抗血管生成剂二十二碳六烯酸（DHA）改变了乳腺癌细胞外显子介导的microRNA信号
, , , , ,和
贝萨尼·N·汉纳冯
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心病理学系，邮编73104
卡拉·J·卡彭特
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心病理学系，邮编73104
威廉·贝里
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心细胞生物学系，邮编73104
拉尔夫·扬克内特
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心细胞生物学系，邮编73104
Peggy和Charles Stephenson癌症中心，俄克拉荷马市，美国俄克拉何马州73104
威廉·杜利
美国俄克拉何马州俄克拉何马市俄克拉何马大学健康科学中心外科73104
佩吉和查尔斯·斯蒂芬森癌症中心，美国俄克拉何马城，邮编73104
魏群鼎
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心病理学系，邮编73104
Peggy和Charles Stephenson癌症中心，俄克拉荷马市，美国俄克拉何马州73104
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心病理学系，邮编73104
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心细胞生物学系，邮编73104
美国俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心外科，邮编73104
Peggy和Charles Stephenson癌症中心，俄克拉荷马市，美国俄克拉何马州73104
通讯作者。 2015年1月12日收到；2015年6月17日接受。
摘要
背景
二十二碳六烯酸（DHA）是一种具有抗癌和抗血管生成活性的天然化合物，目前正在研究其作为乳腺癌治疗的预防剂和辅助剂。然而，DHA抗癌活性的确切机制尚不清楚。据了解，癌细胞与其微环境之间的相互沟通对肿瘤血管生成至关重要。外泌体是细胞外小泡，是细胞间通讯的重要介质，在促进血管生成中发挥作用。然而，关于乳腺癌外泌体对肿瘤血管生成的作用，或外泌体能介导DHA的抗癌作用，人们知之甚少。
结果
用DHA处理后，从MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞中收集外显子。我们观察到DHA处理细胞的外体分泌和外体microRNA含量增加。DHA改变了MCF7外显子中83个microRNA的表达（>2倍）。已知最丰富的外体microRNA（let-7a、miR-23b、miR-27a/b、miR-21、let-7和miR-320b）具有抗癌和/或抗血管生成活性。在来自其他乳腺癌系（MDA-MB-231、ZR751和BT20）的外泌体中，DHA处理也增加了这些微小RNA，但在来自正常乳腺细胞（MCF10A）的外泌体中没有增加。当DHA处理的MCF7细胞与内皮细胞共同培养或将其外显体直接应用于内皮细胞培养时，我们观察到内皮细胞中这些microRNA的表达增加。此外，内皮细胞中miR-23b和miR-320b的过度表达降低了其促血管生成靶基因（PLAU、AMOTL1、NRP1和ETS2）的表达，并显著抑制内皮细胞形成管状物，表明外源体转移的微RNA介导了DHA的抗血管生成作用。这些作用可以通过敲除Rab GTPase，Rab27A来逆转，Rab23A控制外显子释放。
结论
我们的结论是，DHA可以改变乳腺癌外泌体的分泌和microRNA的含量，从而抑制血管生成。我们的数据表明，乳腺癌外显子信号可以靶向抑制肿瘤血管生成，并为DHA的抗癌作用提供新的见解，进一步支持其在癌症治疗中的应用。
电子辅助材料
本文的在线版本（doi:10.1186/s12943-015-0400-7）包含对授权用户可用的补充材料。
背景
二十二碳六烯酸（DHA，22:6）是一种长链ω-3多不饱和脂肪酸，是食用鱼油的主要成分，具有多种健康益处，包括抗癌活性[1,2]. DHA的抗癌特性已被证实在体外[三,4]和体内[5–7]. 重要的是，DHA对肿瘤细胞具有细胞毒性，对正常细胞几乎没有影响[三,8]. 目前，一些临床试验正在评估补充DHA对乳腺癌治疗和管理的作用（clinicaltrials.gov）。这些研究强调了DHA作为一种安全的预防剂和辅助治疗的潜在价值。
DHA的抗癌机制之一是抑制肿瘤血管生成。例如，通过乳腺癌裸鼠模型中的微血管计数测量，补充DHA的饮食抑制肿瘤血管生成[9]这一观察结果在一个同时喂食鱼油的小鼠乳腺肿瘤模型中得到了证实[10]. DHA的抗血管生成活性也在人类结肠癌模型系统中进行了描述[11]Fischer 344大鼠纤维肉瘤植入模型[12]人脐带静脉内皮细胞[13]. DHA如何抑制肿瘤血管生成的细胞机制尚不清楚。传统上，肿瘤细胞在缺氧条件下分泌的血管内皮生长因子（VEGF）被认为是肿瘤血管生成的关键调节因子，目前抑制肿瘤血管生成策略主要集中于靶向VEGF途径[14]. 然而，最近的研究表明，其他细胞信号分子，如外泌体，也可以介导肿瘤血管生成[15–17].
