦）的表达[30,31]（附加文件中提供了详细信息1). 使用配备Dotslide的奥林巴斯虚拟显微镜，使用10倍物镜（德国慕尼黑奥林巴斯BX51奥林巴斯）和AxioCam相机（德国耶拿蔡司）对所有染色的TMA载玻片进行扫描。阳性染色细胞使用斐济1.48s型设备进行计数（Wayne Rasband，NIH）。苏木精和3,3'-二氨基联苯胺（DAB）的颜色反褶积后，设置巨噬细胞可视化阈值。仔细选择颗粒分析的尺寸限制，仅包括巨噬细胞。分析中排除了损坏的样品。数据以双盲方式进行分析。在分析/评分巨噬细胞含量和分化状态时，研究人员对每个样本的身份和临床病理特征一无所知。每个标记、每个样本的最终阳性细胞数被传递给对队列进行统计分析的假设研究者。

细胞培养

人类乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB231和T47D来自美国类型培养物收集中心（ATCC），在罗斯维尔公园纪念研究所（RPMI）-1640培养基（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）中培养，补充10%胎牛血清（FBS）（美国纽约州格兰德岛Gibco）以及100 IU/ml青霉素和链霉素（荷兰布利斯维克Gibco），37°C，5%CO2大气。在达到汇合点后，将细胞培养基换成只含1%FBS的培养基，并保持培养72小时。在培养期结束时，从每种细胞类型的至少三个独立细胞系批次中收集CM。将CM在2800 g下离心5分钟，在−20°C下进行校准和冷冻。CM被用作50%的巨噬细胞分化培养基补充物和10%的FBS。细胞系最近由一家认证的细胞系认证服务机构（英国伦敦费希尔科学公司DDC Medical）通过STR（短串联重复序列）分析鉴定。通过培养细胞的4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色常规检测支原体。

外周血单个核细胞（PBMC）分离

通过Ficoll梯度离心分离五个不同供体的PBMC（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）。CD14型+用α-CD14微球对细胞进行磁性标记，并通过MACS技术进行阳性筛选（德国科隆Miltenyi Biotec）。

巨噬细胞分化

为了获得M1、M2a和M2c巨噬细胞，CD14+单核细胞在MEM（瑞士巴塞尔Lonza）中培养5天，补充10%FBS（美国纽约州大岛Gibco）（对照组，CTR）、IFN-γ（50 ng/ml；M1）或IL-4（50 ng/ml；M2a）或IL-10（50 ng/ml；M2c），第3天更换一半培养基[32]. 为了评估乳腺癌细胞系分泌因子的作用，在存在或不存在来自MDA-MB231、MCF-7或T47D细胞的50%CM的情况下进行相同的分化方案。对于激活状态实验（ELISA），用LPS（10 ng/ml，Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA）处理细胞一天。除非另有说明，所有使用的细胞因子均来自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国）。收集上清液，在2800 g下离心5分钟，校准并储存在−20°C下，直到进一步分析。用Accutase（Invitrogen，Paisley，UK）采集细胞，通过离心（5分钟，400 g）去除碎片，并使用细胞进行流式细胞术分析。上清液用于ELISA和酶谱分析。

流式细胞术

通过验证的流式细胞术方法分析体外极化巨噬细胞[5]，使用BD LSR II流式细胞仪（BD Biosciences，Erembodegem-Dorp，比利时）。简而言之，用PBS 0.1%BSA（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）清洗细胞，在染色之前，用FcR阻断剂（BD Biosciences，Erembodegem-Dorp，比利时）阻断Fc受体：0.2×106在分析之前，用足够的抗体混合物培养细胞并清洗。使用以下荧光染料标记的单克隆抗体通过流式细胞术分析表面标记物表达：CD14-APC-Cy7（克隆61D3；eBioscience，法国巴黎）、CD16-PE-Cy7（克隆DJ130c；AbD Serotec，Kidlington，UK）、CD64-AF488（克隆10.1；BioLegend，San Diego，CA，USA）、CD200R-PE（克隆OX108；AbD Serotec，Kidlington，UK），CD163-AF647（克隆GHI/61；BD Pharmingen，Erembodegem-Dorp，比利时）和CD86-AF488（克隆IT2.2，BD Pharmingen，Erempodegem-Dorp，Belgium）。等量的同种匹配对照抗体和未染色细胞作为阴性对照和自体荧光对照纳入所有实验。在FSC/SSC图中对髓系人群进行门控后，使用BD-FACSDiva软件对数据进行分析。数值表示为相关标记的中值荧光强度（MedFI）与未染色细胞的MedFI的百分比比值。

