Exendin-4对骨髓间充质干细胞增殖、迁移和凋亡的影响在体外

骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

如前所述，分离并收获骨髓MSC。简而言之，用PBS稀释Sprague-Dawley大鼠的骨髓样本，并在400×g下离心30分钟。将含有单核细胞的浅黄色外壳用PBS洗涤两次，并将其置于MSC培养生长培养基中，该培养基由含有L-谷氨酰胺和10%（v/v）胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM；Invitrogen Co.，USA）组成。培养物在含5%二氧化碳的增湿大气中保持在37°C。24小时后，丢弃非粘附细胞，每4天添加新鲜培养基并更换。当MSC达到约80%的融合时，以1:2的比例传代每个原代培养物。

根据制造商的方案，使用StemPro®成脂和成骨分化培养基（美国Invitrogen公司）进行成脂和骨分化。培养物每2至3天更新一次。培养3-4周后，通过用油红O溶液培养细胞来评估脂肪生成，以染色细胞质中的中性脂质。Alizarin Red S（Sigma-Aldrich，USA）用于评估成骨分化。

为了确认MSC特征，在第3代培养的细胞按照制造商推荐的浓度，使用FITC-标记的CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和CD166标记物（BD Biosciences，USA）进行流式细胞术。用FITC-标记的IgG染色的细胞作为阴性对照。该分析使用CellQuest软件对至少10000个事件进行了FACSan。

细胞活力测定

采用3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT；Sigma-Aldrich，USA）检测法评估MSC细胞活力。简单地说，MSC被植入96周板中。在用不同剂量的Ex-4（0–20 nm/L，Sigma-Aldrich）处理12 h后，将细胞与MTT溶液（Sigma-Aldrich）在37°C孵育4 h。然后，去除培养基，并向每个孔中添加100μL二甲基亚砜（DMSO）。在570 nm波长下测量吸光度。数据表示为治疗组的光密度（OD）值与对照组的OD之比。

流式细胞术

流式细胞术检测骨髓间充质干细胞CXCR4表达、凋亡率和细胞周期分布。用不同浓度的Ex-4（0–20 nm/L）处理24小时后，MSC在P_三用于检测CXCR4的表达。在PBS中清洗后，每组细胞在室温下用FITC-标记的CXCR4（Bios，中国）或FITC-标签的IgG染色30分钟。

使用Annexin V–FITC/PI凋亡检测试剂盒（BD Biosciences，USA）定量分析凋亡细胞的数量。处理后，收集细胞，将其重新悬浮在200μl结合缓冲液中，然后在黑暗中与5μl Annexin V–FITC/结合缓冲液混合物（30 min，37°C）孵育。随后，用10μl碘化丙啶孵育细胞5min，立即用BD-FACSCalibur细胞仪进行双变量流式细胞术分析。

为了进行细胞周期分析，MSC用Ex-4（0–20 nm/L）处理24 h。然后将细胞重新悬浮在PBS中，并用70%冰镇乙醇固定24 h。将固定细胞漂洗并在50μg/ml碘化丙啶中重新悬浮30 min。使用BD FACSCalibur细胞仪进行流式细胞术分析。

细胞增殖试验

采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）试验（中国贝尤蒂姆生物技术研究所）和5-乙炔基-2´-脱氧尿苷（EdU）增殖试验（中国RiboBio公司）评估细胞增殖。在CCK-8试验中，细胞被镀到96个钢板（5×10^三细胞/孔），Ex-4（0–20 nm/L）以三重模式。电镀后1至7天，在37°C下，在10μl CCK-8溶液中添加100μl新鲜培养基，再持续2小时，进行分析。测量570 nm处的OD。试验重复3次。

EdU分析（中国广州RIBOBio公司）用于测量用20 nm Ex-4处理24 h后细胞的增殖能力。用EdU培养2 h后，用4%多聚甲醛固定细胞，并用0.5%Triton X-100渗透。然后，阿波罗^®反应鸡尾酒（反应缓冲液和阿波罗^®643荧光）加入培养基中，在黑暗中再培养30分钟。用PBS洗涤3次后，用DAPI（Sigma-Aldrich）染色5分钟，并立即在荧光显微镜下观察。EdU数量⁺细胞是通过计算至少三个随机分开的字段来计算的。