外泌体是小的（50–100纳米）小泡，最近被认为是细胞间通讯的重要介质。它们携带脂质、蛋白质、mRNAs和microRNAs，可以转移到受体细胞[18,19]. 肿瘤细胞比正常细胞分泌更多的外泌体[20]从而将肿瘤相关的信号分子转移到周围细胞[21–23]. 重要的是，分泌性外泌体中的microRNA可以转移到受体细胞，从而影响转录后基因调控[24]. 癌细胞衍生的microRNA可以通过外显体转移到内皮细胞，在内皮细胞中诱导促血管生成作用[15,16]. 这些研究强调了肿瘤衍生外泌体在肿瘤微环境和促进肿瘤血管生成中的作用。然而，关于乳腺癌外泌体的内容物和分泌物，或操纵或减少其对癌症进展的影响的方法，我们知之甚少。在这项研究中，我们试图确定DHA如何改变乳腺癌外泌体的分泌和含量，从而抑制肿瘤血管生成和进展，这可能有助于更好地了解乳腺癌生物学和针对乳腺癌治疗的细胞间通讯的新策略。
结果
DHA增加乳腺癌外泌体的小RNA含量
人乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞在添加了外泌体缺失血清的细胞培养基中培养3天，并用100μM DHA处理24小时。从DHA处理和未处理的MCF7细胞的条件培养液中收集整个外显体。外泌体被固定，并通过电子显微镜进行负染以进行可视化。我们在两个样品中都发现了典型的~100nm直径的外泌体（图)，（未显示MDA-MB-231外显体）。通过免疫金标记和电子显微镜成像（图)并通过蛋白质印迹（图). 从外泌体中分离出总RNA，并生成RNA图谱。我们发现，从MCF7外显体分离的RNA主要是小于1000 nt的小RNA，与细胞总RNA相比，通常不存在核糖体RNA（图). 这些观察结果与以前的报告类似[25,26]. 然而，在DHA处理的外体RNA样品中，我们观察到小RNA含量增加<200 nt（见图，右下面板）。这些结果表明，DHA增加了乳腺癌外泌体的小RNA含量。
乳腺癌细胞外泌体的分离和分子特征。一使用Exoquick试剂从对照或处理过的MCF7细胞（100μM DHA，24小时）的条件培养基中分离出外显体，将其固定、整体安装在涂布的Formvar网格上，用电子显微镜进行负染和可视化（Hitachi h-7600）。左列，40000×；右栏100000×。图像是三个实验的代表。b条人CD63（10nM金颗粒）在MCF7细胞（100000×）外显子上的免疫金标记和电子显微镜。c（c）对MCF7和MDA-MB-231细胞外显体中的外显体标记CD63（30–60 kDa）进行Western blot分析。在非还原条件下运行外显子裂解产物。d日RNA安捷伦生物分析仪对从对照和DHA处理的MCF7细胞及其纯化的外泌体中提取的总RNA进行分析。25 nt处的峰值是一个较低的标记标准，如左上角的图像所示。在外显体制剂中，RNA的长度主要小于1000核苷酸，在DHA处理的外显体的小RNA范围内出现了一个大的峰值，28S和18S核糖体亚单位RNA（如左上图所示）在处理和未处理的外生体制剂中均明显缺失
DHA增加乳腺癌细胞和外泌体中的microRNA水平
为了进一步确定DHA是否增加乳腺癌分泌的外泌体的小RNA含量，从DHA处理和未处理的MCF7外泌体和细胞中分离出等量的总RNA，制备小RNA文库。对产生的cDNA文库进行测序，并将读取结果映射到人类基因组上（Build 36，Mar 2006），并与已知成熟的microRNA（mirBase，v13；网址：www.mirbase.org). 总的来说，DHA处理增加了MCF7细胞和外泌体中检测到的成熟microRNA的数量。在细胞中，对照MCF7细胞中检测到387个微RNA（至少1个读取），而DHA处理的MCF7电池中检测到412个（增加25个微RNA）。在外显体中，对照外显体检测到196个microRNA，而DHA处理的外显体则检测到209个（增加了13个microRNAs）（附加文件1). 这些结果与RNA图谱中观察到的小RNA含量增加一致（图). DHA治疗改变了20个细胞的microRNA（1.5倍或更大）（19个上调，7个下调）（参见附加文件中的对照细胞与DHA细胞1). 三种microRNAs（miR-1246204倍；miR-451135倍；和miR-127-3p，6倍）优先封装在外显体中，发现其细胞含量非常低，这与最近的一项研究一致[27]（参见附加文件中的控制细胞与控制外体1). 在DHA处理的外泌体中检测到91个成熟的microRNA（至少1个读取），其中83个与未处理的外逸体相比变化了2倍或更多，其中22个microRNA在至少一种情况下的拷贝数大于1000；表中列出了这22种微RNA我们的结果表明，DHA改变了MCF7细胞源性外泌体的microRNA谱。
表1
DHA增加MCF7外显子中microRNA的表达水平
| 微小RNA | 映射的读取 | | 折叠式变换 | P值 |
|---|
| 控制 | 二十二碳六烯酸 | | |
|---|
| miR-23b | 205.5 | 1064.8 | 5.18 | 1.0E-20型 |
| miR-378型 | 333.3 | 1510.2 | 4.53 | 1.0E-20型 |
| let-7f | 2949.3 | 11386.4 | 3.86 | 1.0E-20型 |
