苔藓抑制素：生物学背景和生物技术前景

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介绍

微生物共生体通常被认为是从海洋无脊椎动物中分离出的天然产物的来源，通常基于化合物与已知微生物次级代谢产物的结构相似性。结构相似性只是通过许多生物合成步骤组装的结构复杂分子的有效论据。苔藓抑制素最初是从苔藓动物中分离出来的水母和细菌共生体B.内毒碱似乎与苔藓抑制素的生物合成有关（见下文“苔藓生长抑制素共生起源的证据”）。这个B.内毒碱共生是生物活性代谢物共生的最佳例证之一。在这个模型系统中，该化合物的生态作用和生物医学潜力得到了很好的描述，并探索了该化合物的共生起源。本综述概述了苔藓抑制素的起源、生物学背景和生物技术前景，涵盖了2005-2010年期间。

苔藓抑制素：发现与结构

苔藓抑制素是一个结构相关的环状聚酮家族，最初从海洋苔藓动物中分离得到水母（在中审查[1]). 所有已知的苔藓抑制素都有一个共同的大内酯核心和三个四氢吡喃环(图1); 它们的主要区别在于C-7和C-20位置的取代基，以及γ-内酯环是否与C-19到C-23四氢吡喃环融合。苔藓抑制素也可以根据其C-20位置是否存在2,4-辛二烯酸部分来分类。第一批苔藓抑制素是使用抗肿瘤生物测定引导的分离方法发现的[2]. Bryostatin在B.内毒碱菌落：几乎所有的苔藓抑制素都以10倍的产量被分离出来⁻⁵和10⁻⁷%B.内毒碱来自世界各地不同种群的成虫群体湿重。Bryostatins 10和20是从B.内毒碱幼虫，但其浓度是成虫的千倍，这表明这些化合物在B.内毒碱自然界中无疑存在额外的苔藓抑制素。通过生物测试，在相关的苔藓动物中观察到了苔藓抑制素活性，B.单工，并且通过色谱和质谱检测到结构相似但新颖的苔藓抑制素的存在[三]. 苔藓抑制素的结构多样性是否与生物功能、环境条件或分离产物有关尚不清楚[4,5].

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图1

bryostatin“0”-20的结构（“bryostatin0”是所有已知bryostatins的假设前体）。含有八-2,4-二烯酸部分（蓝色）的苔藓抑制素仅在深海中发现B.内毒碱兄弟物种，而浅物种B.内毒碱含有苔藓抑制素和其他酯化物（绿色）。红色突出显示的氧基团表示与PKC结合的药效元素。

苔藓虫毒素的临床现状

大多数关于苔藓抑制素的药理学和临床研究都集中在苔藓生长抑制素1上，该蛋白因其C-20的疏水烷基链而引人注目(图1). 苔藓抑制素与蛋白激酶C（PKC）C-1调节域的二酰甘油结合位点结合；大多数（但不是全部）苔藓抑制素的药理作用都归因于这种相互作用[6]. 蛋白激酶C（PKC）信号通路参与了真核细胞的许多调节过程。PKC存在于组织中差异表达的10种亚型中，并受二酰甘油、钙和磷脂的不同调节。因此，PKC激活剂，包括苔藓抑制素，在动物体内具有复杂的作用，并且这些作用随浓度变化很大。

Bryostatin因抑制小鼠P388淋巴细胞白血病细胞的生长而首次被分离出来在体外和体内[2]. 在对多种癌症进行了30多个I期和II期临床试验后，苔藓抑制素1单独或与其他化疗药物联合应用，其疗效尚不足以作为癌症治疗进入III期临床试验。最近，bryostatin 1已在其他环境中进行了研究。它在中枢神经系统的应用中显示出前景[7]. 在学习、抑郁、中风和阿尔茨海默病的啮齿动物模型中，苔藓抑制素1产生了显著的阳性结果[8–13]. 人类阿尔茨海默病II期临床试验已经启动。最近，bryostatin 1被提议作为人类免疫缺陷病毒（HIV）的一种可能治疗方法[14]. 虽然目前的抗病毒治疗对艾滋病毒有效，但由于潜伏病毒仍存在于休眠细胞中，该病无法治愈。基于在体外研究表明，苔藓抑制素可能有效激活潜伏病毒，从而将其从细胞库中清除，暴露于抗病毒治疗中，并将其消灭。