酶联免疫吸附试验

根据制造商的说明（研发系统），在ELISA中使用LPS激活的巨噬细胞培养上清定量h-IL-10、h-IL-8和h-IL-6。h-M-CSF在乳腺癌细胞系CM中定量（Duo-set，R&D systems，Minneapolis，MN，USA）。

酶谱学

如前所述，通过酶谱法测定获得的巨噬细胞上清液中MMPs的潜在蛋白水解活性[33]. 用Image Quant RT ECL成像仪观察染色的聚丙烯酰胺凝胶。使用斐济1.48s型设备（美国国家卫生研究院Wayne Rasband）对与前MMP-9活性（92 kDa）相对应的谱带进行密度测定。给出的值是与等效背景区密度相比，归一化为相应细胞总裂解物的总蛋白含量的前MMP-9消化带的光密度。

统计

使用SAS 8.2 for Windows（SAS Institute，Cary，NC，USA）对TMA结果进行分析，使用整个序列中阳性细胞数的中值作为截止值。频率表使用chi-square（χ2)测试。使用Kaplan-Meier生命表方法和Cox多元比例风险模型比较各组之间的生存率。使用对数秩检验来确认分析的稳健性。进行亚组分析，包括巨噬细胞标记物、亚组变量及其在Cox模型中的相互作用。适当时采用曼希特尼或克鲁斯卡尔·沃利斯试验。全部P（P）值是双面的，不会针对多次测试进行调整。除非另有说明，否则实验数据表示为中位数±SD。使用GraphPad Prism软件，采用Kruskal-Wallis检验和Dunn的事后检验来计算CTR和各种条件之间的统计显著差异。

研究批准

芬兰社会事务和卫生部批准将FinXX研究的组织用于研究目的。赫尔辛基大学中心医院（芬兰赫尔辛基）的伦理委员会批准了FinXX研究和当前研究（2015年3月3日HUS 35/13号许可）。南特大学医院伦理委员会批准使用健康献血者的外周血。样品是在知情同意的情况下从Français du Sang实验室获得的（协议参考NTS 2000-24，Avenant n°10）。

在线补充材料

补充表（附加文件1)和补充图（附加文件2,三,4,5和6)在线提供。

结果

乳腺癌患者TAM数及分化状态的临床意义

为了探讨乳腺癌患者TAM分化的临床相关性，我们在一个大型人类乳腺癌TMA队列中评估了总TAM数（CD68）、M1TAM（HLA-DRα）和M2TAM（CD163）。不同巨噬细胞标记物的表达水平在患者之间存在异质性（图1). M2巨噬细胞数量，确定为CD163的数量+细胞，与快速增殖（Ki67阳性>20%）、低分化（3级）、ER阴性和组织学导管类型密切相关（表2). 单个标记物（CD68、HLA-DRα或CD163）本身均与预后、无复发生存率（RFS）或总生存率（附加文件2). 在RFS的多变量Cox模型中，Ki67阳性率>20%、淋巴结阳性和原发肿瘤大小>22 mm等标记物是显著的预测因素(第页肿瘤大小<0.001，其他因素<0.01）。在同一模型中，CD163是一个重要因素(第页=0.011）以及其他模型协变量，如ER负性（表三).