| miR-21型 | 10853.1 | 41786.2 | 3.85 | 1.0E-20型 |
| let-7a | 4748.9 | 17764 | 3.74 | 1.0E-20型 |
| miR-182型 | 2044 | 6986.1 | 3.42 | 1.0E-20型 |
| miR-151-3p | 522.1 | 1760.1 | 3.37 | 1.0E-20型 |
| miR-27b型 | 4082.4 | 13189.9 | 3.23 | 1.0E-20型 |
| let-7e | 472.1 | 1521.1 | 3.22 | 1.0E-20型 |
| miR-27a型 | 4032.4 | 12896.6 | 3.20 | 1.0E-20型 |
| let-7c | 449.9 | 1434.2 | 3.19 | 1.1E-16号机组 |
| miR-365型 | 888.7 | 2824.9 | 3.18 | 1.0E-20型 |
| miR-320b型 | 516.6 | 1553.7 | 3.01 | 1.0电子-20 |
| let-7i | 783.2 | 2335.9 | 2.98 | 1.0E-20型 |
| miR-30天 | 955.3 | 2814 | 2.95 | 1.0E-20型 |
| miR-26a型 | 1122 | 3302.9 | 2.94 | 1.0E-20型 |
| miR-30a型 | 994.2 | 2890 | 2.91 | 1.0E-20型 |
| miR-200b型 | 810.9 | 2314.2 | 2.85 | 1.0E-20型 |
| miR-181a型 | 399.9 | 1086.5 | 2.72 | 7.5E-11号机组 |
| miR-191型 | 3204.8 | 7507.6 | 2.34 | 1.0电子-20 |
| miR-151-5p | 938.7 | 2151.2 | 2.29 | 1.0E-20型 |
| miR-1246型 | 4537.9 | 9072.1 | 2 | 1.0E-20型 |
DHA可增加其他乳腺癌细胞系外泌体中let-7a、miR-21、miR-23b、miR-27b和miR-320b的水平，但不能增加正常乳腺细胞的水平
为了确定DHA对外泌体微小RNA水平的影响是否仅对MCF7乳腺癌细胞具有特异性，或者DHA是否可以增加正常乳腺上皮细胞或其他类型乳腺癌中的外泌体微小RNA水平，我们培养了正常乳腺上皮细胞系（MCF10A）、ER阳性管腔细胞系（ZR-75-1）和两个三阴性的基底样乳腺癌细胞系（BT20和MDA-MB-231）。在DHA处理后，从条件培养基中分离出外显子，并从对照组和DHA处理的外显子中提取总RNA。在DHA处理的MCF7外泌体中检测到5种最丰富的microRNA（let-7a、miR-21、miR-23b、miR-27b和miR-320b）的表达，并用qRT-PCR在其他乳腺细胞系的外泌体内进行了测定。如图所示与对照外显体相比，DHA处理增加了DHA处理外显体中所有5种microRNA的表达，但MDA-MB-231细胞中的let-7a和miR-21除外。相反，DHA处理并没有增加MCF10A细胞外显体中这些microRNA的表达；DHA处理降低了这些外泌体中microRNA的表达。这些结果表明，DHA对其外泌体microRNA含量的影响是癌细胞特有的，并不依赖于乳腺癌亚型。
乳腺癌细胞分泌的外泌体中DHA诱导的microRNA表达变化的验证。以5x10的密度电镀MCF10A、MCF7、ZR751、MDA-MB-231和BT20乳腺癌细胞6每150mm培养皿培养3天。用100μM DHA处理细胞24小时。通过超速离心从条件培养基中收集外显子，提取总RNA，逆转录并使用microRNA特异性引物通过实时PCR扩增(n个 = 3，误差条=SE）。使用ΔΔCt方法计算表达水平的倍数变化*第页 < 学生t检验0.05
DHA增加乳腺癌细胞的胞外体分泌
为了确定外泌体分泌是否受到DHA的影响，我们通过western blot检测了DHA处理的和对照的MCF7和MDA-MB-231细胞株分泌的外泌体内CD63的表达。我们发现来自两种细胞系的DHA处理的外显子制剂中CD63蛋白水平增加（图). 为了监测外显体的产生并测量其释放，我们生成了稳定表达GFP标记的外显体标记CD63（CD63-GFP）的MCF7和MDA-MB-231细胞系（附加文件2). 将MCF7和MDA-MB-231 CD63-GFP细胞培养在补充了外显体缺失FBS的细胞培养基中，并用100μM DHA处理24小时。通过超速离心从条件培养基中分离出外显子并悬浮在PBS中。通过荧光光谱法测定分离出的外显子中是否存在GFP。我们观察到，与未经DHA处理的细胞培养物相比，DHA处理后的细胞培养液外分泌体分泌显著增加（图)，而细胞数量不受DHA处理的影响（图). 这些结果表明，DHA增加了乳腺癌细胞系的胞外体分泌。
