为了确定脑膜免疫细胞再循环的途径，我们调查了脑膜间隙和占据这些间隙的免疫细胞。首先，开发了一种完整的分离小鼠脑膜制剂()内皮细胞免疫组织化学染色()，T细胞()和表达MHCII的细胞（扩展数据). 这些细胞的标记显示免疫细胞在整个脑膜隔室中的分配受到限制，在硬脑膜窦附近发现高浓度的细胞(;).
脑膜T细胞的消融分布和邻近硬脑膜窦表达Lyve-1的血管的鉴定一.硬脑膜全山解剖示意图。（SSS：上矢状窦；TS：横窦）b条CD3e标记在整个脑膜中的代表性图像（比例尺=2000μm）。b条ii（ii）–b个三。中突出显示的框的放大倍数更高b条我（比例尺=90μm（bii（ii）)或150μm（b三)).c（c）全山脑膜冠状断面示意图。d日.整个脑膜嵴冠状切面的代表性图像（比例尺=200μm）。e（电子）全脊膜冠状切片中CD3e和CD31免疫标记的代表性图像。比例尺=100μm。e（电子）ii（ii）。中突出显示的框的放大倍数更高e（电子）我（比例尺=30μm）。（f）.鼻窦T细胞百分率的定量与上矢状窦腔（平均值±SEM；n=从3只独立动物分析的18个视野；***p=0.0008，Mann-Whitney试验）。克上矢状窦周围CD3e和MHCII表达细胞的代表性图像（此处和其他地方的脑膜卡通描绘了所呈现图像的位置；比例尺=50μm）。克ii（ii）。中突出显示的框的放大倍数更高克我（比例尺=10μm）。克三CD3和MHCII表达细胞的高倍放大（比例尺=10μm）。小时上矢状窦周围CD31和CD3e标记的代表性图像（标尺=30μm）。我.量化窦周CD31中每毫米血管的T细胞数量+血管和直径相似的脑膜血管（平均值±SEM；n=3只动物；*p=0.05；单尾Mann-Whitney试验）。j个完整脑膜上Lyve-1标记的代表性图像（比例尺=1000μm）。k个高倍放大表达Lyve-1的血管（比例尺=70μm）；箭头表示Lyve-1+巨噬细胞。l、。上矢状窦冠状切面CD31和Lyve-1标记的代表性图像（比例尺=70μm）。米我高倍放大显示Lyve-1阳性血管呈导管状结构（比例尺=50μm）。米ii（ii）Lyve-1放大倍率更高+面板中显示的容器米我; 箭头指向血管的内腔。
硬脑膜窦将来自大脑内外静脉的血液排入颈内静脉。检查窦周围T淋巴细胞的准确定位，以排除不完全心内灌注导致伪影的可能性。硬脑膜冠状切面(CD3e（T细胞）和CD31（内皮细胞）染色。事实上，鼻窦附近的绝大多数T淋巴细胞都是清白的(). 为了证实这一发现，小鼠在处死前静脉注射DyLight 488凝集素或荧光抗CD45抗体，并确认其白蛋白定位()并量化(). 出乎意料的是，一部分T细胞（和表达MHCII的细胞）沿鼻窦在CD31表达结构中呈线性排列（只有少数细胞在直径相似的脑膜血管中明显存在），这表明这些鼻窦周围血管具有独特的功能().
除了心血管系统外，淋巴管是人体内一个独特而突出的血管系统7,8根据我们的观察结果，对窦周血管进行了与淋巴管内皮细胞（LEC）相关的标记物检测。对成年小鼠的全脑膜进行LEC标记物Lyve-1的免疫染色。发现2到3条表达Lyve-1的血管平行于硬脑膜窦(). 对标记有Lyve-1和内皮细胞标记物CD31的冠状切片的分析表明，Lyve-1血管位于窦旁()并表现出明显的管腔(). 牺牲前静脉注射DyLight 488凝集素证实这些Lyve-1+血管不属于心血管系统(,补充视频1).
