神经胃肠病杂志。2015年7月；21(3): 380–389.
Achalasia与eNOS4a4a、iNOS22GA和nNOS29TT基因型相关：一项病例对照研究
,1 ,1,* ,1和2
拉詹·辛格
1勒克瑙桑杰·甘地医学科学研究生院消化科，印度
Uday C Ghoshal公司
1勒克瑙桑杰·甘地医学科学研究生院消化科，印度
阿莎·米斯拉
1勒克瑙桑杰·甘地医学科学研究生院消化科，印度
Balraj Mittal公司
2勒克瑙桑杰·甘地医学科学研究生院医学遗传学系，印度
1勒克瑙桑杰·甘地医学科学研究生院消化科，印度
2勒克瑙桑杰·甘地医学科学研究生院医学遗传学系，印度
Rajan Singh和Uday C Ghoshal都是本文的第一作者。
*通信：Uday C Ghoshal，MD，DNB，DM，FACG，RFF，印度勒克瑙桑杰·甘地医学研究生院消化科，电话：+91-522-2494405，传真：+915522-2668017或2668078，电子邮箱：moc.liamg@lahsohgyadu 2014年12月27日收到；2015年1月25日修订；2015年1月25日接受。
摘要
背景/目标
众所周知，失弛缓症是由抑制性神经元退化引起的，这些神经元大多具有氮能。贲门失弛缓症的特征性特征包括食管下括约肌（LES）松弛不全和食管不通畅。一氧化氮（NO）由一氧化氮合酶（NOS）产生，在肠蠕动和LES松弛中起重要作用。因此，我们评估了失弛缓症患者和健康受试者（HS）中NOS基因亚型（内皮型NOS[eNOS]、诱导型NOS[CiNOS]和神经元型NOS[nNOS]）的遗传多态性。
方法
通过聚合酶链反应（PCR）和PCR-限制性片段长度多态性（RFLP）分别对连续患有贲门失弛缓症（经食管测压确诊）和HS的患者进行27碱基对（bp）eNOS可变串联重复数（VNTR）、iNOS22G/A（rs1060826）、nNOS C/T（rs2682826）多态性的基因分型。
结果
183名贲门失弛缓症患者（118名[64.5%]男性，年龄39.5±13.0岁）和366名HS患者（254名[69.4%]男性，年龄40.8±11.0岁）中，27bp VNTR的eNOS4a4a基因型在贲门失弛缓症中比HS更常见（20名[10.9%]vs 13名[3.6%]；P（P）< 0.001; OR，3.72；95%置信区间1.8-7.7）。贲门失弛缓症患者iNOS22GA基因型的频率高于HS（95[51.9%]vs 93[25.4%]；P（P）< 0.001; OR，3.0；95%置信区间，2.1–4.4）。患者中GA+AA基因型的频率高于HS（97[53%]vs 107[29.2%]；P（P）< 0.001; OR，2.7；95%置信区间1.8-3.9）。此外，与HS患者相比，rs268226中的nNOS29TT变异基因型在HS患者中更常见（14[7.7%]vs 6[1.6%]；P（P）< 0.001; OR，5.91；95%置信区间2.2-15.8）。
结论
Achalasia与eNOS4a4a、iNOS22GA和nNOS29TT基因型相关。这可能表明eNOS、iNOS和nNOS基因多态性是贲门失弛缓症的危险因素。
关键词：食管运动障碍，基因，运动性吞咽困难，一氧化氮，多态性
介绍
失弛缓症是运动性吞咽困难的常见原因。1其发病机制尚不清楚。2–4遗传因素在其发病机制中可能很重要，因为偶尔的家族聚集、单卵双胞胎之间的一致性以及贲门失弛缓症和先天性巨结肠症之间的相关性的报告都支持这一点，先天性巨幼症与遗传基础类似。5–7贲门失弛缓症的特征是食管开口和食管下括约肌（LES）不完全松弛，这是由肌间神经丛中的神经节细胞变性引起的。8贲门失弛缓症患者的食管功能异常是由于抑制性神经支配丧失所致。9