保存图片、插图等的外部文件。对象名为13058_2015_621_Fig1_HTML.jpg

组织芯片（TMA）染色的代表性图像显示患者间异质性巨噬细胞标记物表达水平。CD68型(一-d日)，HLA-DRIIα(e（电子）-小时)和CD163(我-我). 患者核心概述(一,c（c）,e（电子）,克,我,k、，比例尺200μm）和选定区域的详细视图(b条,d日,（f）,小时,j个,我，标尺50μm）。物镜放大倍数×10

表2

CD68型+和CD163+细胞数中值及相关临床特征

因子N=551个CD68型+中位数（范围） P（P） 一 N=537CD163型+中位数（范围） P（P） 一
组织学类型
管道392418(0–3634)384208(2–1772)
小叶的109249(1–3113)102106(3–802)
其他50265(0–1397)<0.00151127(4–1359)<0.001
组织学分级
1级46240(18–3113)42125(5–524)
2级257337(0–3634)250115(2–1229)
3级246436(0–2595)<0.001243265(3–1772)<0.001
不适用。22
ER状态
积极的396340(0–3634)385131(2–1772)
否定155435(0–2595)0.006152268(6–1743)<0.001
HER-2状态
积极的168363(9–2673)165221(2–1772)
否定383369(0–3634)0.900372148(3–1359)0.002
生物组
ER+、HER-2−307334(0–3634)296124(3–1359)
ER+、HER-2+89343(12–2673)89200(2–1772)
ER-、HER-2+79424(9–1306.5)76227(7–1743)
ER-、HER-2−76484(0–2595)0.02376289(6–1111)<0.001
基辅67
≤20 %265318(0–3634)254115(2–1772)
>20 %238431(0–2794)0.002236263(3–1743)<0.001
不适用。4847

一Mann-Whitney或Kruskal-Wallis测试。急诊室雌激素受体，HER-2型人表皮生长因子受体2，不适用。无法使用的

表3

年无复发生存期Cox多变量模型中的独立预后因素

变量回归系数标准误差回归系数/标准差 χ 2 P（P） Exp（系数）95%置信区间
下部上部
急诊室+ −0.6120.252−2.4305.9030.01510.5420.3310.888
HER-2型+ 0.0500.2390.2110.0450.83261.0520.6591.679
Ki67>20%−0.7110.269−2.6426.9810.00820.4910.2900.832
节点阳性−1.0960.394−2.7807.7300.00540.3340.1540.724
尺寸>22 mm−0.8650.237−3.65713.3720.00030.4210.2650.669
组织学等级3−0.0710.268−0.2660.0710.78990.9310.5501.575
CD163>167.50.5800.2292.5316.4080.01141.7861.1402.798

急诊室雌激素受体，HER-2型人表皮生长因子受体2，系数回归系数，χ 2方形，Exp（系数）危险比

人乳腺癌细胞体外诱导人巨噬细胞分化和活化

作为概念证明，我们证明了分离的CD14+利用IFN-γ、IL-4和IL-10，细胞可分别分化为M1（高CD64，高IL-6分泌）、M2a（高CD200R和CD86，低IL-6和高IL-8分泌）和M2c巨噬细胞（高CD163，低IL-6和高IL-10分泌[34]体外可塑性（图2,​,3三和​和44和其他文件三). 考虑到在IFN-γ存在的情况下M1的分化，没有一种CM影响M1表面标志物的表达水平（附加文件4)也不是分泌曲线（数据未显示）。

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CD14的流式细胞术分析+细胞在50%条件培养基（CM）中分化5天。一-e（电子）荧光强度中值的百分比变化(MedFI公司)CD14、CD16、CD86、CD200R和CD163与对照组的比较(CTR公司)，n=5。（f）单核细胞集落刺激因子(M-CSF公司)乳腺癌细胞系CM的蛋白质水平（n=3）。克-我CD14的流式细胞术分析+在有或无50%乳腺癌细胞系CM的情况下，细胞在IL-10存在下分化5天。CD14、CD16和CD163的MedFI与CTR（仅IL-10）相比的变异百分比。误差线表示+SD，n=5*第页<0.05, **第页<0.005（Kruskal-Wallis分析后进行Dunn事后检验）。MB231型，MDA-MB231厘米

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脂多糖（LPS）刺激24小时后细胞因子分泌情况。一-c（c）CD14型+使用或不使用50%乳腺癌细胞系条件培养基（CM）分化5天的细胞(d日-f）在IL-4的存在下(克-我)在IL-10的存在下。一-我所有结果均为三个实验重复和两个生物重复的平均值。j个代表性基质金属蛋白酶-9酶谱凝胶(k个)相对MMP-9活性，表示为归一化为等效背景面积光密度的消化带光密度。误差线表示+SD，n=3*第页<0.05, **第页<0.005, ***第页<0.0005（Kruskal-Wallis分析，Dunn分析事后（post-hoc）测试）。MB231型，MDA-MB231 CM；NT，非处理

