CRISPR-Cas9系统在肿瘤生物学中的应用

前言

癌症是一种以癌基因和抑癌基因的多重遗传和表观遗传改变为特征的疾病¹因此，操纵正常细胞和癌细胞基因组的实验方法对于疾病建模以及系统研究该过程中涉及的许多基因至关重要。几十年来，基因组工程技术的研究和发展使得精确删除或以其他方式修改培养细胞或动物模型基因组中的特定DNA序列成为可能，以探索与癌症发生、发展和治疗反应相关的基因的作用。马里奥·卡佩基（Mario Capecchi）、奥利弗·史密斯（Oliver Smithies）等人通过同源重组在胚胎干细胞中进行基因靶向研究的开创性工作^2–4为科学界提供了生成大量基因工程小鼠模型（GEMM）的手段，这些模型在肿瘤抑制剂和癌基因中具有精确的突变，并且在与癌症生物学相关的基因中具有明确的功能丧失或功能获得改变的细胞系中具有精确的突变。此外，该技术已成功地与Cre和Flp等位点特异性重组酶结合，以产生大量癌症基因的条件等位基因⁵尽管在过去20年中，这些基因修饰方法是癌症遗传学的主要研究方法，但由于同源重组的基因靶向效率相对较低，以及ES细胞操作和随后的小鼠繁殖所需的时间，这些基因改造方法受到了限制。

提高基因靶向效率的一种策略是在感兴趣的基因组位点引入DNA双链断裂（DSB）^6–10这些DSB由细胞DNA修复途径修复，特别是由易出错的非同源末端连接（NHEJ）途径修复，该途径经常导致插入或缺失突变（indels）。DSB也通过同源定向修复（HDR）途径进行修复，该途径可以在外源供体DNA模板存在的情况下介导精确的DNA修饰(图1A). 基于这些初步观察结果的后续研究导致了改进的定点基因组工程方法的发展，其中锌指核酸酶（ZFN）^10–12和转录激活物样效应核酸酶（TALENs）^13–16广泛应用于多种细胞类型和生物体（在^17,18). ZFN和TALEN极大地促进了精确基因组工程；然而，由于设计这些定制的内切酶的成本和复杂性，它们的广泛应用受到了限制。

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图1

利用CRISPR-Cas9系统的基因组工程

一|DNA双链断裂（DSB）可以通过两种细胞DNA修复途径进行修复：非同源末端连接（NHEJ）途径或同源定向修复（HDR）途径。NHEJ通路容易出错，通过NHEJ途径进行修复经常导致插入或缺失突变（indels），从而导致移码突变的中断和过早终止密码子的产生。或者，在存在外源供体DNA模板的情况下，可以通过HDR途径修复DSB，这可以用于工程精确的DNA修饰。b条|化脓链球菌-衍生的Cas9 RNA引导的DNA内切酶通过单引导RNA（sgRNA）序列定位到特定的DNA序列，该序列以NGG或NAG的形式与邻近原间隔区邻接基序（PAM）序列的特定靶序列配对。Cas9介导的DNA靶序列中DSB的诱导通过NHEJ或通过HDR的精确基因修饰导致indel突变。

最近描述的原核簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas系统和成功实现的化脓性链球菌-Zhang在哺乳动物细胞中衍生的II型CRISPR-Cas9系统¹⁹，教堂²⁰，杜德纳²¹和Kim²²研究小组通过解决早期方法的许多局限性，迅速改变了基因组工程的格局。这个高度通用的系统来源于原核适应性免疫系统，由两种生物成分组成：RNA引导的DNA内切酶Cas9和嵌合单引导RNA（sgRNA）。sgRNA分子含有CRISPR RNA（crRNA）成分和反式-激活crRNA（tracrRNA）组分，与Cas9结合并通过与目标序列的碱基配对将其导向感兴趣的基因组序列²³(图1B). 定义靶序列的唯一标准是它与原间隔区相邻基序（PAM）相邻，由NGG或NAG三核苷酸组成²⁴对于化脓链球菌-衍生的Cas9（值得注意的是，其他Cas9同源序列识别不同的PAM序列^25,26). 通过简单地将Cas9的表达与与目标DNA序列互补的sgRNA结合，可以实现目标的高效切割，从而产生DSB，然后通过NHEJ或HDR进行修复(图1B). 过去几年发表的大量研究表明，通过CRISPR-Cas9-介导的NHEJ或HDR，可以在多种细胞和生物体中有效地进行基因破坏和基因修饰（参见²⁷).