一氧化氮（NO）是食管肌间神经丛最重要的抑制性神经递质；它逐渐延迟食道远端的肌肉收缩，防止同时收缩，并在健康人吞咽时放松LES。三因此，含NO神经元的退化会导致食管体同时收缩，并导致吞咽诱导的LES松弛失败。9,10NO由一氧化氮合酶（NOS）合成，NOS有3种亚型，即内皮型NOS（eNOS）、诱导型NOS和神经元型NOS。11,12编码这些亚型的基因分别位于人类染色体7q36、17q11.2-q12和12q24.2中，它们具有多个多态性。11,13–19
eNOS、iNOS和nNOS基因的多态性导致“高”或“低”生产者等位基因的出现。高生产者等位基因纯合的受试者合成的NO量最高，低生产者等位基因纯合的受试者合成的NO量最低，而杂合子产生的NO量中等。13,20在27个碱基的可变串联重复序列（VNTR）多态性中，已鉴定出2个等位基因；其中较大的eNOS-4b（NO的高产生子）有5个串联27-bp重复序列（GAAGTCTAGACCTGCTGC[A/G]GGGTGAG），较小的eNOS-4a（NO的低产生子）则有4个串联27-bp重复序列。21eNOS的27-bp VNTR多态性与低血浆一氧化氮浓度有关。22iNOS（G/A-37498）多态性的功能作用尚不清楚，但它可能改变NO活性。16第29外显子中nNOS C/T的等位变异位于该基因的非翻译区，可能影响nNOS mRNA的表达速率和稳定性。23然而，关于NOS基因亚型多态性与贲门失弛缓症之间关系的研究还很少。在西班牙的一项研究中，发现贲门失弛缓症患者中iNOS22A和eNOS4a4a基因型的患病率较高。11然而，差异在统计学上并不显著。在西班牙的另一项研究中，贲门失弛缓症患者iNOS22A基因型的频率低于对照组。24因此，需要对更多的患者和对照进行研究。
我们假设eNOS、iNOS和nNOS基因的低产量多态性可能与贲门失弛缓症有关。因此，我们旨在研究与健康受试者（HS）相比，贲门失弛缓症患者eNOS（27bp VNTR）、iNOS22（G/A-37498）和nNOS 29（C/T）基因的宿主遗传多态性，并评估各种亚型贲门失弛缓症与基因型之间的关系。
材料和方法
研究参与者
样本量计算
使用Quanto版本1.1.1计算样本量。eNOS 27-bp VNTR多态性的样本量根据以下参数计算：显著性水平（双尾）0.05，比值比（OR）2.0，研究功率80%，病例与对照的比值等于1:2；根据之前的研究，预计患有贲门失弛缓症的人口比例为0.01%，而印度报告的控制人群eNOS“4a”变异等位基因频率为23%。13,25样本量估计为183名患者和366名对照。
计算iNOS基因G/A-37498多态性的样本量，保持上述所有参数不变，法国报告的对照组变异“A”等位基因频率为41%。23样本量估计为145名患者和290名对照。
同样，根据上述参数和西班牙报告的对照人群中变异“T”等位基因频率26%计算nNOS基因C/T多态性的样本量。11样本量估计为171名患者和342名对照。
在5年期间（2008年至2013年），纳入了183名贲门失弛缓症患者。根据临床、放射学、内镜参数怀疑贲门失弛缓症的诊断，并根据标准参数通过食管测压（常规或高分辨率，HRM）进行确认。26–28
HS受社区邀请。共有366名年龄和性别相匹配、无任何明显胃肠道症状、种族相似的非血缘性HS作为同一人群的对照。所有患者和对照组均同意参与研究。机构道德委员会批准了研究方案。
临床评估
根据以下评分系统评估吞咽困难、反流和胸痛的严重程度：0，从不；1、每月一次；2、每周一次；每周3、2至4次；4、每天一次；5次，每天数次。还评估了其他症状，如反流、烧心、眼球感觉。
食管测压
