RNA处理蛋白FUS的突变导致家族性肌萎缩侧索硬化6型

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）由于大脑和脊髓中运动神经元的退化而导致进行性肌无力。平均发病年龄为60岁，年发病率为1至2‰。症状出现后平均3年发生呼吸衰竭死亡(1). 常染色体显性家族性ALS（FALS）在临床和病理上与散发性疾病（SALS）无法区分，约占病例的10%(2). 有三个基因与经典FALS有着可靠的联系：SOD1标准，编码CuZn超氧化物歧化酶（SOD1）(ALS1型OMIM 105400）(三)；ANG公司，编码血管生成素(4-6); 和TARDP公司，编码TAR DNA结合蛋白TDP-43(ALS10型OMIM 612069）(7). 20%的FALS和5%的SALS病例检测到SOD1突变(三,8). 转基因突变人SOD1的小鼠由于功能毒性增强而发生选择性运动神经元变性(9)这不是细胞自主的(10)与多重抗洗涤剂细胞质突变SOD1聚集体有关(11). 约90%的ALS患者的运动神经元和部分额颞叶痴呆（FTLD）患者的皮层神经元的核周中检测到泛素化TDP-43内含物(12,13). 14个错义TDP-43突变现已与ALS相关，除一个外，其余均位于C末端结构域(7,14-16).

此外，个别FALS家族与染色体18q有关(ALS3型，OMIM 606640）(17)和20p（ALS7，OMIM 608031）(18)而ALS和FTLD的多个家系与9q染色体相关（FTD/ALS1 OMIM 105550）(19)和9p（ALSFTD2，OMIM 611454）(20-22). 我们之前将一个大的多代英国血统（F1）与16号染色体上的42-Mb区域联系起来，多点lod评分（连锁优势比的对数）为3.85（ALS6 OMIM 608030）(23). 当另外两名患者发展为ALS时，我们使用10K单核苷酸多态性（SNP）阵列重复全基因组扫描。这证实了与包含400多个基因的保守单倍型16号染色体的连锁(图S1). 使用候选基因方法，我们对32个基因的279个外显子进行了测序，并表达了序列标签（EST）和10个非编码RNA(表S1和S2). 在我们检测到TARDBP公司，我们对连接区域中包含相似结构域的六个基因进行了优先排序。在保险丝（也称为脂肪肉瘤或TLS公司)来自F1家族的先证者(图S2A). 这种变化预计会导致精氨酸在521位（R521C）被半胱氨酸取代，该位置位于蛋白质C末端的高度保守区域(图S2、B和C). 1561C>T（R521C）突变存在于F1所有六个受影响成员的DNA中，并与连锁单倍型共分离(图1A).

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图1

在五个显性ALS家族中，FUS突变与疾病分离。受影响的个人用黑色符号表示，未受影响的人用开放符号表示。斜线符号表示已故人员。星号表示可以获得DNA的受影响个体。所有接受检测的受影响个体都携带了其家族的突变。出于保密原因，未受影响个体的性别、出生顺序和突变状态被省略。

为了确定FALS中FUS突变的频率，我们筛选了197个指数的FALS病例，其中SOD1、VAPB、ANG、Dynactin、CHMP2B、和TARDBP公司已排除突变。我们在另外四个家族中发现了相同的R521C突变，包括来自一个家族的三名受影响个体（ALS53）(图1B)以及另外三个指数FALS病例。此外，我们发现了一种不同的碱基对变化，这种变化预计会导致精氨酸到组氨酸的取代，也发生在521位（1562 G>a，R521H）(图S2、A至C). R521H突变在两个与疾病分离的家族中被发现（F1015和ALS156）(图1、C和D)和一个索引案例。在第14外显子中发现了第三个突变，预测该突变将导致514位精氨酸到甘氨酸的替换（1540 A>G，R514G）(图S2、A至C). 这是在F1083家系的两名受影响成员中检测到的(图1E). 在其他FALS病例的外显子1至13中未检测到突变。的外显子14和15保险丝对400名年龄、性别和种族匹配的对照组进行测序，未检测到突变。英国和澳大利亚SOD1阴性病例中FUS突变的频率约为4%（相当于所有FALS病例的3%）。

在20名FUS突变的个体中，有足够的信息来定义临床表型。性别分布均匀（9男11女），平均发病年龄44.5岁(n个=20），平均生存期为33个月(n个= 18). 发病部位为宫颈(10)，腰部(5)和球杆(三). 没有受影响的个体出现认知缺陷。FUS的三个案例_R521C型和FUS_521H兰特对突变进行了详细的神经病理学检查。所有病例均显示脊髓中较低的运动神经元严重缺失(图2O)脑干中的神经元数量较少，而背角神经元似乎未受影响。有证据表明，脊髓背柱有轻度髓鞘丢失，但只有一例皮质脊髓束苍白。运动皮层有轻度到中度的上部运动神经元丢失。脊髓前角运动神经元中的泛素和p62免疫阳性骨骼样细胞质内含物是典型ALS的标志，非常罕见，神经元和胶质细胞的细胞质和细胞核中没有TDP-43阳性内含物。FUS抗体标记的脊髓运动神经元和营养不良轴突中所有三例具有FUS突变的ALS患者的大球状和细长细胞质内含物(图2，A至F和O). 这些在正常对照个体中不存在(图2、G、H和M)、SOD1突变型ALS病例(图2、I和J)和散发的ALS病例(图2、K、L和N).