DHA增加乳腺癌细胞的外泌体分泌，减少内皮细胞形成的导管，但不影响VEGF的分泌。一Western blot分析用DHA处理后从MCF7和MDA-MB-231细胞中分离的外显子CD63表达。装载等量的胞外体蛋白裂解物，并在非还原条件下运行SDS-PAGE。b条用超速离心法分离DHA处理或未处理的MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞分泌到细胞培养液中的CD63-GFP标记的外泌体，在PBS中重新悬浮，用荧光光谱法测定GFP水平*第页 < 0.0001使用单向方差分析(n个 = 3).c（c）用100μM DHA处理MCF7和MDA-MB-231乳腺癌细胞24小时。取出培养基进行胞外体分离，对DHA治疗后残留的乳腺癌细胞进行计数，并以每10个细胞的平均数表示6单元格(n个 = 3，误差条＝SE）。d日用100μM DHA处理MCF7细胞24小时，通过超速离心从培养基中分离出来自处理和未处理培养物的外泌体，并用吖啶橙（AO）染色。AO标记的外泌体（100μg）与EA.hy926细胞（1×104)在12孔板中的ECMatrix上播种24小时，用Perkin Elmer Operetta在40倍放大率的明亮视野下成像（左）和荧光（右），460nm激发和650nm发射。e（电子）从100 mm的DHA处理或未处理的MCF7细胞汇合板中分离出的大约1/10的外泌体与1×10混合4将EA.hy926细胞接种在96 well平板中的ECMatrix上，培养18 h。用光学显微镜观察管子的形成(降低)并计算(上面的) *,第页 < 0.001使用单向方差分析(n个 = 4).（f）用100μM DHA、1 mM氯贝特（CF）或20μM曲格列嗪（Trog）处理MCF7细胞24 h，用ELISA分析培养基中的VEGF，并用pg/ml表示，第页 < 0.001使用单向方差分析(n个 = 4-6)
乳腺癌外泌体被内皮细胞吸收，DHA治疗抑制内皮细胞管的形成而不影响VEGF水平
然后，我们询问DHA的抗血管生成活性是否可能是由于我们观察到的DHA诱导的外泌体分泌和microRNA含量的变化所致。首先，为了确定乳腺癌外泌体是否可以容易地转移到内皮细胞，我们在基质凝胶上培养内皮细胞系EA.hy926，其中存在从MCF7细胞中分离的纯化外泌物体，这些外泌物体预先用核酸结合染料吖啶橙（AO）标记。将纯化的AO标记外显体应用于EA.hy926细胞并通过荧光显微镜成像。早在2小时（未显示）和24小时（图)表明乳腺癌外泌体很容易转移到内皮细胞。然后确定管道是否形成(在体外血管生成）受DHA诱导的乳腺癌外泌体变化的影响，将等量的从对照组和DHA处理的MCF7细胞中分离的外泌物应用于EA.hy926的基质凝胶培养。与从对照MCF7细胞纯化的外显体相比，从DHA处理的MCF7中纯化的外泌体显著抑制EA.hy926细胞的试管形成（图). 这些结果表明，DHA通过调节乳腺癌细胞来源的外泌体含量来抑制肿瘤血管生成。DHA和曲格列酮（PPARγ配体）没有改变VEGF的分泌，而氯贝特（PPARα配体）减少了MCF7细胞的VEGF分泌（图).
DHA治疗的乳腺癌细胞释放的microRNA被转移到内皮细胞
DHA处理的外泌体中一些最丰富的microRNA在靶向内皮细胞和抑制血管生成方面具有已知活性，例如miR-21[28]，miR-23b[29]，miR-27b[30]和miR-320b[31]. 因此，这些小RNA很可能有助于DHA的抗血管生成活性。为了测试这些microRNA是否能被内皮细胞吸收，将MCF7细胞与EA.hy926细胞共培养24小时，并用DHA处理MCF7。从内皮细胞中提取RNA，并通过qRT-PCR测定这些microRNA的表达水平。如图所示通过DHA处理MCF7细胞，内皮细胞中let-7a、miR-21、miR-23b、miR-27b和miR-320b的表达显著增加。当将DHA转录的外泌体直接应用于EA.hy926细胞时，观察到类似的微小RNA表达模式（附加文件三). 这些结果表明，DHA处理的乳腺癌细胞外泌体携带的微小RNA很容易转移到内皮细胞。
DHA诱导外体microRNA从MCF7细胞转移到内皮细胞，改变microRNA表达、内皮管形成和靶mRNA表达。一EA.hy926电池（2.5×104)在24孔板和MCF7细胞（2×104)在跨孔插入物（0.4μM）中进行电镀，并共同培养24小时。用100μM DHA处理MCF7细胞24 h，提取RNA并进行qRT-PCR。使用ΔΔCt方法计算表达水平的倍数变化。条形图中的数据表示平均值±SEM(n个 = 3). 用打乱控制、let-7a、miR-21、miR-23b、miR-27b或miR-320b模拟物转染EA.hy926细胞。48小时后EA.hy926细胞（1×104)将其置于96 well板中的ECMatrix上，并在37°C下培养16–18小时。计算了分支点(b条)和代表性图像(c（c）)取材于光学显微镜下（20×）。图中所示为三个独立实验的合并三份结果。条形图中的数据表示平均值±SEM(n个 = 9). *,第页 < 0.001，使用Student t检验。d日EA.hy926电池（2.5×104)接种在24孔板和MCF7细胞（2×104)在transwell插入物（0.4μm）中培养过夜。用DHA处理上腔MCF7细胞24小时。从下腔的EA.hy926细胞中提取RNA，用qRT-PCR检测靶基因的表达。用扰乱对照、miR-23b或miR-320b模拟物转染EA.hy926细胞。先前验证的miR-23b mRNA靶点（PLAU和AMOTL1）(e（电子）)和（NRP1和ETS2）miR-320b(（f）)转染后48 h用qRT-PCR检测。使用ΔΔCt方法计算表达水平的倍数变化。条形图中的数据表示平均值±SEM(n个 = 3). *,第页 < 0.05使用Student t检验