从2008年5月到2010年10月，患者接受了常规测压（n=96），从2010年11月到2013年5月，进行了HRM（n=87）。常规食管测压采用标准技术，采用站式和快速拉通法。26使用水灌注系统（G S Hebbard系统，澳大利亚墨尔本）和使用标准技术的16端口导管进行食管HRM。使用“Trace 1.2”软件（G S Hebbard系统）分析测压信号，并将其应用于Clouse图的数据跟踪。腹内压被用作任何压力测量的基线。
失弛缓症的诊断和分型
Achalasia分别在常规、HRM和亚型上使用标准标准和芝加哥分类进行诊断。26,27,29根据标准方法，对10只（每只5毫升）吞咽水的小鼠进行了身体运动、远端收缩积分和综合松弛压力（IRP）的评估。27采用常规血压计将患者分为典型型和强直型。29在HRM上，贲门失弛缓症根据芝加哥分类分为I型、II型和III型。28在早期分类中，患有低幅度收缩（平均幅度≤40 mmHg）的贲门失弛缓症患者被归类为典型贲门失驰缓症。食管体高振幅收缩（平均振幅>40 mmHg）的患者，无论是局灶性节段性还是弥漫性，均被归类为重度贲门失弛缓症。29在目前的芝加哥分类中，10只湿燕子中有8只以上的远端食道增压不超过30 mmHg，表现为身体低幅度收缩的人被归类为I型，在10只湿燕中至少有2只的泛食管加压至>30mmHg的被归类为II型，而在10只湿燕中有2只或更多只的远端蠕动或过早（痉挛）收缩片段保留的被归类为III型。30IRP值必须大于10 mmHg才能诊断I型贲门失弛缓症，大于15 mmHg才诊断II型和III型贲门失调症。31为了本研究的目的，我们根据旧分类将经典贲门失弛缓症和根据当前芝加哥分类的I型贲门失驰缓症分组为低振幅和剧烈贲门失失弛缓病，根据旧分类的II型和III型贲门失缓症，根据新分类的高振幅贲门失缓症。
样品采集
使用商用试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚Qiagen公司）从乙烯二胺四乙酸（EDTA）中的静脉血中提取基因组DNA，用于研究NOS基因多态性。
DNA的定量和存储
通过260 nm和280 nm处的光密度（OD）比评估DNA的质量和纯度。DNA在260 nm和280 nm处的吸光度比约为1.7–1.9。在1×TBE缓冲液中，1%琼脂糖凝胶电泳也证实了DNA的纯度。
内皮型一氧化氮合酶基因27-碱基对可变串联重复数多态性的基因分型
采用聚合酶链反应（PCR）对eNOS基因27-bp VNTR进行基因分型。PCR扩增在总体积为25μL的条件下进行，使用10 pmol的正向和反向引物。正向引物为5′-AGGCCCTATGGTGCCTTT-3′，反向引物为5'-TCTCTAGCTGTGGTCA-3′。PCR反应混合物的成分包含100–150 ng基因组DNA，1.5 mM MgCl2、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM KCl、0.2 mM每个dNTP和2.0 U Taq DNA聚合酶（印度班加罗尔Genei）。PCR扩增方案如下：在97°C下初始变性5分钟，然后在95°C下进行35次变性1分钟，在55°C下退火30秒，在72°C下延伸1分钟，以及在72°C下延伸10分钟。PCR产物在3%琼脂糖凝胶上分离，并在紫外线照射下溴化乙锭染色后进行可视化。确定了两个不同的等位基因，分别表示为等位基因4b（5个重复）和4a（4个重复）().11
内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、诱导型NOS（iNOS）22 G/A（rs1060826）和神经元型NOS C/T（rs2682826）多态性的27碱基对（bp）可变串联重复序列的代表性凝胶图片。（A） eNOS多态性27-bp VNTR的聚合酶链反应（PCR）产物在3%琼脂糖凝胶电泳（AGE）上进行：第2-7道显示不同的基因型，第1道显示50-bp的DNA阶梯。（B） iNOS22 G/A多态性的PCR-限制性片段长度多态性产物（rs1060826）在3%AGE上运行：第2-7道显示不同的基因型，第1道显示50-bp的DNA阶梯。（C） 在15%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上对nNOS C/T多态性的PCR-限制性片段长度多态性产物（rs2682826）进行分析：1–3和5–6道显示不同的基因型，4道显示50-bp的DNA阶梯。