在这篇进展文章中，我们讨论了CRISPR-Cas9系统的几个最新应用，特别强调了有望通过促进正常和癌症基因组工程来改变癌症生物学领域的方法。

遗传事件的快速建模

在当前的癌症基因组学时代，几项大规模的癌症基因组测序工作已经产生了人类肿瘤中存在的基因改变的扩展目录²⁸在所谓乘客突变的背景中，驱动突变通过癌基因的突变激活和/或抑癌基因的失活直接或间接促进正常细胞向癌细胞的转化，乘客突变被认为不会直接影响致瘤过程。癌基因通常通过获得功能突变激活，而肿瘤抑制基因通常通过失去功能突变失活。

旨在剖析假定癌基因和抑癌基因在细胞培养、异种移植物、同种异体移植物以及某些情况下的转基因小鼠模型中的作用的中大规模功能性遗传学研究传统上依赖于基于cDNA的过表达和RNA干扰（RNAi）介导的敲除方法。虽然这些方法在过去几年中在癌症生物学方面取得了许多重要的发现，但它们有一些重要的局限性。首先，基于cDNA的表达系统可以导致超生理水平的基因表达²⁹这可能会对信号通路和细胞生物过程造成异常和人为的影响。基于RNAi的失活方法受到基因沉默程度和抑制稳定性的不确定性的限制。对于某些靶点或实验方案来说，这并不成问题，但对于其他靶点或试验方案来说，需要完全和永久灭活才能获得一致的结果。基于RNAi的方法也可能遭受严重的离靶效应。CRISPR-Cas9系统用于内源性位点的靶向修饰，为克服这些局限性提供了一种快速方法。除了简化癌基因和抑癌基因的研究外，CRISPR-Cas9系统还允许快速区分驾驶员和乘客突变。

永久性Cas9介导的单个或多个内源性基因座的修饰可以通过瞬时或稳定传递CRISPR组分来实现。一些研究小组报告了通过瞬时转染编码Cas9和sgRNAs的质粒DNA成功编辑培养细胞中的内源性基因^19–22或Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物（RNP）^30,31或者，CRISPR成分可以通过逆转录病毒或慢病毒稳定地传递到细胞中^32,33为了设计功能丧失突变，人们依赖NHEJ，NHEJ常常导致在Cas9裂解位点附近生成indels，从而经常导致移码突变。工程获得功能突变需要以单链或双链DNA的形式包含HDR模板，以携带所需突变(图1B和方框1). CRISPR组分的瞬时表达提供了点击-运行策略的优势，该策略应允许无限制地对内源性基因进行串行编辑，而无需多重病毒整合或连续表达CRISRP组分。携带一个或多个靶向突变的细胞系可以用一组基于细胞的和体内检测突变对癌症相关表型的影响的分析。这种方法可用于已建立的癌细胞系、从小鼠或人类来源获得的原代细胞系，以及患者来源的异种移植物和类器官培养物等(方框1). 此外，该技术应允许通过序列或多重基因编辑系统分析上位相互作用和全面剖析致癌信号通路。除了能够对真正的癌症基因进行功能表征外，此类研究还可以帮助排除乘客突变对癌症发生和发展的功能影响。几篇评论文章^27,34最近详细描述了CRISPR-Cas9系统在基因组工程中的大多数应用。我们在方框1–三下面将重点介绍这项技术在生成用于癌症基因研究的动物模型方面的用途体内.

方框1

CRISPR-Cas9系统在癌症生物学中的潜在应用

CRISPR-Cas9系统的灵活性和模块性导致了许多基因组工程应用的发展，其中大多数已在细胞培养系统中成功进行。其中许多也可以进行调整以供使用体内（见图）。利用这项技术的力量，可以快速准确地对肿瘤抑制基因、癌基因和其他细胞转化或药物反应调节剂的失能（LOF）（图中的a部分）和获能（GOF）（表中的b部分）突变进行工程设计。例如，佐藤俊郎的研究小组最近证明了CRISPR-Cas9系统的实用性，该系统可对未转化的人类肠道类器官中的LOF和GOF突变进行系统工程，以模拟人类结直肠癌（CRC）⁶⁵值得注意的是，连续引入五个经常与人类CRC相关的独立突变（三个LOF突变和两个GOF突变）并没有完全再现人类疾病的致瘤性和转移性特征，这表明完全恶性肿瘤需要额外的次级遗传和/或表观遗传事件⁶⁵此外，多重化CRISPR-Cas9系统的能力为研究癌细胞的组合脆弱性提供了机会，并系统测试上位关系和合成致命相互作用（图的a部分）。该技术还允许基于位点特异性重组酶产生内源性条件等位基因³⁹，标记内源性等位基因³⁹和询问非编码DNA元素⁶⁶（图中的b部分）。CRISPR-Cas9系统还可用于触发相同或不同染色体上的两个远程DSB，分别导致目标序列的反转、缺失或易位或易位（图的c部分）。这种方法已被证明在细胞中是有效的^67–74和体内^49,75.