miR-23b、miR-27b和miR-320b抑制内皮细胞形成试管
为了确定MCF7外显体携带的哪种microRNA载体可能调节DHA的抗血管生成作用，我们用miR-21、miR-23b、miR-27b、miR-320b、let-7a或干扰控制的microRNA模拟物转染EA.hy926细胞。转染后48小时qRT-PCR测定，证实EA.hy926细胞中microRNA过度表达，表达量增加至少10倍。在微小RNA模拟转染之后，将细胞接种在基质凝胶上并进行培养。通过分支点计数对内皮细胞形成的管进行定量（图)并通过光学显微镜成像（图)，正如我们之前所描述的[32]. 如图所示，内皮细胞中miR-23b、miR-27b和miR-320b水平的增加显著减少了内皮细胞的管形成，而let-7a和miR-21的过度表达并没有减少管形成，这表明外体microRNAs、miR-23b、miR-27和miR-320 b介导了DHA的抗血管生成活性。
乳腺癌细胞共培养或miR-23b或miR-320b的microRNA模拟转染抑制促血管生成靶mRNA表达
已知几个先前定义和验证的miR-23b和miR-320b靶基因编码调节血管生成的蛋白质，包括纤溶酶原激活物（PLAU）[33]促血管生成素样-1（AMOTL1）[34]，神经磷脂1（NRP1）[31]和v-ets禽红细胞增多症病毒E26癌基因同源物2（ETS2）[35]. 我们询问miR-23b和miR-320b向内皮细胞的胞外体转移是否会影响这些促血管生成靶基因的表达。为了解决这个问题，我们将EA.hy926细胞与MCF7细胞共培养24小时。如图所示与DHA共同培养的MCF7细胞处理后，内皮细胞中PLAU、AMOTL1、NRP1和ETS2的表达显著降低。将miR-23b的microRNA模拟物直接应用于EA.hy926细胞，抑制其靶基因PLAU和AMOTL1的表达（图)miR-320b的模拟物抑制其靶基因NRP1和ETS2的表达（图). 这些结果表明，DHA诱导的乳腺癌分泌外泌体microRNA含量的变化，特别是miR-23b和miR-320b的增加，可以抑制促血管生成microRNA靶基因的表达。
Rab27A敲除逆转DHA诱导的外泌体介导的microRNA转移和内皮细胞对试管形成的抑制
为了证实DHA对内皮细胞的作用依赖于乳腺癌外泌体的分泌和含量，我们敲低了小Rab GTPase Rab27A的表达。Rab27A已被证明可以控制多泡内体膜在质膜和外体分泌处的对接[36]. 使用基于miR-30的shRNA进入载体和dsRed2共表达来抑制Rab27A的表达。shRab27A-dsRed载体转导至MCF7-CD63-GFP和MDA-MB-231-CD63-GFF细胞。通过荧光显微镜检测dsRed水平，确认shRab27A构建物的表达（图). western blot分析也证实了Rab27A蛋白和mRNA的敲除（图)和qRT-PCR（图)分别是。如图所示Rab27A敲除显著降低了外泌体分泌。为了确定DHA对内皮细胞管形成的影响是否依赖于Rab27A介导的外泌体分泌，将EA.hy926细胞接种在基质凝胶上，并与MCF7 CD63-GFP、shRab27A-MCF7-CD63、MDA-MB-231 CD63-GFF或shRab27A-MDA-MB231-CD63细胞共培养在跨孔插入物中。当与野生型或CD63-GFP乳腺癌细胞共同培养时，DHA处理可减少EA.hy926细胞的试管形成。然而，在shRab27A共培养物中，DHA处理增加了分支点的形成（图)这表明DHA的抗血管生成作用依赖于Rab27A介导的胞外体分泌。为了测试miR-23b或miR-320b是否在Rab27A敲除时转移，将EA.hy926细胞置于24孔板表面，单独培养或与MCF7 CD63-GFP或shRab27A-MCF7 CD63-GFP-细胞共培养，并用DHA处理24小时。如图所示与CD63-GFP细胞相比，Rab27A敲除可抑制DHA诱导的miR-23和miR-320b外泌体介导的转移。这些结果表明，DHA对内皮细胞的抗血管生成作用依赖于乳腺癌外分泌体的分泌和含量传递。
乳腺癌细胞中Rab27A的敲除抑制DHA诱导的外体转移。通过一种表达dsRed2的慢病毒和两种靶向Rab27A的不同shRNAs的转导，可以在MCF7 CD63-GFP和MDA-MB-231 CD63-GFP乳腺癌细胞系中敲除Rab27A的表达。一明亮的视野(左边)和荧光显微镜图像(正确的)CD63-GFP（绿色）、shRab27A-dsRed2（红色）和Hoescht核染色（蓝色）（放大40倍）。western blot证实Rab27A蛋白和mRNA敲除(b条)和qRT-PCR(c（c）). 使用ΔΔCt方法计算Rab27A表达水平相对于内源性对照的倍数变化。条形图中的数据表示平均值±SEM*，第页 < 0.001，使用Student t检验。d日用BCA法测定乳腺癌细胞分泌的外泌体数量，表示为每10个外泌体总的μg/μl6细胞，相对于野生型。条形图中的数据表示平均值±SEM(n个 = 2).e（电子）表达CD63或shRab27A-CD63的MCF7和MDA-MB-231细胞在跨孔插入物（0.4μm）中生长，并与ECMatrix上的EA.hy926细胞共培养24小时。