诱导型一氧化氮合酶基因G/A-37498多态性的基因分型
iNOS基因G/A（rs1060826）的基因分型采用PCR和限制性酶切法。PCR扩增在总体积为25μL的条件下进行，使用10 pmol的正向和反向引物。使用的正向引物为5′-CTGGCTTCCTGCTTTCC-3′，反向引物为5'-CTCGGTGTAGGTGACC-3′。基因组DNA（100-150 ng），1×500 mM KCl缓冲液（pH 8.4），5 mM MgCl2在PCR反应混合物中使用0.2mM dNTP组和1U Taq DNA聚合酶（Bangalore Genei）。PCR扩增的方案如下：在95℃下初始变性10分钟，然后在95℃进行34个周期的变性1分钟，在66℃下退火30秒，在72℃下延伸30秒。在72°C下的最后延伸时间为10分钟。PCR产物在37°C下用限制性内切酶Btg（10 U/μL，NEB）消化过夜，片段在3%琼脂糖凝胶上用溴化乙锭染色进行分析。G等位基因由78、24和24 bp的3个片段定义，A等位基因则由102 bp和24 bp两个片段定义().11
神经型一氧化氮合酶基因C/T多态性的基因分型
采用PCR和限制性酶切技术对nNOS29基因C/T（rs2682826）进行基因分型。PCR扩增在总体积为25μL的条件下进行，使用10 pmol的正向和反向引物。使用的正向引物为5′-TTGGTTTTCGCTGCGATGT-3′，反向引物为5'-GCTTGGCCTAGCCTGCA-3′。基因组DNA（100–150 ng），1×500 mM KCl缓冲液（pH 8.4），5 mM MgCl2PCR反应混合物中使用了0.2 mM dNTP集和1 U Taq DNA聚合酶（班加罗尔基因）。PCR扩增如下：在95°C下初始变性6分钟，然后在95°C下变性1分钟，在68°C下退火30秒，在72°C下延伸30秒。在72°C下的最后延伸时间为10分钟。PCR产物在37°C下用限制性内切酶NlaIII（5 U/μL；德国法兰克福新英格兰生物实验室）消化过夜，并在溴化乙锭染色的15%聚丙烯酰胺凝胶上分析片段。C等位基因由102、69和16 bp的3个片段定义，T等位基因则由94、69、16和8 bp的4个片段定义().23
统计方法
采用χ2列联表比较贲门失弛缓症和HS患者基因型频率的差异2使用Yates修正进行测试（如适用）。采用直接基因计数法测定基因型频率。χ2拟合优度检验用于检查HS中Hardy-Weinberg平衡的任何偏差。使用未配对分析连续数据t吨测试。P（P）-小于0.05的值被认为是显著的。采用二元logistic回归分析NOS基因多态性与贲门失弛缓症的相关性。根据年龄和性别等混杂因素调整OR。使用统计软件SPSS 15.0版（美国伊利诺伊州芝加哥市SPSS公司）对数据进行分析。
结果
研究参与者的性别和年龄
贲门失弛缓症患者（n=183；39.5±13.0岁；118[64.5%]男性）在年龄和性别方面与HS患者（n=366；40.8±11.0岁；254[69.4%]男性）具有可比性，且均为印度北部无血缘关系的本地人。HS患者均无吞咽困难、明显反流（每周两次以上）或胸痛。没有人患有罗马III标准定义的功能性胃肠疾病。32在HS中，基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡。
临床参数和表型特征