西方锚杆分析

在适当的处理后，用RIPA裂解缓冲液（中国Beyotime）裂解培养的细胞30分钟，然后在14000×g离心30分钟。每个样品的蛋白质浓度用BCA蛋白质测定法（中国Beytime生物技术研究所）定量。然后，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳在6%至15%的梯度凝胶上电泳等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下用5%的牛奶在Tris缓冲盐水和0.2%吐温中封闭膜1小时，然后在4°C，具有以下特异性一级抗体：β-肌动蛋白（1:2000）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（1:2000；p-Rb（1:2000）、Bcl-2（1:2000；以及购自美国圣克鲁斯生物技术公司的细胞周期蛋白D1（1:1500）、细胞周期蛋白E（1:11500）和CXCR4（1:500）。用Tris缓冲盐水和0.2%吐温清洗印迹三次，并在室温下用辣根过氧化物酶结合二级抗体（圣克鲁斯生物技术公司）培养45–60分钟。用TBST（10 min×3）清洗细胞膜后，用增强化学发光（ECL）试剂（中国贝尤泰姆生物技术研究所）检测表达信号。

迁移和伤口愈合分析

MSC迁移分析是使用孔径为8μm的24孔跨井室进行的（美国科宁）。首先，MSC与Ex-4（0-20nm/L）培养24h；然后，10⁵将MSC接种到无血清培养基的上腔中。将基质细胞衍生因子-1α（SDF-1，Sigma-Aldrich，50 ng/ml）添加到下室。在37°C下孵育12小时后，用棉签小心地清除上腔中的非迁移细胞，并将穿过膜的细胞固定在甲醇中，并用0.05%结晶紫染色。为了量化，迁移细胞的数量是通过计算至少五个随机的独立场来计算的，作为实验样品与对照样品的比率×100。

对于伤口愈合测定，10⁶细胞接种在36mm的平板上，生长到80-90%的汇合处。使用P200移液管尖端来刮擦融合的细胞单层，从而形成人工伤口。立即获得显微照片（时间0 h），然后将细胞在含有1%胎牛血清的DMEM中孵育24 h，加入或不加入Ex-4。24 h后观察细胞动员和划痕闭合。

氧化应激损伤诱导和TUNEL分析

过氧化氢和血清剥夺诱导MSC氧化应激凋亡。简而言之，MSC培养基被无血清DMEM取代，补充0.3 mM H₂O（运行）₂，MSC在37°C常压条件下孵育12 h。对于Ex-4保护实验，MSC用Ex-4（0–20 nM）预处理12 h；然后，丢弃培养基，用添加0.3 mM H的无血清DMEM代替₂O（运行）₂再持续12 h，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）法检测h₂O（运行）₂根据制造商的协议。凋亡程度以每500个MSC细胞核中TUNEL阳性细胞数计算。细胞核用染色质染料DAPI染色。简单地说，细胞在室温下在4%（w/v）多聚甲醛中固定1小时。进行特异性标记后，将细胞在黑暗中暴露于DAPI中5分钟，然后通过荧光显微镜观察免疫染色的MSC。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性、活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和GPX测定

由于caspase3的激活代表了凋亡过程中的一个重要步骤，因此根据制造商的方案，使用Ac-DEVD-AMC caspase3-荧光底物（中国贝尤蒂姆生物技术研究所）caspase3.活性试剂盒检测caspase3/活性。将相对胱天蛋白酶3活性计算为经处理的细胞与未经处理的细胞的发射的比率。试验重复3次。

使用二氢乙硫酸氢钠（DHE；Invitrogen，德国）检测细胞内ROS，并将10μM DHE添加到细胞培养基中，然后在黑暗中培养并在激光共焦显微镜下观察（奥林巴斯）。

丙二醛（MDA）是氧化损伤导致的脂质过氧化的最终产物，是H对MSC损伤程度的可靠标记物₂O（运行）₂谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘苷过氧化物酶（GPX）和超氧化物歧化酶（SOD）是重要的抗氧化剂，参与有效清除自由基和抑制氧化应激的作用，促进MSC在H暴露下的存活₂O（运行）₂MDA含量、SOD/GPX活性和GSH浓度按照制造商的说明使用商业试剂盒（中国贝尤泰姆生物技术研究所）进行测量。

试剂处理

为了研究PI3K/Akt通路在Ex-4介导的MSC增殖、迁移和存活中的作用，在Ex-4治疗前向MSC培养基中加入LY294002（20μm/L，细胞信号技术）4h，以阻断PI3K/Akt通路的激活。对于增殖实验（细胞周期分析和EdU分析），MSC在上述分析之前用Ex-4处理24小时。为了进行趋化性试验，MSC与Ex-4培养24 h，然后接种在趋化性培养箱中12 h。此外，为了阻断CXCR4和SDF-1α之间的相互作用，在Ex-4治疗（20 nm/L）之前，MSC分别与CXCR4抗体（AMD3100，Abcam，USA，10μg/ml）孵育2 h。在H中₂O（运行）₂-诱导凋亡模型，MSC用Ex-4（0–20 nm/L）预处理12 h，然后用0.3 mM h孵育₂O（运行）₂持续12小时。