用100μM DHA处理上腔中的乳腺癌细胞24小时后，计算EA.hy926细胞形成的分支点数量。条形图中的数据表示平均值±SEM(n个 = 3-6) *,第页 < 0.05; **,第页 < 0.01使用Student t检验。（f）表达CD63或shRab27A-CD63的MCF7细胞在跨孔插入物（0.4μm）中生长，并与EA.hy926细胞在24孔板中共同培养。用100μM DHA处理上腔乳腺癌细胞24小时后，从EA.hy926细胞中提取总RNA，逆转录并用qRT-PCR检测miR-23b和miR-320b的表达。使用ΔΔCt方法计算表达水平的倍数变化。将折变值归一化为对照样品，并相对于无乳腺癌细胞（−BC）进行表达。条形图中的数据表示平均值±SEM(n个 = 3) *,第页 ≤ 0.05; **,第页 < 0.001使用Student t检验
讨论
据我们所知，这是首次证明DHA是一种天然抗癌化合物，可以改变乳腺癌外泌体分泌和microRNA含量，从而抑制内皮管形成。除了揭示DHA抗癌作用的新机制外，这些新发现还支持乳腺癌外体信号可以靶向抑制肿瘤血管生成的概念。
近年来，人们已经意识到外泌体作为癌症进展介质的重要性[37]. 然而，减少或改变其对癌症进展影响的方法尚未得到证实。在本研究中，我们发现DHA可以改变乳腺癌外泌体的microRNA含量和分泌。我们提供的证据表明，癌源性外体的microRNA含量可以改变，这些改变可以影响其生物活性和细胞间通讯。这些结果为未来开发针对胞外体分泌和内容物传递的新癌症治疗策略提供了可能性。
DHA的抗血管生成活性早已为人所知[9,10,38]然而，精确的机制尚不明确。在本研究中，我们发现从DHA治疗的乳腺癌细胞中分离出的外显子富含microRNAs，其靶向涉及内皮细胞迁移、毛细血管形成调节和血管生成的几个基因。更重要的是，将这些外泌体应用于内皮细胞可抑制内皮管的形成。这些结果强烈表明，DHA的抗血管生成作用至少部分是通过外源体的转移介导的。由于外泌体包裹并转移其他生物活性蛋白质、脂质和mRNA，DHA也可能改变乳腺癌外泌体内的其他含量，这也可能介导DHA的抗血管生成作用。
在本研究中，我们发现内皮细胞与DHA处理的乳腺癌细胞共培养或应用微小RNA模拟物可显著抑制导管的形成，并抑制促血管生成靶基因的表达，包括miR-23b的PLAU和AMOTL1，miR-320b的NRP1和ETS2。为了支持这些发现，最近的一项研究表明，miR-320从糖尿病心肌细胞向内皮细胞的外泌体转移可抑制血管生成并降低ETS2的表达[39]因此，提示miR-320的外体转移可能在其他生物模型系统中调节血管生成。
目前还不清楚DHA如何影响胞外体分泌和胞外体microRNA含量的变化。然而，众所周知，外泌体富含鞘磷脂神经酰胺，其形成受中性鞘磷脂酶（nSMase）调节[40]. 已经证明神经酰胺可以刺激外泌体分泌，而nSMase抑制剂GW4869可以抑制外泌体分泌[41]. nSMase过度表达可增加细胞外microRNA水平，而GW4869治疗可减少microRNA分泌[24]. 另一项研究表明，DHA对乳腺癌细胞的治疗在体外并通过饮食补充体内诱导nSMase活性和神经酰胺形成增加30-40%；添加GW4869也可以抑制这些影响[42]. 总之，这些研究表明，DHA可能通过神经酰胺的形成参与调节胞外体分泌和微RNA包裹。然而，到目前为止，还没有确定DHA、外泌体和microRNA分泌之间的联系。在此，我们提供了证据表明，DHA可以诱导外泌体分泌，并改变乳腺癌外泌体内的microRNA含量，从而改变其生物功能。这种效应是否通过nSMase调节神经酰胺的生成而介导尚待确定。
结论
总之，本研究表明，DHA的抗血管生成作用很可能通过刺激乳腺癌模型系统中的胞外体分泌和胞外体microRNA含量的改变来介导。这些结果为DHA的抗癌作用提供了新的见解，并进一步支持将DHA用作乳腺癌治疗的佐剂。
方法
细胞培养
人类乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231、BT20和ZR-75-1来自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。将细胞培养在补充了外泌体缺失的10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中（Corning/Mediatech，Inc.Manassas，VA）。通过超离心（10万×克在4°C下持续2 h，将所得上清液通过0.2μm孔过滤器过滤，然后添加到细胞培养基中。EA.hy926内皮细胞系由Doris Benbrook博士（俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心）善意提供，并在补充有10%胎牛血清、50 mg/mL肝素（西格玛-阿尔德里希，密苏里州圣路易斯）、，0.05 mg/mL内皮细胞生长补充剂（ECGS；科宁/Mediatech Inc.）和100 IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素（科宁/Miatech Inc.）。细胞通常保存在37°C和5%CO的加湿室中2.