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CD14的流式细胞术分析+细胞在有或无50%条件培养基（CM）的IL-4存在下分化5天。一CD14型洛CD16型洛和CD14你好CD16型你好亚群分布。b条,d日,（f）,小时,j个CD14、CD16、CD163、CD200R和CD86中值荧光强度的总体百分比变化(MedFI公司)，与对照组相比(CTR公司)（仅IL-4）(c（c）,e（电子）,克,我,k个)CD14 CD16、CD163、CD200R和CD86 MedFI在CD14亚群中的变异百分比洛CD16型洛和CD14你好CD16型你好.误差线表示+SD，n=5*第页<0.05, **第页<0.005, ***第页<0.0005（Kruskal-Wallis分析和Dunn的事后检验）。MB231型，MDA-MB231厘米

CD14型+仅在MDA-MB231 CM存在下分化的细胞产生M2巨噬细胞群（图2a个-​-e） 。e（电子）). 这一结果在CD86、CD200R和CD163表达水平方面最为明显（图2厘米-​-e） ●●●●。e（电子）). 只有在其他CM存在的情况下，分化才能保留对照表型特征（图2a个-​-e（电子）e（电子）和其他文件三).

在MDA-MB231 CM存在下分化的巨噬细胞产生较高数量的IL-6、IL-8、IL-10（图3a年-​-c）c（c）)和MMP-9（图第3节-​-k）k个)而不是CTR或其他CM。当细胞同时接受IL-4治疗时，这种情况仍然成立（图三维-​-f）（f）)或IL-10（图3克-​-i） ，我)除后一种治疗中IL-6分泌外（图3克).

MDA-MB231细胞分泌大量M-CSF，使巨噬细胞偏向M2c样表型

MDA-MB231细胞的强大作用使我们检查了所有CM中不同分泌的巨噬细胞分化因子。我们在IL-10、转化生长因子（TGF）-β或IL-4方面没有发现差异（数据未显示），但只有MDA-MB231细胞分泌大量M-CSF（图2英尺).

CD14型+在IL-10和MDA-MB231或T47D CM的存在下分化的细胞（图2克-​-我我和其他文件5)与仅用IL-10分化的细胞相比，CD14表达水平降低（CTR，图2克). MDA-MB231 CM显著增加CD163表达水平（图第2页). 经IL-10和MDA-MB231 CM处理的巨噬细胞比经CTR IL-10处理的巨噬细胞分泌更多的IL-8、IL-10和MMP-9（图3克-​-kk个).

人类乳腺癌细胞影响M2a巨噬细胞分化，使巨噬细胞呈现混合M2a/M2c表型

当暴露于IL-4时，在所有条件下都会出现两个主要的巨噬细胞亚群：CD14洛/第16号洛和CD14你好/CD16型你好（图4). 在存在乳腺癌细胞系CM的情况下，每个亚群的相对百分比都发生了变化。取代CD14的主导地位洛/第16号洛人口（CTR，图第4页)，CD14的优势出现了统计上显著的逆转你好/CD16型你好人口（图第4页)尤其是在MDA-MB231存在的情况下(第页<0.0005）或T47D CM(第页<0.05). MCF-7 CM显示出相同的趋势，即两个亚群之间达到平衡，与CTR中的亚群分布（仅IL-4）没有显著的统计学差异。对这些亚群的表面标记的详细分析表明，MDA-MB231和T47D CM增加CD14（图4b个)并降低CD86的整体表达（图第4节). MDA-MB231 CM增加CD16（图第4天)，CD163（图第4页)和CD200R表达（图4小时). 这些波动主要是由于CD14你好/CD16型你好人口（图4c类,​，e，e（电子）,​，克，克,​，我，我,​，k）k个)结果对整体表达具有统计学意义（图4b个,​，d中，d日,​、f、，（f）,​，小时，小时,​，j；j个;第页<0.05). 尽管没有统计学意义，但MCF-7 CM诱导的趋势与T47D CM相同（图第4页-​-kk个).