苔藓抑制素的缺乏阻碍了临床的发展。海水养殖B.内毒碱已经完成，但尚未商业化实施[15]. 虽然已经实现了天然苔藓抑制素的全合成，并且正在稳步改进，但尚不适合工业化生产[16]. 苔藓抑制素简化结构类似物的合成目前是一个活跃的研究领域[17,18]. 已经获得了合成更容易获得但保留生物活性的类似物，并最终证明其具有临床用途。

水母

水母是所有具有完全特征的苔藓抑制素的来源，是一种世界性分布的海洋苔藓动物。与其他苔藓动物一样，它是由单个动物组成的群体生物(图2A). 殖民地中的每一个食性动物都有一个lophophore，这是一个用来从海水中捕获浮游生物的触角环(图2B). 群体中的动物通过缆索系统相互连接，缆索系统将营养物质从喂食动物输送到非喂食动物和称为卵细胞的孵化室(图2B) [19]. 胚胎是由卵细胞中的受精卵发育而来的，成熟后，它们会作为非食性幼虫释放到海水中(图2C).B.内毒碱幼虫通常定居在坚硬的底物上，然后变态为第一个食性动物，称为祖先。祖先随后通过出芽进行无性繁殖，形成一个幼年群体(图2D).

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图2

（A） 一个典型的群体水母由（B）双列排列的类动物组成。卵细胞孵出（C）具纤毛的非食性幼虫，这些幼虫定居在硬基质上并变态为第一个食性动物，称为祖先，然后通过出芽繁殖，形成（D）幼年群体

苔藓抑制素的生态作用

苔藓抑制素可能对B.内毒碱幼虫来自一项研究，该研究使用了B.内毒碱鱼类摄食试验中的成虫和幼虫[20]. 这项研究表明，成鱼提取物对多面手鱼来说是美味的，而幼虫提取物则具有威慑作用。此外，研究表明，当捕食者摄入B.内毒碱幼虫，幼虫被反流，其变态不受阻碍[21]. 一项后续研究在幼虫中发现的浓度下进行测试时，确定苔藓虫蛋白10和20是阻食剂[22,23]. 利用基于苔藓抑制素PKC结合活性的独特荧光技术，对苔藓生长抑制素进行了体细胞定位，结果表明，苔藓他制素通过索系统从细菌聚集体中作为涂层传递到卵细胞发育中的胚胎上[24]. 在成熟和释放后，这种苔藓抑制素的“外衣”(图3E)在幼虫在底物上沉淀并开始变态两天后，它们会一直附着在幼虫身上。苔藓蛋白的损失与几丁质外骨骼的合成不谋而合，几丁质外骨骼可以保护幼崽B.内毒碱来自捕食。来自苔藓抑制素定位的数据证实了先前的研究表明早期生物活性的个体发生变化B.内毒碱发展[25].

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图3

“坎迪达斯Endobugula sertula”和苔藓抑制素在水母幼虫。（a） 大脑皮层窦内的细菌水母幼虫，如用两个探针同时荧光原位杂交（FISH）所示–普通真细菌探针CY5-EUB338（红色）和一个特殊的CY3“坎迪达斯Endobugula sertula“探针（绿色）-显示为两个信号的组合（黄色）。棒材=20μm。在（b）–（d）中，同样的图像以高倍放大显示，其中（b）是使用两个探针的苍白球窦的高倍图像。共生体特异性探针（c）和EUB338（d）杂交到相同的细胞，表明“坎迪达斯幼虫苍白窦中的“内胚层”。棒材=5μm。（e） 通过PKC标记方法，在一只神经毒双歧杆菌幼虫的外部检测到一层苔藓抑制素（蓝色）涂层[24]. 在幼虫的苍白球窦中也可见CY5-EUB338/CY3-“坎迪达斯Endobugula sertula“FISH信号（黄色）。棒材=50μm。