Ex-4对MSC细胞活力和PI3K/Akt通路的影响

首先，我们评估Ex-4本身是否对MSC有毒性作用。如所示图2A与未经处理的细胞相比，在使用的整个浓度范围内（1–20 nM），Ex-4对细胞活力的影响很小，表明Ex-4对MSC没有毒性作用。

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图2

Ex-4对MSC存活率和PI3K/Akt通路的影响。

将MSC与不同剂量的Ex-4孵育24 h。用MTT评估其生存能力，用western blotting评估PI3K/Akt通路的激活。(A类)Ex-4对MSC无毒性作用。(B类)Ex-4以剂量依赖的方式激活Akt*P（P） < 0.05与对照组，^#P（P） < 0.05 vs.Ex-4组；LY，LY294002。

已证实Ex-4通过ERK1/2、cAMP/PKA和PI3K/Akt通路对胰岛MEC发挥细胞保护作用²¹在MSC中调节经典的生长和存活信号²²因此，我们检测了Ex-4对MSC中PI3K/Akt通路的影响。如所示图2BEx-4处理以浓度依赖的方式增加了磷酸化Akt（p-Akt）的水平。然而，在PI3K/Akt抑制剂存在的情况下，p-Akt表达受到强烈抑制，表明Ex-4是MSC中PI3K/Akt通路的上游激活剂。

Ex-4-诱导的增殖需要PI3K/Akt

为了确定Ex-4在MSC生长中的作用，将不同剂量的Ex-4添加到培养基中24 h，然后通过流式细胞仪分析细胞周期分布。如所示图3A、B，Ex-4组的S和G细胞比例增加₂/M期，G期细胞较少₁这表明Ex-4导致分裂细胞数量呈剂量依赖性增加。为了进一步证实Ex-4促进细胞周期是否会延长细胞寿命，使用CCK-8评估了Ex-4在特定点对MSC生长动力学的影响。增长曲线如所示图3C结果表明，随着Ex-4浓度的增加，MSC的生长能力逐渐增强。然而，PI3K/Akt抑制抑制了Ex-4对MSC增殖的影响。此外，对照组和1-nM组之间没有实质性差异，在最初的24小时内，两组之间也没有发现显著差异。

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图3

PI3K/Akt信号通路是Ex-4诱导MSC增殖所必需的。

(A类和B类)用Ex-4（0–20 nM）处理MSC 24 h，然后用流式细胞仪评估细胞周期。(C类)Ex-4（0–20 nM）干预后第1天至第7天MSC的生长曲线。(D类)Ex-4治疗24 h后，细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E和p-Rb的蛋白表达水平增加；然而，PI3K/Akt通路的预抑制使其降低。(E类)EdU分析表明，阻断PI3K/Akt可以减少Ex-4介导的MSC增殖*P（P）与对照组相比<0.05；^#P（P） < 0.05 vs.Ex-4组；LY，LY294002。

接下来，我们发现细胞周期蛋白D1、细胞周期蛋白E和p-Rb的表达水平(图3D)Ex-4治疗后增加，但PI3K/Akt阻断后减少。细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白E形成Cdk4/6-Cyclin D和Cdk2-Cyclin E复合物²³在G的循环转换中起着关键作用₀/G公司₁通过Rb（p-Rb）磷酸化到S相。p-Rb的释放激活转录因子E2F-1，它允许表达DNA复制和有丝分裂所必需的基因²⁴此外，EdU增殖试验(图3E)显示出类似的结果：Ex-4组（20nM持续24小时）中的EdU阳性细胞比对照组中更多。然而，LY294002预处理逆转了这一趋势，表明Ex-4通过PI3K/Akt途径增加MSC的增殖能力，从而通过Cyclin D1/E-Rb依赖途径促进细胞周期。

Ex-4通过PI3K/Akt增强CXCR4表达和随后的MSC迁移

SDF-1α及其独特受体CXCR4在移植后受损心脏组织MSC的动员和募集中起着关键作用²⁵在我们的研究中，我们发现正常MSC中CXCR4的表达很少，而Ex-4增加了CXCR4蛋白水平，在20 nM Ex-4时达到最大值(图4A). 此外，细胞内CXCR4表达水平上调导致细胞表面表达增加，Ex-4组的CXCR4阳性细胞数高于对照组（20 nM组为18.46±1.33%，正常组为1.31±0.32%，P（P） < 0.05,图4B). 然而，PI3K/Akt抑制剂预处理部分降低了CXCR4的细胞内表达和细胞表面表达(图4A、B)，表明Ex-4处理的MSC中CXCR4的上调可归因于PI3K/Akt途径。