快速生成鼠标模型

基因工程小鼠模型（GEMMs）⁵和非生殖系GEMMs（nGEMMs）³⁵在揭示肿瘤发生、维持和进展的几个基本方面，癌症的发病机制发挥了关键作用。此外，它们已成为测试各种抗癌药物以及揭示耐药性机制的忠实模型^36,37然而，生成GEMMs是一个缓慢且昂贵的过程，需要复杂的ES细胞操作和/或原核注射，以及广泛的小鼠饲养，以获得含有感兴趣等位基因的动物³⁵癌症的nGEMMs可以通过ES细胞的连续再靶向绕过复杂遗传交叉的需要，从而简化这一过程³⁵然而，不能同时在小鼠或ES细胞中引入多种基因修饰仍然是一个相当大的障碍。

Jaenisch及其同事最近证明，CRISPR-Cas9系统可以在一步内同时破坏小鼠ES细胞中多达8个等位基因³⁸此外，他们还报道了单细胞小鼠胚胎中两个基因的有效同时断裂，以及随后一步产生的双基因敲除动物³⁸该组还证明了HDR介导的两个内源性基因的高效同步基因组编辑³⁸在随后的一项研究中，他们扩展了CRISPR-Cas9方法，以快速生成携带条件Cre/loxP等位基因和报告基因的小鼠，并使用sgRNA对生成携带小缺失的小鼠³⁹(方框1). 这些研究表明，ES细胞或小鼠容易产生多种功能获得和功能丧失突变，这一进展为以前所未有的速度和精确度开发新型GEMMs和nGEMMs癌症药物打开了大门。事实上，我们预测，新型GEMMs和nGEMMs将激增，其中包含独特复杂的基因改变，这将允许以前所未有的速度和效率详细分析肿瘤演化的几个阶段(图2A). 例如，CRISPR介导的工程将允许快速生成包含致癌基因和抑癌基因构成或条件突变的多种组合的ES细胞系的大型储存库，以及大规模染色体重排，这些重排将捕获一些人类癌症基因组特征的遗传异质性。这些ES细胞系可用于产生含有多种不同突变基因型的癌症GEMMs和nGEMMs，这对于测试新的治疗方案和个性化肿瘤学研究具有重要价值。

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图2

CRISPR-Cas9系统在肿瘤生物学中的应用

一|CRISPR介导的胚胎干细胞（ES）基因组工程或基因工程小鼠模型（GEMM）衍生的ES细胞可用于快速生成新的GEMM或癌症的非种系GEMM（nGEMMs），其包含多种遗传改变，如构成或条件敲除和敲入等位基因，内源性合成标签或报告物、非编码单核苷酸多态性（SNP）和基因组重排，以及通过ES细胞重组或多重CRISPR介导的基因组工程将所有这些结合起来。b条|CRISPR介导的体细胞基因组工程体内可用于快速生成荷瘤小鼠队列，用于研究癌症生物学的基础和转化方面。例如，可以部署CRISPR-Cas9系统体内根据在单个患者中观察到的突变的确切补充，生成个性化小鼠队列。c（c）|CRISPR-Cas9系统可以作为工作台和床边之间的重要管道。将复杂的分子剖析技术与基于CRISPR的基因组工程技术相结合，将使研究人员能够生成个性化的实验平台，通过一系列基于细胞和体内分析。

值得注意的是，大多数小鼠癌症模型都是基于数量相当有限的突变基因或等位基因，如G12D或G12V突变喀斯特致癌基因^40,41CRISPR-Cas9系统将允许系统生成包含多个致癌等位基因的模型，从而有可能研究肿瘤进展和治疗反应中的等位基因特异性后果。HDR介导的特定基因组区域编辑的高度系统化和可复用方法，如Shendure实验室开发的方法⁴²，将有助于快速分析具有各种突变组合的“热点”区域以及随后产生的GEMMs和nGEMMs。

除了开发新的模型外，CRISPR-Cas9系统还可以用于改进现有的癌症模型。从研究充分的GEMMs中获得的ES细胞系可以很容易地进行重组，以容纳癌基因和抑癌基因的其他构成或条件突变等位基因⁴³(图2A). 因此，可以很容易地研究候选的协同突变，并可以验证推定的合成致死相互作用。此外，这种方法将允许由小鼠队列组成的临床前研究，更好地代表人类癌症的遗传异质性(图2A). 甚至可以设想将单个患者肿瘤的全面基因组特征与快速生成个性化GEMMs、nGEMMs或基于细胞的异种移植相结合。体内携带特定患者肿瘤驱动基因突变的精确补体的模型可以用常规或实验性抗癌药物进行筛选，以确定最有效的治疗方法。

体细胞基因组工程

如上所述，CRISPR-Cas9的基因组编辑效率使生殖系和ES细胞系的基因操作过程更加快速和强大。该系统的威力在进行体细胞基因组编辑的能力上更为明显体外和体内.