183例贲门失弛缓症患者均有长时间（41.6±50.0个月）的每日吞咽困难。吞咽困难、反流和胸痛等症状的中位数严重度评分分别为5.0（范围：1-5）、3.0（0-5）和1.0（0-5。一些患者还报告了鼻返流和鼻丸阻塞(). 上消化道内窥镜检查结果包括：LES紧绷（n=26[14.2%]）、食管体扩张（n=30[16.4%]），LES紧闭和体扩张（n=23[12.6%]）；食物残渣过多（n=4[2.2%]），体扩张伴食物残渣（n=47[25.7%]）和正常（n=53[29%]）。钡剂食管造影显示：食管体扩张（n=16[8.7%]），下端鸟喙状（n=50[27.3%]）、扩张体鸟喙样（n=92[50.3%]，正常研究（n=25[13.7%]）。
表1。
| 参数 | 贲门失弛缓症患者（n=183） |
|---|
| 年龄（平均值±标准偏差，年） | 39.5 ± 13.0 |
| 性别（男性，n[%]） | 118 (64.5) |
| 吞咽困难（n[%]） | 183 (100.0) |
| 每周反流两次以上（n[%]） | 119 (65.0) |
| 肝团梗阻（n[%]） | 65 (35.5) |
| 眼球感觉（n[%]） | 86 (47.0) |
| 鼻返流（n[%]） | 113 (61.7) |
| 心跳（n[%]） | 49 (26.8) |
| 胸痛（n[%]） | 93 (50.8) |
| 咳嗽（n[%]） | 89 (48.6) |
| 重量损失（n[%]） | 121 (66.1) |
| 吞咽困难持续时间（平均值±SD，mo） | 41.6 ± 50.0 |
| LES压力（平均值±SD，mmHg） | 38.5 ± 18.7 |
| DCI（中值[范围]，mmHg·sec·cm） | 1139 (0–10750) |
| IRP（平均值±SD，mmHg） | 35.3 ± 20.0 |
| 食管远端最大压力（平均值±SD，mmHg） | 44.8 ± 27.0 |
| 贲门失弛缓症的亚型 | |
| 低幅度贲门失弛缓症 | 104 (56.8) |
| 高振幅贲门失弛缓症 | 79 (43.2) |
Achalasia的亚型
在常规食管测压（96例患者）中，74例为典型贲门失弛缓症，22例为剧烈贲门失驰缓症。在HRM（87例患者）中，30例、56例和1例分别为I型、II型和III型贲门失弛缓症，采用芝加哥分类。27为了进行分析，典型贲门失弛缓症分为I型（74+30=104，称为低幅度贲门失驰缓症）和II型和III型（22+56+1=79，称为高幅度贲门失调症）。
测压参数
I型贲门失弛缓症患者的基底LES压力较低()与其他子类型相比。I型贲门失弛缓症的远端收缩积分和IRP低于其他亚型(). 在10只受试燕子中，I型贲门失弛缓症患者的最大食管压力（绘制的值是每个患者在远端任何位置压力最高的平均值）低于其他亚型患者().
贲门失弛缓症患者血压参数的比较。（A） 食管下括约肌（LES）压力（mmHg）。（B） 远端收缩积分（DCI，mmHg·sec·cm）。（C） 综合松弛压力（IRP，mmHg）。（D） 最大远端食管压力（mmHg）。仅在接受高分辨率测压的贲门失弛缓症患者中计算DCI和IRP。
内皮型一氧化氮合酶27碱基对可变串联重复数多态性的结果
贲门失弛缓症和HS患者的基因型分布如图所示贲门失弛缓症患者27-bp VNTR的eNOS4a4a基因型（低NO产生者）频率高于HS（20[10.9%]vs 13[3.6%]，P（P）< 0.001). 然而，其他基因型，即eNOS4b4a（NO的中间产物）和4b4b（NO的高级产物）在患者和HS中的频率相似。eNOS4a4a基因型受试者（NO低产生者）与贲门失弛缓症显著相关（OR，3.72；95%CI，1.8-7.7；P（P）< 0.001).