通过评估几种经典LEC标记物的存在，进一步探讨了窦周血管的淋巴特征。在Lyve-1中确实可以检测到主要LEC转录因子Prox1的表达+野生型小鼠血管双重免疫染色()以及在Prox1启动子（Prox1）下表达tdTomato（tdT）的转基因小鼠中tdT公司;). 与外周淋巴管相似，Lyve-1血管也表达足蛋白(,)和血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）(,). 注射VEGFR3特异性重组VEGF-c到大池后7天进行检查时，脑膜淋巴管直径增加(,)，提示VEGFR3在脑膜LEC中的功能作用。最后，通过流式细胞术证实脑膜中存在LECs；a CD45–CD31型+肾小球足突细胞膜黏蛋白+在硬脑膜中检测到细胞群（LECs），与皮肤和膈膜中的细胞群相似(). 我们在人类硬脑膜（Lyve-1）中发现了一个潜在的相似结构+肾小球足突细胞膜黏蛋白+CD68型–;)，但还需要进一步研究，以全面评估和表征脑膜淋巴管在人类中枢神经系统中的位置和组织。
脑膜淋巴管的分子和结构特征a。Lyve-1细胞核Prox1表达的典型图像+Prox1硬脑膜窦内的血管tdT公司小鼠（比例尺=10μm）。b。硬膜窦上足平面蛋白和Lyve-1标记的代表性图像（比例尺=40μm）。c。硬脑膜窦VEGFR3和Lyve-1染色的代表性图像（比例尺=20μm）。d–e。成年小鼠静脉注射4μg rhVEGF-c（Cys156Ser）或PBS（大池）。注射后7天和14天采集脑膜。d。注射后第7天脑膜Lyve-1和Prox1标记的代表性图像（比例尺=30μm）。e、。脑膜淋巴管直径的量化（平均值±SEM；每组4只小鼠；*p<0.05双向方差分析和Bonferroni事后检验）。f–g.硬脑膜窦上平滑肌细胞（α-平滑肌肌动蛋白；α-SMA）和Lyve-1标记的代表性图像（标尺=50μm（g）或20μm（h））。小时脑膜淋巴管的典型低倍显微照片（透射电镜）（比例尺=5μm）；小时ii（ii）。中突出显示的框的放大倍数更高小时我; 黄色箭头-基底膜；红色箭头-锚定纤维（胶原纤维）；绿色箭头–细胞连接。
存在两种类型的传入淋巴管-初始和收集。黏附分子的表达模式在解剖学上存在差异（即周围平滑肌细胞和淋巴管的存在与否）7,9,10以及允许流体和细胞进入9与窦相反，脑膜淋巴管缺乏平滑肌细胞(). 此外，脑膜淋巴管对免疫细胞趋化蛋白CCL21也呈阳性反应11,12(). 与显示Claudin-5和VE-cadherin连续模式的血管不同，脑膜淋巴管显示这些分子的点状表达模式，类似于膈淋巴管9(). 此外，整合素-α9的表达是淋巴阀的特征13在脑膜淋巴管上未发现，但在皮肤淋巴网络中很容易检测到(). 总之，这些发现表明脑膜淋巴管具有初始淋巴管的解剖学和分子特征。此外，全脊膜的电子显微镜显示了典型的超微结构特征14淋巴管的基底膜不连续，被锚定丝状物包围(,).
脑膜淋巴管具有许多与外周淋巴管相同的属性，但其总体组织和分布具有某些独特的特征。脑膜淋巴网络似乎从双眼开始，并在嗅球上方追踪，然后与鼻窦相邻对齐(补充视频2). 与横膈膜相比，脑膜淋巴网络覆盖的组织较少，并形成由较窄血管组成的不太复杂的网络(;补充视频2). 横窦中的血管比上矢状窦中的血管更大、更复杂(). 血管网络的差异可能是由于血管所处的环境造成的，与周围组织的间质液压力相比，中枢神经系统的脑脊液压力较高，这可能会影响血管的分支，也会限制血管的扩张。
接下来，检查脑膜淋巴管携带脑膜/CSF液体和细胞的功能能力。麻醉的成年小鼠同时在侧脑室注射荧光素和荧光示踪染料（QDot655），然后通过薄颅骨进行多光子显微镜成像。充满QDot655而非荧光素的血管沿上矢状窦排列(;补充视频3)表明非心血管血管会排出脑脊液。除了上述脑脊液通过蛛网膜颗粒渗入硬脑膜窦外，还可能发生脑脊液流入脑膜血管的情况15,16(). 静脉注射alexa488-结合的抗Lyve-1抗体标记脑膜淋巴管(;补充视频4). 此外，静脉注射QDot655和alexa488偶联的抗Lyve-1抗体表明，脑膜淋巴管确实充满了QDot655，因此正在排出CSF(). QDot655填充淋巴管的成像显示，与邻近血管相比，脑膜淋巴管的流速较慢，但流向相似(补充视频5)类似于在CNS外部观察到的情况17.