基于体内CRISPR的体细胞基因组编辑用于癌症建模

为了探索CRISPR-Cas9系统在活体动物中直接突变基因的应用，我们实验室利用水动力基因转移同时传递编码Cas9和sgRNAs的质粒，靶向铂族和Trp53基因肝细胞的抑癌基因体内⁴⁶令人惊讶的是，将这些CRISPR质粒输送到成年野生型小鼠的肝细胞足以诱导肝肿瘤，其组织病理学与在铂族^{飞行/飞行}；Trp53基因^{飞行/飞行}GEMMs，其中肿瘤通过表达Cre重组酶的腺病毒启动。这些结果强烈表明，CRISPR介导的成年野生型小鼠癌症基因的体细胞基因组编辑可以有效地替代传统的GEMMs，至少可以替代某些癌症类型。此外，我们进一步证明了使用CRISPR-Cas9系统通过CRISPR成分和编码β-连环蛋白突变形式的单链DNA模板的共同递送，在成年野生型小鼠的肝脏中设计功能获得突变的可行性，这导致了以低（0.5%）但可检测的频率产生具有核β-连环蛋白的肝细胞⁴⁶.

除肝脏外，我们还开发了一种同时编码CRISPR组分和Cre重组酶的一体式慢病毒。该载体被用于突变已建立的肺癌发展中的三个肺癌抑癌基因喀斯特^{LSL-G12D型/+}和喀斯特^{LSL-G12D型/+}；Trp53基因^{flox/flox公司}肺癌的GEMMs^40,47,48.以一组肿瘤抑制基因为靶点的表达sgRNAs的多合一慢病毒的气管内输送喀斯特^{LSL-G12D型/+}或喀斯特^{LSL-G12D型/+}；Trp53基因^{flox/flox公司}小鼠产生的肺腺癌具有不同的组织病理学和分子特征，这取决于靶向的抑癌基因。此外，很大一部分肺肿瘤在靶基因的预测位点中含有indels，并且没有检测到的非靶编辑，这有力地支持了Cas9在体细胞基因组编辑中的靶向活性体内在一项平行研究中，文丘拉小组证明了使用CRISPR-Cas9系统模拟大型致癌染色体重排的可行性(方框1)在野生型小鼠中体内通过递送编码Cas9的腺病毒和两种设计用于诱导Eml4-Alk公司（棘皮动物微管相关蛋白样4-间变性淋巴瘤激酶）反转^49,50肺肿瘤发生时具有完全外显率，对克里唑替尼极为敏感，克里唑替尼是一种用于治疗含有这种特定致癌重排的人类肺肿瘤的抑制剂⁵¹此外，事实上Eml4公司和阿尔克基因座由约11个兆碱基分隔，这有力地支持了CRISPR-Cas9系统用于模拟大规模基因组重排的可行性。随后利用慢病毒的研究也证明了CRISPR-Cas9系统诱导染色体重排的能力体内⁵²这些研究表明，通过以质粒或病毒的形式传递所有CRISPR组分，通过体细胞基因组工程可以快速生成小鼠癌症模型。除了这些传统的基于DNA或病毒的递送方法外，非病毒递送材料工程的最新进展使得递送Cas9-sgRNA蛋白-RNA复合物成为可能⁵³和sgRNA-纳米粒子复合物⁵⁴ 体内分别使用阳离子脂质介导的传递或7C1纳米粒子。材料科学和工程的未来发展应使实施其他类型的非病毒传递平台成为可能，用于传递Cas9、sgRNAs和HDR供体DNA模板，以实现高效的基因组修饰体内（非病毒材料在⁵⁵).