只有MDA-MB231 CM影响细胞因子和MMP-9的分泌，反映了该细胞系的特殊性（图三维-​-f、，（f）,​、j、，j个,​，k）。k个). MDA-MB231 CM在IL-4条件下增加了IL-10分泌（图第3页)IL-6、IL-8升高（图三维,​，e）e（电子）)和MMP-9分泌（图第3节,​，k）。k个). 如果与单独的MDA-MB231 CM相比，IL-4与MDA-MB23 CM联合使用可减少IL-6、IL-8和MMP-9的分泌，并增加IL-10的分泌（图3a年-​-c（c）c（c）和图第3节,​，k）。k个). 总的来说，MDA-MB231 CM在IL-4存在下产生了具有中间/混合M2a/M2c表型的巨噬细胞亚群（附加文件6)大量产生免疫抑制M2c诱导细胞因子IL-10。这些巨噬细胞通过分泌MMP-9来保持基质重塑特性。MCF-7或T47D CM诱导CD14的可能性你好/CD16型你好巨噬细胞亚群也分泌不同水平的细胞因子，不应丢弃。MDA-MB231-CM诱导的CD14产生的较高滴度可能掩盖了这些更细微的差异你好/CD16型你好亚群体。

讨论

乳腺癌患者TAM数及分化状态的临床意义

本研究中CD163+将原发性乳腺肿瘤组织中的细胞作为RFS的阴性预后因素。然而，我们无法准确确定这一影响中涉及的其他交互因素。很明显，CD163与已知的与不良预后相关的因素有关，如ER阴性、分化不良（3级）和导管类型（表1和​和2）。2). 以前的研究表明，较高的肿瘤分级[22]Ki67指数升高与CD68增加有关+乳腺肿瘤的巨噬细胞浸润[23,35]. 研究表明，高度增殖的高级别肿瘤可引发积极的免疫反应，从而进一步支持血管生成和肿瘤生长。此外，这些高级别肿瘤可能分泌更高水平的巨噬细胞募集/调节细胞因子，如M-CSF（离体结果，图2英尺)、IL-10和/或TGF-β[6]，这与CD163的高数量相一致+M2-巨噬细胞。一项探索DCIS和浸润性乳腺癌基质基因特征的研究发现，更高级别的ER阴性和PR阴性肿瘤与巨噬细胞反应有关[36]. DCIS期肿瘤进展早期存在巨噬细胞浸润，大多数病例在匹配的浸润性乳腺癌病例中仍呈阳性，这解释了乳腺癌进展中早期巨噬细胞募集的原因[36]. 虽然CD163被广泛接受为一种特异性单核细胞/巨噬细胞标记物，但它也可以由未成熟的MDC表达，其中包括髓源性抑制细胞（MDSC），已知其有利于肿瘤进展[24]. 因此，我们不能排除CD163的百分比+检测到的细胞实际上可能是MDSC，这可能是CD163预后不良的原因。

不同乳腺癌细胞类型对人巨噬细胞分化和活化的体外差异调节

Levano等人[7]探索不同乳腺癌细胞类型的细胞因子受体谱，发现基底样细胞（如MDA-MB231）优先表达粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肝细胞生长因子受体（HGFR，也称为c-MET）、CD44、上皮生长因子受体，转化生长因子受体2（TGFR2）和抑癌素M受体（OSMR）。发光型乳腺癌细胞（如MCF-7和T47D）表达RET（一种原癌基因，编码神经胶质细胞系衍生神经营养因子成员的受体酪氨酸激酶）[7]和白血病抑制因子（LIF）[37]. 这表明TAM根据肿瘤亚型有不同的影响，因为乳腺癌细胞对TAM衍生因子有不同的受体[7]. 此外，间充质或上皮样乳腺癌细胞对TAM的反应或影响不同。已有研究表明，间质样乳腺癌细胞分泌GM-CSF，激活巨噬细胞形成CCL18表达的TAM样表型，而这些TAM样巨噬细胞反过来维持癌细胞的EMT[38]. 考虑到巨噬细胞在胚胎发生、青春期、妊娠和哺乳期间乳腺发育中的作用，这些发现并非完全出乎意料。乳腺中的巨噬细胞被证明在支持和激活正常形态发生所必需的乳腺干细胞方面至关重要[39]，分支[9]以及产后相关的M2巨噬细胞内流[10]. 所有这些发育过程都是通过类似于分子癌症机制的机制发生的，例如血管内皮生长因子A（VEGF-A）刺激的血管生成。此外，TAMs分泌EGF、TNF-α、VEGF和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），并具有降低的抗原呈递能力。肿瘤细胞和TAM免疫抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）释放IL-10[9].