共生体的发现

在发现苔藓抑制素之前，B.内毒碱是发育生物学和自然史众多研究的主题。1969年，在对几种苔藓动物的显微解剖进行调查时，卢托观察到，在一个成年苔藓群落的索系统中存在杆状细菌草苔虫属物种，B.鼻甲[26]. 据我们所知，这是第一次描述苔藓动物体内的细菌。观察到的细菌是单一培养的还是混合群落，无法通过显微镜检查确定。另一种不同种类幼虫的显微镜观察草苔虫属物种揭示了内脏双歧杆菌、太平洋双歧杆菌和B.单工幼虫大脑皮层窦内含有杆状细菌[25]. 有趣的是匍匐茎双歧杆菌和B.turrita公司没有细菌。成人体内细菌的形态相似性B.鼻甲卢托观察到[26]和在B.内毒碱,B.太平洋、和B.单工幼虫[27]暗示了细菌之间密切的进化关系；然而，分子方法对于揭示细菌的特性和关系是必要的草苔虫属幼虫。

Haygood和Davidson使用细菌小亚基（SSU，16S）核糖体RNA基因测序来鉴定来自B.内毒碱南加州采集的幼虫[28]. 靶向SSU rRNA序列的特异性寡核苷酸探针与大脑皮层窦杆状细菌细胞杂交B.内毒碱幼虫。在这项研究中，在所有受试的加州人群中都发现了相同的SSU rRNA序列，而在共生的苔藓动物中却没有发现，这表明苍白球窦中的细菌与B.内毒碱特异性探针和通用细菌探针的共同杂交表明，这两种探针都能与所有细菌细胞结合，这表明蝶窦细菌是单一培养的(图3B). 这种细菌共生体被命名为“坎迪达斯Endobugula sertula公司。”这个坎迪达斯该名称用于描述尚未培养的细菌。两种“坎迪达斯Endobugula sertula”是已知的（参见关于B.内毒碱（见下文）。来自其他共生体的细菌SSU rRNA序列草苔虫属随后获得了种并进行了分析，结果表明它们都是密切相关的，并且在γ-蛋白菌中形成了一个独特的细菌群，但还没有任何一种被培养[29].

苔藓抑制素共生起源的证据

结构上和生物合成上复杂的苔藓抑制素的结构让人联想到典型的细菌次级代谢产物，从而提出共生细菌“坎迪达斯Endobugula sertula“进行苔藓抑制素生物合成。然而，从推测转向确认微生物来源具有挑战性，需要严格的实验测试（参见[30]). 当微生物未经培养时，这尤其具有挑战性。

虽然明确证明共生体“坎迪达斯Endobugula sertula“是苔藓抑制素的生产商，目前尚缺乏证据支持这一假设。也许最具启发性的证据是B.内毒碱由抗生素处理过的幼虫形成的菌落[22,31]. 苔藓抑制素的减少与“坎迪达斯Endobugula sertula“水平。在这两项研究中，苔藓虫宿主似乎没有受到抗生素治疗的影响，然而，不能消除观察到的苔藓抑制素减少是由于隐性共生体减少的可能性。