为了进一步简化基于CRISPR的癌症体细胞小鼠模型的生成，Zhang和Sharp实验室报告了表达Cas9酶的组成型或Cre诱导型小鼠模型的产生⁵⁴通过气管内输送编码六种成分的新型腺相关病毒（AAV）：喀斯特^G12D系列HDR供体DNA模板，sgRNAs靶向喀斯特，丝氨酸/苏氨酸激酶11(第11列; 亦称为磅1)和Trp53基因、Cre重组酶和雷尼利亚荧光素酶进入表达Cre诱导的小鼠案例9等位基因，它们能够通过同时破坏抑癌基因和工程致癌基因在成年小鼠中诱导肺癌喀斯特^G12D系列突变。最近，Lowe实验室报道了一种高度灵活的小鼠建模平台的产生，该平台由共表达多西环素诱导的等位基因的转基因小鼠组成案例9或案例9^第10天镍酶变体⁵²和组成性表达的sgRNA盒⁵⁶利用这个条件平台，他们证明了有效的基因编辑体内目标基因修饰率高达85%。此外，他们证明了最多两个基因的有效同步双等位基因修饰体内使用一对sgRNAs和Cas9核酸酶。这个灵活的平台允许它们容纳多达六个sgRNA盒，当与Cas9结合时^D10A型Nickease能够高效地同时编辑小鼠ES细胞中的三个基因。

表达Cas9核酸酶和Cas9的小鼠模型的建立^第10天Nickease代表了CRISPR在癌症生物学中应用的一个重大进展，使研究人员能够集中精力利用病毒和/或非病毒载体，利用或不利用合成的HDR供体DNA模板来传递单个或多个sgRNAs，而无需优化共传递这种大DNA内切酶的方法。此外，Cas9的Cre诱导或强力霉素诱导等位基因的表达体内可通过分别合并组织特异性Cre或逆转录四环素反式激活因子等位基因来实现组织特异性。此外，CRISPR介导激活的构成和条件小鼠模型的发展⁵⁷或镇压⁵⁸基因表达(方框2)将作为功能性研究编码和非编码DNA元素的有力补充方法，而不会永久破坏内源性基因组序列。超出既定范围小家鼠实验室生物，CRISPR-Cas9技术的灵活性应允许利用遗传难治性生物快速生成新型癌症动物模型，这些生物能更好地再现人类组织结构和药物代谢，例如猪⁵⁹和非人类灵长类⁶⁰.

方框2

dCas9-效应器融合在癌症生物学中的潜在应用

Cas9以特定的RNA-依赖方式结合的能力可以通过突变其HNH和RuvC-like催化域而与其核酸酶活性解偶联。这种无催化活性的Cas9形式，通常被称为死亡的Cas9（dCas9），保留其RNA引导的DNA结合活性，而没有任何可检测到的DNA内切酶活性²³一系列研究证明了dCas9-效应器融合（见图）对可逆转录抑制的作用^58,76,77或激活^{25,57,58,76–82}内源性编码基因和非编码基因。此外，利用编码靶向和效应器再转录功能的支架RNA可以在单个细胞内同时进行多重基因抑制和激活⁸³.

癌症生物学的未来应用

我们展望了癌症生物学的新时代，基于CRISPR的基因组工程将成为工作台和床边之间的重要通道(图2C). 成功应用复杂的基因剖析技术来全面描述患者肿瘤的特征，正在生成详细的路线图，以指导定制的基于细胞或基于整体动物的实验系统的开发。这些系统将作为个性化平台，研究人员将通过基于单个或多个CRISPR和基于小分子的方法，快速、系统地识别基因型特定漏洞和合成致命相互作用。此外，这种个性化平台可以与患者并行研究，有可能快速识别耐药机制并制定克服这些缺陷的策略⁶¹.

尽管目前使用CRISPR-Cas9靶向人类患者的癌症基因作为治疗策略存在技术限制，但这种形式的基因治疗的前景仍然非常令人兴奋。最近的工作证明了这项技术在永久纠正基因突变方面的潜力体内通过HDR在遗传性遗传病小鼠模型的成年肝脏中，成功缓解了疾病的各个方面⁶²因此，利用病毒和非病毒递送载体来提高CRISPR-Cas9组分的编辑和递送效率的这项技术的未来进步将允许对单个或多个驱动突变进行治疗性基因校正。除了永久纠正癌相关突变外，CRISPR-Cas9系统还可以用于精确体外免疫治疗应用的免疫细胞工程。例如，CRISPR-Cas9系统可用于开发新型嵌合抗原受体（CAR）修饰的T细胞⁶³将CAR精确插入安全港轨迹⁶⁴.

自Doudna和Charpentier小组证明CRISPR-Cas9系统作为一个强大的RNA-programmed基因组编辑平台的潜力以来²³基因组工程领域迅速经历了一场科学革命，有望改变基本生物学和生物医学研究的几乎每个方面。将这项技术应用于癌症生物学的几个方面，从基础研究到临床和转化应用，为更好地理解和治疗这一毁灭性疾病提供了许多激动人心的机会。

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