一项对小鼠和人类巨噬细胞极化曲线的研究表明，M-CSF未分化的人类巨噬细胞是M2前体，这意味着LPS或IFN-γ刺激仍能诱导M1反应。然而，如果用IL-4或IL-10刺激，它们会比基底巨噬细胞变成M2型[40]. M-CSF诱导巨噬细胞CD163表达，当LPS刺激时，巨噬细胞分泌较高水平的IL-12p40、TNF-α和IL-6[34]. 我们的MDA-MB231细胞产生大量的M-CSF（图2英尺)如前所述，与临床样本和MDA-MB231细胞水平相似[6]. 同样，单核细胞向M2/CD163转移+通过M-CSF水平增加的TAM在其他肿瘤类型如胶质瘤中也有发现[41]，透明细胞肾癌[42]，卵巢癌[43]和骨肉瘤小鼠模型[44]. 在这些肿瘤类型中，M-CSF和CD163表达升高与较高的肿瘤分级相关[41,42].

CD163是单核细胞/巨噬细胞限制性清道夫受体。它清除血红蛋白/结合珠蛋白复合物，从而保护组织免受血红蛋白诱导的氧化损伤[45]. 最近有研究表明，乳腺癌CD163+TAM与Wnt5a表达相关，后者负责巨噬细胞重编程到抗炎M2状态。同一组研究报告称，Wnt5a作为一种toll-like receptor（TLR）信号的反馈拮抗剂，诱导IL-10分泌[26]. 我们的结果很好地符合这一机制，因为MDA-MB231 CM诱导CD163表达，这是M2c TAM的一个特征。这可能表明Wnt5a平行增加，抑制TLR反应，并在LPS刺激下增加IL-10分泌（图3立方厘米,​、f、，（f）,​，我我).

如前所述，MDA-MB231分泌产物促进M2c分化可能通过免疫抑制、基质重塑和清除TAM功能对微环境辅助肿瘤进展产生影响。这些影响可能会削弱有效的免疫肿瘤排斥反应，正如我们对小鼠巨噬细胞和乳腺癌细胞系CM的体外研究结果所表明的那样[46].

乳腺癌CM导致M2a巨噬细胞CD86表达总体下降可能有助于免疫抑制和肿瘤促进行为。CD86，也称为B7-2，是免疫球蛋白超家族的一种I型跨膜蛋白。它是一种由抗原提呈细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）表达的共刺激分子。其与幼稚T细胞上CD28的结合对于Th2分化、细胞因子分泌和效应功能的诱导至关重要[47].

在我们的系统中，在IL-4和MDA-MB231 CM的存在下分化的M2a巨噬细胞具有增加CD200R信号的潜力，这在体内表明存在免疫抑制肿瘤促进环境。CD200R是一种在巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞和NK（自然杀伤细胞）细胞上表达的髓样受体[48]. 众所周知，CD200R信号可以提高免疫激活阈值，在抑制炎症方面具有生理相关性[48]. 巨噬细胞上CD200配体与其受体CD200R相互作用减少TNF-α和IFN-γ分泌[49]. CD200由癌细胞和其他类型的细胞表达，如间充质干细胞、胸腺细胞、活化的T细胞、B细胞和树突状细胞。对包括乳腺癌在内的不同肿瘤类型的研究表明，CD200-CD200R相互作用可传递免疫抑制信号。该信号直接减少巨噬细胞的炎症细胞因子分泌，间接增加调节性T细胞（Treg）并减少效应性T细胞数量，从而通过免疫逃避促进肿瘤进展[50].