表2。
失弛缓症患者和健康人内皮型一氧化氮合酶27-bp可变串联重复数基因多态性的基因型频率
| 基因型 | 贲门失弛缓症患者一(%) | HS编号一(%) | P（P）-价值 | OR（95%置信区间） |
|---|
| eNOS4b4b（NO的高级产物） | 111 (60.7) | 269 (73.5) | - | 参考 |
| eNOS4b4a（NO的中间生产者） | 52 (28.4) | 84 (23.0) | 0.053 | 1.50 (0.99–2.20) |
| eNOS4a4a（NO的低生成物） | 20 (10.9) | 13 (3.6) | <0.001 | 3.72 (1.80–7.70) |
诱导型一氧化氮合酶基因G/A（rs1060826）多态性结果
贲门失弛缓症患者的iNOS22GA基因型多于HS（95[51.9%]vs 68[25.4%]，P（P）< 0.001) (). 还使用最常见的纯合子基因型作为参考，并假设iNOS22“a”等位基因为高危等位基因，计算显性遗传模型的风险估计值。应用显性模型（GG vs GA+AA），iNOS22G/A多态性与贲门失弛缓症相关（OR，2.7；95%CI，1.8-3.9；P（P）< 0.001) ().
表3。
失弛缓症患者和健康人诱导型一氧化氮合酶G/A-37498基因多态性的基因型频率
| 基因型 | 贲门失弛缓症患者一(%) | HS编号一(%) | P（P）-价值 | OR（95%置信区间） |
|---|
| iNOS22GG（野生型） | 86 (47.0) | 259 (70.8) | - | 参考 |
| iNOS22GA（杂合基因型） | 95 (51.9) | 93 (25.4) | <0.001 | 3.00 (2.10–4.40) |
| iNOS22AA（变异基因型） | 2 (1.1) | 14 (3.8) | 0.270 | 0.43 (0.10–1.90) |
表4。
失弛缓症患者和健康人诱导型一氧化氮合酶G/A-37498基因多态性（显性模型）的基因型频率
| 基因型 | 贲门失弛缓症患者N一(%) | HS编号一(%) | P（P）-价值 | OR（95%置信区间） |
|---|
| iNOS22GG（野生型） | 86 (47.0) | 259 (70.8) | - | 参考 |
| iNOS22GA+AA（杂合+纯合变异基因型） | 97 = 95 + 2 (53.0) | 107 = 93 + 14 (29.2) | <0.001 | 2.70 (1.80–3.90) |
神经型一氧化氮合酶基因C/T（rs2682826）多态性结果
贲门失弛缓症患者的nNOS29TT基因型多于HS（14[7.7%]vs 6[1.6%]，P（P）< 0.001). 然而，其他基因型如CC和CT在HS患者中的频率相似(). 具有nNOS29TT基因型的受试者与贲门失弛缓症的相关性高于nNOS28CT和nNOS23C（OR，5.91；95%CI，2.2-15.8；P（P）< 0.001).
表5。
失弛缓症患者和健康人神经型一氧化氮合酶29 C/T基因多态性的基因型频率
| 基因型 | 贲门失弛缓症患者一(%) | HS编号一(%) | P（P）-价值 | OR（95%置信区间） |
|---|
| nNOS29CC（野生型） | 97 (53.0) | 246 (67.2) | - | 参考 |
| nNOS29CT（杂合基因型） | 72 (39.3) | 114 (31.1) | 0.140 | 1.60 (1.00–2.30) |
| nNOS29TT（变异基因型） | 14 (7.7) | 6 (1.6) | <0.001 | 5.90 (2.20–15.80) |
不同亚型贲门失弛缓症患者内皮型一氧化氮合酶27-bp可变串联重复数、诱导型一氧化氮合成酶22G/A和神经性一氧化氮合酶29C/T多态性
eNOS 27-bp VNTR多态性在低幅和高幅贲门失弛缓症患者中的频率具有可比性（基因型：eNOS4b4b 62/104[59.6%]、4b4a 31/104[29.8%]、4a4a 11/104[10.6%]vs 4b4b 49/79[62.0%]、4b 4a 21/79[26.6%]、4 a4a 9/79[11.4%]；P（P）= 0.940). 同样，iNOS G/A-37498多态性的频率在不同亚型贲门失弛缓症之间具有可比性（基因型：iNOS22GG 47/104[45.2%]、GA 56/104[53.8%]、AA 1/104[1%]，在低幅度贲门失驰缓症患者中，与GG 39/79[49.4%]、GA 39/79[C9.4%]、AA 1/79[1.3%]，在高幅度贲门失调症患者中；P（P）= 0.890). 此外，nNOS29 C/T多态性在不同亚型贲门失弛缓症之间具有可比性（基因型：低幅度贲门失驰缓症患者中的nNOS29CC 54/104[51.9%]、CT 42/104[40.4%]、TT 8/104[7.7%]与高幅度贲门失缓症患者的CC 43/79[54.4%]、CT 30/79[38%]、TT6/79[7.6%]；P（P）= 0.910).