脑膜淋巴管的功能特征a–d成年小鼠上矢状窦的典型z堆叠，静脉注射荧光素（i.v.），脑室注射QDot655（n=3只小鼠）。a–b低倍图像显示脑膜血管和上矢状窦的荧光素标记。相反，QDot655标记在窦周血管中很明显。c–d。面板a和面板b中显示了z堆叠的冠状截面（比例尺=20μm c–d）。e、。通过静脉注射QDot655和alexa488-结合抗Lyve-1抗体的小鼠CSF填充血管的代表性z堆叠（n=3只小鼠；标尺=30μm）。（f）我脑膜中CD3e和MHCII以及Lyve-1免疫标记的代表性图像（比例尺=15μm）。（f）ii（ii）脑膜淋巴管三维重建的代表性图像，显示CD3e和MHCII表达细胞的管腔定位（比例尺=20μm）。克–小时。成年小鼠经静脉注射5μl 10%伊文思蓝。注射后30分钟分析颈浅淋巴结（g）和颈深淋巴结（h）（n=5只小鼠）；白色箭头表示淋巴结（g–h）；黄色箭头表示颈内静脉附近出现的埃文斯蓝填充血管进入颈深淋巴结（h）。i–j。引流至颈深淋巴结的收集血管（h中的黄色箭头）被结扎或假手术。结扎后8小时，收集脑膜并对Lyve-1进行免疫标记。结扎和假手术小鼠横窦Lyve-1免疫标记的代表性图像（i；比例尺=30μm）。点图表示脑膜淋巴管直径的测量值（j；平均值±SEM；2个独立实验中每组5只小鼠；*p=0.031；Mann-Whitney试验）。
经典的淋巴管，除了排出间质液体外，还允许细胞从组织流向排出的淋巴结18因此，我们检查了脑膜淋巴管是否能够携带白细胞。全脊膜的免疫组织化学分析显示，约24%的鼻窦T细胞和约12%的鼻窦MHCII+在这些血管中发现了细胞(,). 此外，CD11c+电池和B220+幼年小鼠的脑膜淋巴管中也发现了细胞().
脑脊液的细胞和可溶性成分已被证明在颈部淋巴结中引发免疫反应19–22他们建议的路径是通过筛板进入鼻粘膜内的淋巴管23为了确定脑膜淋巴管是否与颈深淋巴结直接连通，我们给小鼠注射伊文思蓝静脉注射，并在两小时内检查外周淋巴结是否存在染料。注射30分钟后，如预期的那样，在脑膜淋巴管和窦中检测到埃文斯蓝()并且还流入颈深淋巴结（dCLN）()而不是浅表淋巴结。在随后的时间点，伊文思蓝也出现在浅表淋巴结中（数据未显示）。在测试的时间点，周围非淋巴组织中几乎没有发现埃文斯蓝。有趣的是，直接注入鼻粘膜30分钟后，dCLN中未检测到伊文思蓝()这表明脑膜淋巴管而非鼻粘膜淋巴管是在此时间段内CSF衍生的可溶性和细胞成分排入dCLN的主要途径。
dCLN的切除影响了脑膜的T细胞室，导致脑膜T细胞数量增加(). 这可能是由于T细胞无法从脑膜间隙排出，这与脑膜和dCLN之间的直接联系一致。为了进一步证明这种联系，我们结扎了流入dCLN的淋巴管()给小鼠静脉注射埃文斯蓝。结扎小鼠的dCLN中没有明显的Evans蓝蓄积，而假手术对照组的染料蓄积则相反(). 此外，观察到脑膜淋巴管直径增加(;)类似于外周组织中观察到的淋巴水肿24这些结果进一步表明脑膜淋巴管和dCLN之间存在物理联系。
几十年来，将CSF引流到外周一直是人们感兴趣的主题，关于CSF如何离开CNS，已经描述了几种途径25,23新发现的脑膜淋巴管是脑脊液引流的新途径，代表了免疫细胞离开中枢神经系统的更传统途径。我们的发现可能代表了间质液体通过最近发现的glymphatic系统排入脑脊液后，从脑实质向周围引流的第二步26,27().