研究的局限性

在TMA分析中，所有样本中每个标记物的阳性细胞中位数被用作截止值，正常乳腺组织的分析（可能携带静止巨噬细胞作为健康基线对照）不包括在内。然而，我们的研究提出了与疾病结局相关的患者之间TAM激活状态的差异。因此，更大规模的研究有理由确定M2巨噬细胞在疾病进展中的确切作用。

在体外巨噬细胞分化研究中，应谨慎地将MDA-MB231 CM对巨噬细胞分化的影响推断为三阴性乳腺癌患者的临床情况。MDA-MB231是一种攻击性模型细胞系，与该领域相关，因为它是体内实验中广泛使用的几个转移性亚克隆的亲本细胞系[51–53]. MDA-MB231细胞系属于间充质样亚型，而来自三阴性乳腺肿瘤的癌细胞可以是七种不同亚型，从上皮细胞到间充质细胞具有表型多样性[54]. 然而，我们认为我们的研究仍然具有相关性，因为它表明乳腺癌细胞，无论其激素受体状态和上皮/间充质性质如何，都会分泌因子，引导巨噬细胞向M2分化。最具攻击性的MDA-MB231最有效地做到了这一点。需要进一步研究，以揭示导致所见影响的因素。如其他研究所示，M-CSF似乎是M2-TAM分化的关键因素[6,55]但由于不产生M-CSF的乳腺癌细胞系（MCF-7和T47D）也影响M2表型，诱导M2a分化，我们认为还有其他相关的M2偏斜因素，我们的工作无法解决。这些因素的发现极为重要，需要进一步研究。

结论

这项研究结合了TAM极化状态在乳腺癌进展中的重要性的几条证据。CD163首次明确+TAM与其他已知的预后因素有关，如快速增殖、分化不良和ER阴性。CD163型+根据多元Cox模型，TAM可能与RFS降低有关。据我们所知，目前的体外实验结果首次证明了仅通过乳腺癌细胞分泌因子调节巨噬细胞分化，为临床发现背后的乳腺癌巨噬细胞教育机制提供了证据。特别地，间充质型细胞系MDA-MB231使巨噬细胞极化为混合M2a/M2c状态。因此，对乳腺癌患者进行TAM激活筛查可能有助于预测转移风险较高的患者，这是合理的。一旦TAM靶向/调节剂通过临床试验并广泛应用，对TAM激活状态的了解可能允许TAM的治疗靶向。其中包括二膦酸盐[56]; M-CSF和M-CSFR抑制剂和靶向抗体[57]、NCT01316822、NCT011444404；抗巨噬细胞迁移抑制因子，NCT01765790和L-MTP-PE，NCT00631631。三阴性转移性乳腺癌患者缺乏治疗方案，对现有方案的抵抗力越来越大，因为持续关注癌细胞靶点，这些靶点天生就不稳定，容易发生突变。像我们这样的方法推动了必要的范式变革，有助于形成这样一种观念，即在开发新的多靶点癌症治疗方法时应考虑免疫肿瘤微环境。

致谢

目前的研究由第七框架计划[FP7/2007-2013]（根据第264817号赠款协议——BONE-NET）和芬兰科学院（第132389号和第250917号决定）资助。

缩写

美国标准菌库美国式文化收藏
碱性成纤维细胞生长因子碱性成纤维细胞生长因子
英国标准协会牛血清白蛋白
厘米条件培养基
反恐委员会循环肿瘤细胞
CTL公司细胞毒性T淋巴细胞
CTR公司控制
轻而快地擦掉3,3'-二氨基联苯胺
DCIS公司导管癌就地
DTC（故障诊断码）扩散性肿瘤细胞
表皮生长因子表皮生长因子
表皮生长因子受体表皮生长因子受体
酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验
电子病历上皮细胞向间充质细胞转化
急诊室雌激素受体
FBS公司胎牛血清
GM-CSF公司粒细胞-单核细胞集落刺激因子
HER-2型人表皮生长因子受体2
HGFR公司肝细胞生长因子受体
干扰素-γ干扰素γ
千帕千道尔顿
LIF公司白血病抑制因子
液化石油气脂多糖
M-CSF公司单核细胞集落刺激因子
M-CSFR公司单核细胞集落刺激因子受体
MDC公司髓样衍生细胞
MDSC公司髓源性抑制细胞
MedFI公司荧光强度中值
基质金属蛋白酶-9基质金属蛋白酶9
基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶
NK公司自然杀手
锇抑癌素M受体
PBMC公司外周血单核细胞
美国公共广播电视公司磷酸盐缓冲盐水
公共关系孕酮受体
房地产税原癌基因，编码胶质细胞系衍生神经营养因子成员的受体酪氨酸激酶
RFS公司无复发生存
RNS系统活性氮物种
ROS公司活性氧物种
TAM公司肿瘤相关巨噬细胞
TGFR2型转化生长因子受体2
转化生长因子-β转化生长因子β
TLR公司toll样受体
TMA公司组织微阵列
肿瘤坏死因子-α肿瘤坏死因子α
特雷格调节性T细胞
VCAM1公司血管细胞粘附分子1
血管内皮生长因子-A血管内皮生长因子A