苔藓抑制素共生起源的另一条证据来源于B.内毒碱兄弟物种。迄今为止已知有三个兄弟物种：深海、浅海[32]线粒体细胞色素氧化酶I序列很容易区分北方同胞物种[33] (表1). 由于分类法尚未修订，它们仍被确定为水母深部兄弟物种主要发现于加利福尼亚州南部水深9米以下的水域，含有苔藓抑制素1–3（以及其他苔藓抑制剂）。这些苔藓抑制素在C-20具有2,4-十八烯酸部分，这在其他苔藓他汀中是不存在的(图1). 浅层兄弟物种，Mackie等人进一步将其分为S1和S2基因型[34]相反，它不含苔藓抑制素1-3，但含有其他苔藓抑制素。S1基因型似乎具有世界性分布，被认为是入侵物种，而S2基因型仅限于加利福尼亚州。深部和浅部兄弟物种都包含“坎迪达斯Endobugula sertula”和SSU rRNA序列坎迪达斯深部和浅部兄弟物种的Endobugula sertula“菌株差异达4 bp。北方兄弟物种是在特拉华州和康涅狄格州附近的沿海水域发现的；这些动物似乎不含“坎迪达斯Endobugula sertula“或苔藓抑制素[33]. 因此，苔藓抑制素的存在总是与“坎迪达斯Endobugula sertula”，支持苔藓虫蛋白共生起源的假说。

对苔藓抑制素生物合成的研究也为“坎迪达斯苔藓抑制素生产中的“Endobugula sertula”。假定的基因簇布莱簇（如下所述），被提议生产“bryostatin 0”。通过以下方法检测集群中mRNA的表达就地杂交“坎迪达斯Endobugula sertula“细胞B.内毒碱幼虫，而不是在宿主细胞中[31]. 综合起来，这三条证据表明“坎迪达斯Endobugula sertula”作为“苔藓抑制素0”的生产商。

苔藓抑制素的生物合成

因为“坎迪达斯Endobugula sertula”是一项尚未开发的传统生物合成研究，使用同位素标记、突变体和在体外纯化酶的研究是不可行的。Kerr及其同事通过培养B.内毒碱用放射性标记前体制备无细胞酶。作者显示了乙酸盐、甘油和SAM腺苷甲硫氨酸的掺入，表明这些部分可能是苔藓甾蛋白生物合成的前体[34].

生物信息学分析还得出了关于苔藓抑制素生物合成的其他推论。模块化聚酮合成酶（PKS）由包含一组催化域的模块组成，用于每个扩展循环。使用基于模块PKS酮合酶（KS）结构域保守序列特征的引物，这是一个在浅层和深层中持续存在的酮合酶基因片段B.内毒碱获得宏基因组DNA[31]. 该片段用于筛选从Shallow和Deep分离的宏基因组DNA制备的文库B.内毒碱并在“坎迪达斯Endobugula sertula“DNA。获得了几个PKS编码克隆，测序后，这些克隆收敛到具有细菌基因簇特征的单个基因组区域，命名为布莱群集[31,35,36]. 这个布莱星团大小约为80Kb，包含两部分，在浅层和深层都完全保守”坎迪达斯Endobugula sertula“菌株；这个布莱聚类并没有揭示不同苔藓抑制素基因型的起源B.内毒碱兄弟物种。这两部分是71kb布莱BCXDAPKS操纵子，由五个巨大的I型PKS基因组成，以及6kb布莱PQRS操纵子，有四个较小的辅助基因(图4) [36]. C-20氧化和C-7和C-20修饰的基因在布莱区域。在深处”坎迪达斯Endobugula sertula“菌株的两部分不相邻，而在Shallow菌株中，它们形成了一个统一的可能是祖先的基因座(图4). 三个大的相同序列在布莱BCXDAPKS操纵子必须代表通常通过重组解决的复制事件，这表明，与其他专性共生体一样，”坎迪达斯Endobugula sertula”是重组缺陷型。

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图4

组织布莱集群。浅灰色方框和虚线强调了“坎迪达斯Endobugula sertula”。模块化聚酮合成酶基因显示为开放箭头，辅助功能、初级代谢和转座酶基因分别显示为橙色、深灰色和黑色箭头。在布莱BCXDAPKS操纵子以浅蓝色、金色和粉色方框表示。拟参与“bryostatin 0”组装的PKS模块显示为黑色条，并根据其作用顺序进行编号。改编自[37].