中枢神经系统中存在功能性和经典性淋巴系统，这表明应重新审视当前有关大脑耐受性和大脑免疫特权的教条。脑膜淋巴管功能障碍可能是多种神经系统疾病的根本原因，其中免疫功能改变是一个基本因素，如多发性硬化症、阿尔茨海默病和一些与神经系统疾病相关的原发性淋巴水肿28–30.
方法
动物
男性和女性C57Bl/6型,节点。Cd11c-YFP公司和探头1tdT公司小鼠从Jackson Laboratories购买，并被安置在温度和湿度控制的房间中，保持12h/12h的光/暗循环（早上7:00亮）。所有菌株都保存在相同的外壳条件下。所有程序均符合弗吉尼亚大学动物护理和使用委员会的规定。本研究仅使用成年动物（8至10周）。样本量是根据之前公布的类似实验选择的。选择来自同一实验组不同笼子的动物以确保随机化。对于所有实验，研究人员从牺牲时间到分析结束都是盲目的。
人体样本
包括上矢状窦在内的人类硬脑膜尸检标本来自弗吉尼亚大学病理和神经外科。所有样本均来自同意使用其身体进行研究和教学的患者（通过弗吉尼亚州里士满的弗吉尼亚解剖委员会）。将所有获得的样品固定并保存在10%福尔马林溶液中较长时间。
脑膜免疫组织化学
通过腹腔内注射尤索尔（Euthasol）对小鼠实施安乐死，并灌注0.1M PBS 5分钟。将皮肤从头部移除，肌肉从骨骼中剥离。在去除下颌骨和颅骨从嘴到上颌骨后，用手术剪刀去除颅骨顶部。在PBS中用2%多聚甲醛（PFA）在4°C下放置24小时，或在1:1乙醇：丙酮溶液中放置20分钟，在−20°C下，根据抗体的不同，将整个脑膜固定在颅盖上。然后从颅骨上解剖硬脑膜/蛛网膜。为了分析软脑膜，从颅骨中提取的大脑被快速冷冻，并使用冷冻器（徕卡）切下40μm厚的横切面。将脉络丛从非固定脑的脑室中分离出来，用2%PFA在PBS中固定24h。在对整个山脊膜进行冠状切片时，在解剖前将100μl基质凝胶（康宁）注入硬脑膜窦。从颅盖骨上解剖脑膜（硬脑膜/蛛网膜），快速冷冻，用冷冻器切割10μm厚的切片，并将切片放在涂有明胶的载玻片上。
用含有2%正常血清（山羊或鸡）、1%牛血清白蛋白、0.1%Triton-X-100和0.05%吐温20的PBS在室温（RT）下孵育整个坐骑和切片1h，然后用适当稀释的主要抗体孵育：抗CD31（eBioscience，clone 390，1:100）；抗CD3e（eBioscience，克隆17A2，1:500）、抗MHC II（eBioscience、克隆M5/114.15.2，1:500，抗VE-Cadherin（eBioscience，克隆BV13 1:100）、抗Claudin-5（Molecular Probes，352588，1:2000）、抗CCL21（R&D Systems，AF457，1:100），抗整合素-α9（R&D Systems，AF3827，1:100，）、抗B220（eBioccience），克隆RA3-6B2，1:100。然后在PBS中RT条件下将整个坐骑和切片清洗3次，持续5分钟，然后用Alexa-fluro 488/594/647鸡/羊抗兔/羊IgG抗体（Invitrogen，1:1000）或PE/Cy3结合链霉亲和素（eBioscience，1:100）在PBS的RT条件下与1%BSA和0,5%Triton-X-100孵育1小时。在1∶10 000 DAPI试剂中5分钟后，用PBS洗涤整个支架和切片，并在盖玻片下用Aqua mount（Lerner）安装。在预吸收实验中，在染色之前，将抗VEGFR3和抗足蛋白抗体分别与重组小鼠VEGFR三（743-R3-100，R&D Systems）或重组小鼠足蛋白（3244-PL-050，R&D-Systems）以1:10 O/N的浓度比在4°C的含有1%BSA和0.5%Triton-X-100的PBS中孵育。