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图2

患有以下疾病的患者保险丝突变在下部运动神经元中形成细胞质FUS免疫反应性内含物。FUS突变患者脊髓前角（虚线）内FUS免疫标记物的抗体(A类到F类和箭头O（运行）). 控件中的着色(G公司,H（H）、和M（M）)，突变型SOD1 FALS(我和J型)和SALS(K（K）,L（左）、和N个)显示弥散核染色（箭头），强度可变，无夹杂物。比例尺，12μm[（A）至（L）]，50μm[[（m）至（O）]。

为了评估这些突变的功能重要性，我们瞬时表达了N-末端血凝素（HA）标记的野生型FUS（FUS_重量)和两个突变体（FUS_R521C型和FUS_521H兰特)CV-1和N2A细胞系以及大鼠皮层神经元。未转染细胞中内源性FUS染色表明，该蛋白主要定位于细胞核。转基因细胞显示FUS的细胞质定位增加_R521C型和FUS_521H兰特用免疫荧光标记和免疫印迹法将蛋白质与野生型进行比较(图3).

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图3

FUS突变导致亚细胞定位错误。(A类和B类)内源性FUS转染野生型（HA-FUS）的亚细胞定位_重量)和FUS突变体（HA-FUS_R521C型、HA-FUS_521H兰特)免疫荧光法在CV-1细胞（A）和大鼠皮层神经元（B）中测定。具有代表性的CV-1细胞的质膜（A，黄色虚线）和细胞核（A，红色虚线）在相位对比（A，左侧面板）和相应的FUS免疫荧光图像（A，右侧面板）上进行了概述。显示了具有代表性的皮层神经元的核二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色（B，左面板）、FUS免疫荧光（B，中面板）和覆盖层（B，右面板）。比例尺，25μm（A），10μm（B）。(C类)与野生型和内源性相比，突变型FUS细胞质中显示FUS染色的CV-1细胞（上部面板）和皮层神经元（下部面板）的百分比显著增加。通过单向方差分析确定统计显著性(P（P）CV1和神经元<0.0001），然后进行Bonferroni多重比较试验（*，P（P）< 0.05; ***,P（P）<0.001). (D类)FUS突变体的细胞溶质分数显著增加。FUS转染N2A细胞_重量、FUS_R521C型、和FUS_521H兰特分离为细胞溶质和核组分，通过HA免疫印迹抗体密度测定法测定转染FUS的数量（平均值±SEM，n个= 3). 用抗SOD1（胞浆）抗体和抗组蛋白H3（细胞核）抗体测定组分的纯度，并在总细胞裂解液中比较转染效率。通过Wilcoxon符号秩检验（*，P（P）< 0.05).

FUS是一种广泛表达的蛋白质，主要是核蛋白，参与DNA修复和转录调控、RNA剪接，并输出到细胞质。N末端有一个转录激活域，在染色体易位后，该转录激活域产生可导致尤因肉瘤和急性髓系白血病的融合蛋白(24). C末端包含RNA识别基序（RRM）、富含Arg-Gly-Gly（RGG）重复序列和参与RNA处理的锌指结构域。FUS与运动蛋白驱动蛋白（KIF5）结合(25)和肌球蛋白-Va(26)参与mRNA转运；值得注意的是，轴突运输缺陷是ALS的病理特征(27).

TDP-43 C末端结构域的突变与ALS有关(7,14-16)与定位错误和包涵体形成有关，与FUS突变几乎完全平行。就TDP-43蛋白病而言，尚不清楚疾病是由于功能的毒性增加还是丧失。尽管毒性可能是错误折叠的蛋白质压倒蛋白质监测机器的结果，但含有内含物的神经元细胞核中TDP-43的丢失提供了间接证据，证明核RNA处理可能受损。同样，细胞质聚集体的存在可能导致蛋白质和/或RNA在细胞质中的螯合，对皮层和运动神经元造成选择性毒性。突变型FUS ALS病例中TDP-43内含物的缺失意味着FUS疾病途径独立于TDP-43聚集。对这两种功能相关蛋白如何导致神经退行性变的探索，将为ALS发病机制提供新的见解。

补充材料

致谢

脚注

参考文献和注释