其他文件

附加文件1：（273K，pdf）

免疫组织化学分析条件。（PDF 273 kb）

附加文件2：（22M，pdf格式）

组织芯片（TMA）分析与巨噬细胞标记物A CD68 B CD163和C HLA-DRIIα相关的无复发生存率和总体生存曲线。（PDF 22622 kb）

附加文件3：（170万，pdf）

CD14的流式细胞术分析 + 用50%条件培养基（CM）、IFN-γ、IL-4和IL-10 A分化5天的细胞CD14 B CD16 C CD64 D CD163 E CD86和F CD200R的平均荧光强度（MFI），归一化为未染色细胞的MFI；n=3*** 第页 <0.0005.（PDF 1833 kb）

附加文件4：（2.0M，pdf格式）

CD14的流式细胞术分析 + 在IFN-γ存在或不存在50%条件培养基（CM）的情况下，细胞分化5天。CD14 B CDC16和C CD64的平均荧光强度（MFI）归一化为未染色细胞的MFI；n=3。（PDF 2112 kb）

附加文件5：（18M，pdf格式）

IL-10巨噬细胞的代表性流式细胞术斑点图：在IL-10存在或不存在乳腺癌细胞系条件培养基（CM）的情况下，使用CD14、CD16和CD163 B抗体检测分析表面标记物的平均荧光强度（MFI）。（PDF 18647 kb）

附加文件6：（260万，pdf）

IL-4巨噬细胞的代表性流式细胞术点图在有或没有乳腺癌细胞系条件培养基（CM）的IL-4存在下的人巨噬细胞，用所分析的表面标记物的CD14、CD16、CD163、CD200R和CD86B的抗体检测平均荧光强度（MFI）。（PDF 2715 kb）

脚注

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

SS构思并设计了这项研究，开发了方法，获取、分析和解释了数据，编写并修订了手稿。RB获得流式细胞仪数据。ML、PK和JS在TMA分析中提供了技术支持。SL和OT参与了TMA研究并进行了统计分析。HJ参与了TMA研究，获取、分析和解释数据。DH参与了研究构思和设计，尤其是监督了体外巨噬细胞分化研究。JuM负责监督和协调研究。JM构思、设计、监督并参与了手稿的撰写和修订。所有作者阅读、批判性修改重要知识内容，并批准最终手稿。

参与者信息

索菲亚·索萨，电话：+358（0）503164101，if.feu@asuos.aifos.

雷吉斯·布里昂，rf.setnan-vinu@noirb.siger公司.

Minnamaija Lintune，if.utu@nenutnil.ajamannim.

Pauliina Kronqvist，if.utu@orkuap.

Jouko Sandholm，如果.ktb@mlohdnas.okuoj.

朱卡·蒙科宁，if.feu@nenokknom.akkuj.

皮尔科·利萨·凯洛昆普·莱赫蒂宁，如果.atu@nenithel-upmukollek.asiil-okkrip.

苏珊娜·劳蒂亚，if.iknisleh@aittual.annasus邮箱.

奥利·泰宁，if.suh@neninyt.illo（电子邮箱）.

海基·琼苏，邮箱：suh@uusneoj.ikkieh.

多米尼克·海曼，rf.setnan-vinu@nnamyeh.euqinimod邮箱.

Jorma A.Määttä，if.utu@attaam.amroj.

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文章来自乳腺癌研究：BCR由以下人员提供BMC公司