DHA的制备和应用
二十二碳六烯酸为分析级（Sigma-Aldrich），通过在30 mM的分子级乙醇中溶解DHA制备储备溶液，并在−80°C的氩气下储存。对于DHA治疗，在加入细胞培养物之前，先用PBS中的1.5 mM牛血清白蛋白稀释，制备5 mM的工作料。乙醇在培养基中的最终浓度低于0.5%。对照细胞用缓冲液处理。
外显子分离
根据[43]并按照制造商的协议过滤或使用Exoquick-TC试剂（System Biosciences，Mountain View，CA）。为了进行超速离心分离，收集条件细胞培养液并在10000×克在4°C下保持30分钟，以去除细胞和大碎片。使用0.22-μm孔过滤器过滤上清液，并以100000×克在4°C下保持1小时。用10 ml 1X PBS清洗外泌体颗粒，并在100000×克在4°C下保持1小时。将所得颗粒悬浮在1X PBS中用于整个外显子应用，或进一步加工用于RNA或蛋白质提取。根据制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen/Life Technologies，Carlsbad，CA）提取总外泌体RNA。
蛋白质印迹分析
通过在RIPA缓冲液（50 mM Tris–HCl pH 7.4、150 mM NaCl、0.5%脱氧胆酸钠、1%NP-40和0.1%十二烷基硫酸钠）中重新悬浮外切体，制备总外切体蛋白，该缓冲液含有1 mM苯甲基磺酰氟、5μg/ml亮氨酸蛋白酶、2μg/ml抑肽酶和1μg/ml胃蛋白酶抑制素A。用10%的SDS-PAGE凝胶分离每个样品中约30-40μg的蛋白质，转移到PVDF膜上，并用CD63抗体（加州圣克鲁斯圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology）、Rab27A抗体（台湾Abnova）或β-肌动蛋白抗体（密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）进行印迹。
电子显微镜和免疫金标记
外显子固定在2%多聚甲醛中。在干燥环境中，将固定样品吸附在formvar涂层铜格栅上20分钟。然后将样品固定在1%戊二醛中5分钟。样品在蒸馏水中漂洗后，用草酸铀酰染色5分钟，然后用醋酸铀酰甲基纤维素在冰上染色10分钟。多余的液体通过滤纸从网格中去除，网格在室温下保存，直到成像。对于免疫金标记，外显子固定在2%多聚甲醛中。样品在干燥环境中被福尔瓦涂层铜格栅吸收20分钟。样品用PBS清洗三次。然后在50 mM甘氨酸中对样品进行四次洗涤，然后进行10分钟的封闭步骤。将外显子与CD63一级抗体孵育30 min，然后将样品在洗涤缓冲液中洗涤6次。样品在与10 nM金颗粒结合的二级抗体中培养20分钟。最后，样品在PBS中洗涤，用戊二醛稳定，在水中洗涤，并用草酸铀酰和醋酸铀酰甲基纤维素反染。在日立H7600显微镜上进行成像。
CD63过度表达和Rab27A敲除
为了过度表达GFP标记的CD63，慢病毒表达载体pCT-CD63-GFP来自加利福尼亚州山景城System Biosciences。为了减少Rab27A的表达，将shRNA克隆到基于miR-30的shRNA进入载体pEN_TRmiRc2中，并与dsRed2共表达。pEN_TRmiRc2是Iain Fraser（Addgene质粒#25750）的礼物。Rab27A 3′UTR中的以下序列为靶向序列：#1:CCAGCTCAATGTCTTGAGTAT和#2:CGCTCAATGCTTTGAGTATA。使用Gateway LR Clonase II酶（Invitrogen/Life Technologies，加利福尼亚州卡尔斯巴德）将所得片段克隆到pLenti CMV Puro DEST表达载体中，该表达载体由Eric Campeau（Addgene质粒#17452）提供。慢病毒表达载体用于产生VSVg假型慢病毒。病毒产生和细胞感染的过程与以前类似[44]. 第三代包装质粒pMD2.G（Addgene质粒#12259）；pMDL/RRE g/p（添加基因质粒#12251）和pRSV-Rev（添加基因载体#12253）是Didier Trono的礼物。使用聚乙烯亚胺（Polysciences，Inc.Warrington，PA）转染方法将包装质粒与慢病毒表达载体共转染到人胚胎肾293T细胞中，以产生复制缺陷型慢病毒。转染48和72小时后，收集上清液，通过0.45-μm MCE膜过滤，并使用聚乙二醇（Sigma-Aldrich）浓缩[45,46]. MCF7和MDA-MB-231在存在8μg/ml聚brene（Sigma-Aldrich）的情况下感染慢病毒。通过使用1μg/ml嘌呤霉素（InvivoGen，加州圣地亚哥）处理感染后约48小时的细胞，选择用于基因转移。
荧光光谱、显微镜和细胞成像
CD63-GFP（copGFP）水平在BioTek Synergy HT平板阅读器（BioTek-Instruments，Inc.Winooski，VT）上测量，并通过485 nm激发和528 nm发射检测。使用Operetta高含量成像系统（马萨诸塞州沃尔瑟姆PerkinElmer）通过荧光显微镜分析内皮细胞。将内皮细胞以每孔10000个细胞的密度从（PerkinElmer）的Matrigel in Cell Carrier-96板上镀上。通过将1 mL通过超速离心分离的全外泌体与20μM吖啶橙（AO，Molecular Probes/Life Technologies）结合来标记全外泌物体。这些外泌体在室温下黑暗中孵育1小时，在20毫升PBS中稀释，并在100000×克持续1小时。然后将外来体颗粒重悬于PBS中。通过在460 nm处激发，在650 nm处发射红色荧光来检测AO。
内皮管形成测定(在体外血管生成）
利用在体外血管生成检测试剂盒（Millipore，Billerica，MA），如我们之前所述[32]. EA.hy926（1x104)将细胞重新悬浮在EBM-2（Lonza Group，Walkersville，MD）培养基中，并将其镀到聚合的细胞外基质上。显微镜下观察内皮管的形成，并在培养17-24小时后拍照。根据制造商的规定，通过支点计数来量化管子的形成。
VEGF分泌
如前所述，使用ELISA试剂盒测定MCF-7细胞中VEGF的分泌[32]. 细胞以1x10的密度接种到6孔板中6细胞/孔，用氯贝特或曲格列酮处理4h，然后放置在缺氧室中16h。然后收集培养基，并按照制造商的说明分析培养基中的VEGF水平。