讨论
对大量贲门失弛缓症和HS患者的研究表明，27-bp VNTR的eNOS4a4a基因型、iNOS22GA基因型和rs268226的nNOS29TT变异基因型在贲门失驰缓症患者中比HS患者更常见。此外，应用显性模型（GG vs GA+AA），iNOS22 G/a多态性与贲门失弛缓症相关。然而，这些基因型与贲门失弛缓症的各种亚型之间没有关系。
抑制性和兴奋性神经元之间的不平衡可能导致贲门失弛缓症。三早些时候，人们认为抑制神经元是多巴胺能和VIP能神经元；然而，随后报道的几项里程碑式的研究表明，大多数抑制性神经元是氮能神经元。4,33,34众所周知，失弛缓症是由这些抑制神经元的退化引起的，这些抑制神经元主要是氮能神经。35–37在这项研究中，我们检测了抑制神经元（主要是氮能神经元）的退化是否与NOS基因的多形性有关。NOS基因具有多种多态性，如eNOS的27-bp VNTR多态性、iNOS基因第16外显子和nNOS第29外显子的双等位基因多态性。NOS基因亚型中这些多态性的存在可能影响NOS的表达和活性，并可能导致NO生成的变化。一些研究表明，这些多态性与帕金森病、偏头痛和心血管疾病有关。22,23,38在不同的研究中，有研究表明，与对照组相比，贲门失弛缓症患者LES的NOS较少。9动物研究表明，食管蠕动和LES松弛通常由NO控制。9,39,40此外，缺乏nNOS的敲除小鼠表现出与失弛缓症患者相似的高渗LES，吞咽松弛受损。36这些观察结果可以解释eNOS、iNOS和nNOS基因多态性与贲门失弛缓症之间的相关性。
我们的研究表明，与eNOS4b4b基因型相比，27-bp VNTR多态性的eNOS4a4a基因型与贲门失弛缓症相关。Mearin等人之前的病例对照研究11结果表明，27-bp VNTR多态性在贲门失弛缓症和HS患者之间具有可比性。然而，该研究中患者和对照组的样本量较小；因此，很可能出现第二类统计误差。在e-NOS的27-bp VNTR多态性中，4a等位基因与血浆NO水平降低有关。4a等位基因纯合子受试者的NO水平比4b等位基因受试者低20%。21因此，eNOS4a4a基因型贲门失弛缓症患者产生的NO量较少，导致食管体同时收缩，吞咽诱导的LES松弛失败。三因此，我们的发现表明贲门失弛缓症与eNOS4a4a基因型的存在有关联，这一发现很重要，因为该基因型与低水平NO有关，而NO在贲门失驰缓症的发展中起作用。
我们的数据显示失弛缓症和HS患者之间iNOS22 G/a多态性的基因型频率存在差异。由于纯合AA基因型患者数量较少，我们构建了一个显性模型（GG vs GA+AA）来观察“a”等位基因对贲门失弛缓症发病风险的影响。我们的数据表明，存在“A”等位基因携带者基因型（iNOS22GA和AA）与贲门失弛缓症相关。iNOS22 G/A多态性的功能作用尚不清楚。23由于我们的研究结果表明，它可能与贲门失弛缓症有关，因此这些基因可能与其他基因连锁不平衡，这可能与抑制性神经元的退化有关。41与我们的研究相反，Mearin等人之前的研究11和Vigo等人24表明iNOS22 G/A多态性在贲门失弛缓症和HS患者之间具有可比性。然而，他们并没有构建主导模型；此外，这些研究的样本量小于我们的研究。在这个问题上需要进行更多的研究。