对于人体样本，福尔马林固定的上矢状窦被切割成2 mm厚的切片，并在含有4%PFA的PBS中固定过夜（O/N）。然后将组织包埋在OCT中，并在低温恒温器（Leica）上将10μm厚的切片切片到明胶涂层的载玻片上。通过将载玻片在80°C、pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液中孵育20分钟来进行抗原回收。用PBS洗涤后，用3%H的PBS孵育30分钟来阻断内源性生物素2哦2然后将载玻片在含有2%正常山羊血清、1%牛血清白蛋白、0.1%Triton-X-100和0.05%吐温20的PBS中封闭1小时。然后在4°C的O/N温度下用抗Lyve-1（ab36993，Abcam，1:200）、抗足蛋白（HPA007534，Sigma-Aldrich，1:2000）或抗CD68（HPA048982，Sigma-Aldrich，1:1000）孵育载玻片在PBS中用1%BSA和0.5%Triton-X-100稀释。然后在PBS中RT冲洗切片3次，每次5分钟，然后在RT中用生物素结合的山羊抗兔抗体（Jackson Immunoresearch，1:1000）孵育1小时，然后用ABC试剂盒溶液（VECTASTAIN，Vector Labs）在RT中孵育30分钟。然后将载玻片与过氧化物酶底物DAB（Sigma-Aldrich）孵育几分钟，用苏木精复染，脱水，并将其安装在Cytoseal 60（Thermo Scientific）盖玻片下。对9份人体样本进行了标记和分析；其中两个淋巴管结构被确认。
图像分析
使用LAS AF软件通过徕卡TCS SP8共焦系统（徕卡微系统）采集图像。对于整个支架的图像，使用10倍物镜和0.25 NA采集图像。其他共焦图像使用20倍物镜（0.70 NA）或40倍油浸物镜（1.30 NA）采集。所有图像均使用512×512像素分辨率和4μm z步长采集。使用FIJI软件（NIH）进行定量评估。通过计算窦区管腔定位的T细胞数量来确定管腔T细胞的百分比。T细胞密度通过T淋巴细胞数量除以脑膜面积来确定。Prox1阳性细胞密度通过将Prox1细胞核的数量除以淋巴管的面积来定义。使用GraphPad Prism软件进行统计分析。每项实验的具体统计检验见正文。使用Grubbs检验剔除异常样本，显著性水平为0.01（仅适用于rh-VEGF-c实验）。未估计各组之间的差异。
电子显微镜
如前所述采集脑膜，并将其固定在2.5%戊二醛、2%多聚甲醛和0.1M碳酸钠缓冲液中，pH值为7.4，然后将其固定于2%四氧化锇和0.15%亚铁氰化钾的0.1M碳酸缓冲液中。在缓冲液中冲洗后，通过一系列分级乙醇将组织脱水成环氧丙烷，渗透并嵌入环氧树脂中，并在70°C O/N下聚合。半薄切片（0.5微米）用甲苯胺蓝染色以进行光学显微镜检查。超薄切片（80nm）被切割（孟菲斯大学综合显微镜中心），并使用Tecnai TF20 TEM和AMT XR41相机进行成像(; 孟菲斯大学综合显微镜中心）或使用Tecnai F20 TEM和UltraScan CCD相机(; 弗吉尼亚大学高级显微镜核心）。
多光子显微
小鼠经静脉注射氯胺酮/甲苯噻嗪进行麻醉，并经静脉（大池）注射5μl QDot655（Invitrogen）或5μl Alexa488-结合抗Lyve-1抗体（ALY7，eBioscience）。小鼠静脉注射25μl 10%荧光素钠盐（Sigma-Aldrich）或5μl QDot655（Invitrogen）。通过薄薄的颅骨标本对脑膜淋巴管进行成像。监测小鼠的核心温度，并将其保持在37°C。使用配备变色龙Ultra II可调谐钛宝石激光器（相干）的徕卡TCS SP8多光子显微镜系统（徕卡微系统）进行成像。以880 nm的激发波长激发GFP和QDot655。使用25×浸水物镜和0.95 NA和外部HyD非去色探测器（徕卡微系统）获得图像。通过随时间从x、y和z平面获得图像来收集四维成像数据。使用Imaris软件（Bitplane）对结果图像进行分析。