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图4

Ex-4通过PI3K/Akt改善了MSC中CXCR4的表达和迁移。

(A类)通过western blotting分析Ex-4（0–20 nM）处理24 h后CXCR4的表达。(B类)用流式细胞术定量测定CXCR4的表达。图上的值代表了一个实验。(C类)采用跨孔分析法分析MSC对SDF-1的迁移反应。(D类)用Ex-4或不使用Ex-4刺激MSC后，进行创伤愈合试验以检测细胞运动。棒材，50μm*P（P）与对照组相比<0.05；^#P（P） < 0.05与Ex-4组相比；LY，LY294002；AMD，AMD3100。

为了确定MSC中CXCR4表达的改变是否会导致迁移能力的增强，我们进行了transwell测定，以研究Ex-4处理的MSC的化学吸引反应。如所示图4C，将MSC暴露于Ex-4 24小时，导致更多细胞以浓度依赖的方式通过插入膜移位，表明CXCR4表达较高的MSC具有更强的迁移反应。相应地，PI3K/Akt的抑制导致位于下腔室的细胞减少，这表明Ex-4下增强的化学吸引反应是PI3K/Akt依赖性的。创伤愈合试验也支持上述结果，即Ex-4通过PI3K/Akt促进MSC运动(图4D). 我们还发现，阻断SDF-1/CXCR4与AMD3100的相互作用完全消除了MSC的迁移反应，表明SDF-1/CXCR4对MSC迁移是必要的。

Ex-4和Akt在H中的作用₂O（运行）₂-诱导MSC凋亡

我们以前的研究表明，Ex-4保护脂肪间充质干细胞免受氧化损伤，PI3K/Akt参与Ex-4的抗凋亡作用²⁶然而，Ex-4对MSC凋亡的影响及其机制尚不清楚。在我们的实验条件下，H₂O（运行）₂诱导MSC凋亡。我们发现H中约25.01±2.48%的细胞₂O（运行）₂组为Annexin V⁺/PI公司⁻然而，H的浓度依赖性显著逆转₂O（运行）₂-诱导性膜联蛋白V⁺/PI公司⁻当用Ex-4（Ex-4 1nM，20.25±1.84%；5毫微米，16.51±1.51%；10nM，13.68±2.16%；20 nM，6.51±0.95%；P（P） < 0.05与H₂O（运行）₂；图5A、C)表明Ex-4消除了H的作用₂O（运行）₂早期凋亡（Annexin V⁺/PI公司⁻). 然而，Ex-4对晚期凋亡（Annexin V⁺/PI公司⁺；P（P）>0.05与H₂O（运行）₂)或坏死（Annexin V⁻/PI公司⁺；P（P）>0.05与H₂O（运行）₂). 此外，氧化应激引起的DNA损伤不可避免地会导致细胞凋亡或死亡。因此，TUNEL分析用于确认DNA片段的存在(图5B、D). 分析表明，TUNEL的浓度依赖性下降⁺当MSC在H之前暴露于Ex-4时的细胞₂O（运行）₂此外，由于caspase3的激活代表了凋亡过程中的一个重要步骤，我们评估了caspase2的活性。结果表明，胱天蛋白酶3的活性在H₂O（运行）₂但在用Ex-4预处理MSC时有所下降(图5E). 用LY294002预处理阻断Akt导致Ex-4对H的保护作用₂O（运行）₂-治疗后MSC消失，凋亡细胞数量增加，caspase3活性升高。这些结果表明，Akt对Ex-4在H₂O（运行）₂-诱导MSC死亡。

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图5

PI3K/Akt参与Ex-4在氧化应激下对MSC的抗凋亡作用。

用Ex-4（0–20 nM）预处理MSC 24 h，然后用0.3 mM h孵育₂O（运行）₂Annexin V/PI证实细胞凋亡(A类,C类)和TUNEL染色(B类,D类). (E类)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3活性测定。^¥P（P） < 0.05与对照组*P（P）<0.05与H₂O（运行）₂组；^#P（P） < 0.05 vs.Ex-4组；LY，LY294002。

作者感谢解放军总医院基础医学研究所和心脏病实验室的帮助。本研究得到了国家863高技术研发计划（No.2011AA020101）和国家自然科学基金（No.8127018681400229）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备中没有任何作用。