对催化结构域的顺序和序列特征的分析表明布莱簇合酶在模块内缺乏酰基转移酶（AT）结构域，因此属于反式-AT I型包装。除了神秘布瑞克斯，预测的酶反应与合成“bryostatin 0”所需的生物合成步骤显著相关(图5) [35,36]. 特别是，通过布莱A_LM公司[35]模块4和9中甲基转移酶（MT）结构域的位置与gem-dimethyl基团的引入相匹配，模块8中吡喃环的形成与吡喃合成酶（PS）结构域相匹配[36]相信生物合成的提议(图5). 此外，最近在体外BryP的特性，tandem-AT由布莱普，最终表明该酶能够在天然和异源酰基载体蛋白（ACP）结构域以及整个结构域上选择性地酰化丙二酰辅酶A反式-AT PKS模块，证实了BryP在反式-所有延伸部分的荷载布莱集群模块[37].

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图5

拟合成苔藓抑制素。A–BryKS结构域的底物特异性。除了D-乳酸起始单元外，所有假设识别的底物都以颜色突出显示。B–前体链伸长。添加的底物在修改后显示，并在A中显示的色码后高亮显示。催化域显示为灰色，或者在假设为非活性时显示为白色气泡。酰基-载体蛋白结构域显示为小的填充圆圈，其生长链由硫醇基团连接。两个具有分裂模块的蛋白质显示为粉红色。该框详细说明了HMG-CoA合成酶驱动的乙酰-CoA缩合到C13/C20β-酮基上。综述文本中未包含的缩写词：KR，酮还原酶；OMT，O-甲基转移酶；ER，烯醇还原酶；DH，脱水酶；C、 冷凝。DH*和KR*分别是DH和KR-like结构域，参与从FkbH-like结构区负载的3个碳前体合成D-乳酸起始单元[36].

自出版以来布莱Piel的小组发现反式自动变速器PKS可以根据序列相似性分为不同类型[38]. 这些类型反映了β碳处传入前体的结构，因此也反映了前体模块催化的特定反应。皮尔分析[39]的KS域布莱簇支持Sudek等人提出的假设[36]那个布莱“bryostatin 0”生物合成的簇代码。事实上，修订后的方案中只修改了两个生物合成步骤，这些差异反映了由几乎相同的bryostatin途径模块3和模块7（分别为Bry_M3和Bry_M7）加载的酰基单元发生分支的步骤[39]. 在该分析中，拟由羟基-甲基-戊二醛-CoA合成酶（HMG-CS）催化的乙酰-CoA部分的缩合反应BryR发生在负载丙二酰-CoA底物的β-酮基团上，发生在链伸长期间，而不是大环化之后[39] (图5B，基板为红色）。这与BryKS4和BryKS8分组为包层Ib相一致(图5A)对β-分支底物具有特异性的KS结构域。催化结构域注释的不断进步正在改进用于化学结构预测的工具反式-AT系统。如果是布莱聚类，这些工具可能有助于确定BryX的作用，该PKS具有令人好奇的异常催化域星座，在苔藓抑制素前体生物合成中没有明显作用(图4和​和5）。5). 然而，bryX公司在布莱深部和浅部集群”坎迪达斯Endobugula sertula“菌株，并以共生状态表达，表明其可能具有功能[36].

苔藓抑制素未来研究的挑战与机遇

虽然我们对B.内毒碱-“坎迪达斯Endobugula sertula”系统，它可能是生物活性代谢物共生的最全面的例子。通过分子方法鉴定了未培养的共生体，对生物活性代谢物进行了表征，推测了可能的生物合成途径，并建立了共生的生态基础。然而，仍有许多问题需要解决。

总结

这个Bugula-Endobugula虫-苔藓抑制素系统是一个由生物学、生态学、微生物学和化学组成的复杂织锦，将继续吸引研究人员。鉴于临床使用的苔藓抑制素越来越受到关注，可能会寻求合成和异源表达策略，以产生足够的活性化合物。从苔藓抑制素的自然生物学背景下的研究中获得的进一步见解将促进海洋生物学，并为生物技术研究提供信息。

脚注

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