RNA提取
按照制造商的方案，使用TRIzol试剂（Invitrogen/Life Technologies）提取总RNA。根据制造商的协议，使用NanoDrop ND-100分光光度计（NanoDrot Technologies，Wilmington，DE）对RNA浓度进行量化，并使用安捷伦2100生物分析仪（安捷伦科技，Palo Alto，CA）对质量进行评估。
定量实时逆转录PCR
对于microRNA表达分析，根据制造商的说明，通过添加microRNA特异性5X逆转录干环引物和TaqMan microRNA逆转录试剂盒，从5 ng总RNA合成互补DNA。实时PCR是通过在2X TaqMan Universal Master Mix II（使用UNG）和20X TaqMan microRNA表达分析中稀释cDNA产物来进行的，以检测每个成熟的microRNA：miR-21（ID:000397）、miR-23b（ID:00400）、miR-27b（ID:000409）、miR-320b（ID:002844）和let-7a（ID:00377）。所有试剂和引物均来自Life Technologies。小核糖核RNA RNU6B（ID:001093）用作细胞microRNA表达分析的microRNA表示标准化控制。然而，我们发现RNU6B对胞外体microRNA表达标准化不可靠，因此我们使用合成的秀丽隐杆线虫miR-54（cel-miR-54）RNA寡核苷酸（Integrated DNA Technologies，Coralville，IA）作为对照。Cel-miR-54先前已被证明不会影响人类微小RNA的检测[50]. 在互补DNA合成之前，将cel-miR-54（0.25nM）寡核苷酸掺入每个RNA样品中，并使用TaqMan microRNA测定法（ID:001361，Life Technologies）进行实时PCR。通过使用iScript cDNA合成试剂盒（加利福尼亚州赫拉克勒斯市Bio-Rad）从200 ng总RNA中生成cDNA来测量microRNA靶基因的表达。合成的cDNA在2X iTaq Universal SYBR Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA）中稀释，并与每个正向和反向引物的4uM结合。使用的特异引物序列如下：NRP1，正向5′-CCTTCGCCACTGGAACAT-3′和反向5′-TTGGCCATCCTGTGATCC-3′；AMOTL1，正向5′-CGAGGACTGAACTACCAT-3′和反向5′-AGGGACCCTTTCACCG-3′；PRDX1，正向5′-CTGGTGAACCCAAGCATGA-3′和反向5′-CAGCTGTGGCTTGAAGTTGG-3′；PLAU，正向5′-CGATCCAAAGGCAGACAATGA-3′和反向5′-TGGACACACATGTTCCTCCATT′3′；ETS2，正向5′-CTCACACAAATTCTGACTC-3′和反向5′-CACACACAGCAGGAGC-3′；标准化控制36B4，正向5′-ATCAACGGGTACAAACGAGTCCTG-3′和反向5′-AGGCAGAGGAGAGAGAAG-3′。PCR反应在Bio-Rad CFX 96实时PCR（Bio-Rad，Hercules，CA）仪器上进行，条件如下：在95℃下保持10分钟，然后在95℃的40个循环中保持15秒，在60℃下保持1分钟。使用归一化RNU6B（细胞microRNA）或cel-miR-54（胞外体microrRNA）后归一化Ct的差异（ΔΔCt法）评估相对基因表达。使用2计算折叠变化-ΔΔCt.
microRNA模拟转染
根据制造商的方案，使用DharmaFect Duo试剂（Dharmacon/GE Healthcare，Lafayette，CO）将miRIDIAN microRNA模拟物（50 nM）转染到内皮细胞。
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism软件（GraphPad-software，Inc.La Jolla，CA）完成。在适当的情况下，使用Student的t检验或单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的后验来确定对照组和实验组之间的统计显著性差异第页 < 0.05或更低为显著性水平。
致谢
这项研究得到了美国癌症协会（CNE-117557）的部分资助；Susan G.Komen治疗基金会（KG081083）；NIH OK-INBRE项目（3P20RR016478-09S2）；以及俄克拉荷马州科学技术促进中心（HR14-147）。我们感谢佩吉和查尔斯·斯蒂芬森癌症中心功能基因组学核心设施提供的服务和支持，俄克拉荷马大学健康科学中心分子生物学和细胞计量学研究实验室的DNA测序和基因组设施，提供Illumina MiSeq小RNA文库构建、测序和分析服务，以及俄克拉何马医学研究基金会的成像核心设施，用于电子显微镜图像采集。
其他文件
附加文件1：（244K，xlsx）
下一代小RNA测序数据。该Excel文件包含对照和DHA处理的MCF7细胞和外泌体的微小RNA读数和成对分析结果。
附加文件2：（136K，pptx）
乳腺癌细胞中CD63-GFP的表达。此文件包含证实乳腺癌细胞中CD63-GFP表达的显微图像。
附加文件3：（75K，pptx）
从MCF7外显体向内皮细胞转移外显体microRNA。该文件包含证实外体microRNA从MCF7外体转移到内皮细胞的microRNA表达数据。
脚注
竞争性利益
作者声明，他们没有相互竞争的利益。
作者的贡献
BNH设计了研究，进行和/或监督了实验，并起草了手稿。KJC进行了microRNA模拟转染，以及一组共培养和血管生成分析。WLB进行慢病毒包装和转导。RJ参与了研究的协调并帮助起草了手稿。WCD参与了该研究的设计。WQD构思了这项研究，并参与了其设计和协调，并帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终手稿。
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