我们的研究表明，与nNOS29CC基因型相比，nNOS29 C/T多态性的nNOS29/TT基因型与贲门失弛缓症相关。nNOS29 C/T多态性的功能作用尚不清楚。然而，该基因作为各种神经退行性疾病的危险因素的重要性，如精神分裂症、帕金森氏病、额颞叶退行性变、自杀行为和阿尔茨海默氏病，已通过关联研究确定。20,23,42,43这些研究证实，nNOS29 C/T多态性的T等位基因具有较高的疾病易感性风险。失弛缓症也是一种神经退行性疾病，不仅局限于食道，而且还延伸至大脑，迷走神经瓦勒变性、脑干中存在路易小体、胰岛素诱导低血糖时自主神经反应受损、，与其他神经疾病相关的罕见报道，如先天性巨结肠、肠假性梗阻和胃轻瘫。44–46因此，认为nNOS 29 C/T多态性与贲门失弛缓症有关是合乎逻辑的。然而，关于这个问题的数据很少。在迄今为止报道的一项小型病例对照研究中，nNOS29 C/T多态性在贲门失弛缓症和HS患者中具有可比性。11然而，我们的研究与该研究相矛盾，表明nNOS29TT基因型的存在与贲门失弛缓症有关。
我们比较了不同亚型贲门失弛缓症eNOS 27-bp VNTR、iNOS G/A-37498和nNOS29 C/T多态性。在低幅和高幅贲门失弛缓症中，这些多态性的频率没有差异。这并非完全出乎意料。在贲门失弛缓症的早期，尽管存在抑制性神经元如氮能神经元的退化，但胆碱能系统保持完整，因此，食管收缩幅度较高，尽管这是同时发生的。在后期，胆碱能系统退化导致收缩幅度降低。三,33事实上，这是将传统测压的典型贲门失弛缓症患者与HRM上的I型贲门失驰缓症患者相结合的基础。因此，预计各亚型贲门失调症的基因型不会有所不同。此外，当将年龄作为判别因素进行关联分析时，我们的研究表明，发病年龄与NOS基因多态性之间没有关联。然而，在Paladini等人的研究中，47只有晚发性贲门失弛缓症与VIPR1基因多态性相关（rs437876和rs896）。
本研究的重点在于患者和对照组的大量样本。该样本量的功效为80%（不发生II类错误的概率），以检测1.5或更高的风险。然而，我们的研究有一些局限性。我们没有研究NOS酶的表达和/或活性。更多关于RNA功能分析的研究可能会加强我们的假设。我们没有对HS进行测压以排除贲门失弛缓症。然而，由于我们的患者没有出现吞咽困难、严重反流和胸痛等症状，贲门失弛缓症几乎没有无症状，48我们认为这不是我们研究的主要局限。此外，在如此大的HS样本中进行测压是不符合道德的。我们的发现可能是针对特定人群的。因此，在将结果推广到其他人群之前，需要在其他人群中进行更多的研究来验证这一假设。总之，我们的研究表明eNOS4a4a、iNOS22（GA+AA）和nNOS29TT基因型与贲门失弛缓症相关。因此，本研究为贲门失弛缓症发病机制的遗传因素提供了支持。然而，遗传因素可能在各种亚型贲门失弛缓症的发展中发挥不了多大作用。
脚注
财政支持：无。
利益冲突：无。
作者贡献：Rajan Singh，数据收集，分子工作，数据分析，手稿起草；Uday C Ghoshal，研究概念和设计，对工作规划和执行的贡献，患者招募，上消化道内窥镜和食管测压程序，工作监督，对数据分析的贡献，以及对重要知识内容手稿的批判性修订；Asha Misra，食管测压程序技术援助；以及Balraj Mittal，在遗传分析、分子工程监督和手稿编辑方面的宝贵投入。
ORCID:Uday C Ghoshal，http://orcid.org/0000-0003-0221-8495.
工具书类
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