血管室标记
为了评估窦T细胞的腔外定位，在安乐死前1小时，给小鼠静脉注射10μg FITC偶联的抗CD45抗体（eBioscience，克隆30-F11）或对照同种型。为了评估脑膜淋巴管不是心血管系统的一部分，在安乐死前5分钟向小鼠注射100μl DyLight 488番茄红素凝集素（Vector Laboratories）。
体内VEGFR3激活
小鼠经静脉注射4μg rh-VEGF-c（Cys156Ser，R&D Systems）或PBS。注射后7天和14天采集脑膜。
伊文思蓝注射液和检测
小鼠通过静脉注射氯胺酮/甲苯噻嗪进行麻醉，然后将5μl 10%伊文思蓝（Sigma-Aldrich）静脉注射到大池或鼻内。注射30分钟后，用一氧化碳对小鼠实施安乐死2解剖中枢神经系统引流淋巴结以评估伊文思蓝含量。采集硬脑膜，用共焦显微镜分析Evans Blue定位。埃文斯蓝的强度是使用FIJI的曲线图函数测量的。
脑膜流式细胞术分析
用0.1M PBS灌流小鼠5分钟。头部被移除，头骨很快被剥离。下颌骨以及所有颅骨材料从嘴到上颌骨都被切除。手术剪刀用于移除颅骨顶部，顺时针方向切割，开始和结束于右鼓室后钩下方。使用Dumont#5镊子（精细科学工具）从颅骨内部和大脑表面小心取出脑膜（硬脑膜、蛛网膜和软脑膜）。用无菌塑料柱塞（BD Biosciences）将脑膜轻轻压过70μm尼龙网细胞过滤器，得到单细胞悬浮液。为了分离淋巴管内皮细胞，将脑膜（连同膈膜和耳部皮肤）在0.41U/ml Liberase TM（Roche）和60U/ml DNAse1中消化1h。然后在280℃下离心细胞克在4°C下保持10分钟，去除上清液，并将细胞重新悬浮在冰镇FACS缓冲液中（pH 7.4；0.1M PBS；1mM EDTA:1%BSA）。用CD45-PacificBlue（BD Bioscience）、CD45-PE-Cy7或eFluor 450（eBioscision）、TCRβ-Alexa780（eBioccience”）、CD4-Alexa488（eBios）、CD8-PerCPCy5.5（eBiologies）、CD44-APC（eBioscience，CD31-Alexa647（电子生物科学）、B220-PE（电子生物科技）、CD19-BB515（BD生物科技）。除淋巴管内皮细胞鉴定实验外，所有细胞均固定在1%PFA中，0.1M pH 7.4 PBS。使用CyAn ADP高性能流式细胞仪（Dako）或Gallios（Beckman Coulter）收集荧光数据，然后使用Flowjo软件（Treestar）进行分析。为了获得准确的细胞计数，使用正向和侧向散射的高度、面积和脉冲宽度对单个细胞进行选通，然后根据制造商的说明使用live/DEAD固定死细胞染色试剂盒（Invitrogen）选择活细胞。然后对细胞进行门控，以获得适当的细胞类型标记(,). 实验在每组3只小鼠的脑膜上进行。使用Excel进行数据处理，并使用GraphPad Prism进行统计分析。
颈深淋巴结切除、结扎和假手术
用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉8周龄小鼠，剃去颈部，用碘和70%乙醇清洁，并在眼睛上涂上眼药水以防止干燥。在锁骨上方5毫米的中线处切开。将胸锁乳突肌（SCM）缩回，并用镊子取出颈部深淋巴结。在结扎实验中，使用尼龙缝合线（9-0 Ethilon black 6“VAS100-4）结扎颈部深淋巴结前面的收集淋巴管。假手术小鼠接受切口，SCM缩回，但未结扎或未切除淋巴结。然后缝合小鼠，让其在加热垫上恢复，直到有反应。术后，给小鼠饮用水镇痛：术后3天50mg/l，接下来2周0.16mg。
