Vemurafenib耐药性使黑色素瘤细胞重新编程为谷氨酰胺依赖性细胞
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珍妮·埃尔南德斯·戴维斯
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
泰语Q Tran
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系91010
迈克尔·A·里德
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
金伯利·R·罗莎莱斯
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
Xazmin H Lowman先生
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
最小平移
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
盖蒂安·莫里索
美国加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院皮肤科/医学部，邮编：90095-1662
Jonsson综合癌症中心，David Geffen医学院，加利福尼亚大学洛杉矶分校，美国加利福尼亚州90095-1662
杨莹
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
吴军（Jun Wu）
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望城癌症中心贝克曼研究所比较医学部动物肿瘤模型项目，邮编：91010
罗杰·斯洛
美国加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院皮肤科/医学部，邮编：90095-1662
Jonsson综合癌症中心，David Geffen医学院，加利福尼亚大学洛杉矶分校，美国加利福尼亚州90095-1662
梅岗
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望之城癌症中心贝克曼研究所癌症生物学系，邮编：91010
美国加利福尼亚州杜阿尔特市希望城癌症中心贝克曼研究所比较医学部动物肿瘤模型项目，邮编：91010
美国加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院皮肤科/医学部，邮编：90095-1662
美国加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院琼森综合癌症中心90095-1662
通讯作者。 2015年3月20日收到；2015年6月24日接受。
版权©Hernandez-Davies等人，2015年 摘要
背景
V600型BRAF公司突变导致约50%的转移性黑色素瘤，BRAF抑制剂（BRAFi）和基于耐药机制的BRAF和MEK抑制剂组合（BRAFi+MEKi）可将其作为治疗靶点。尽管联合治疗已被证明具有优越的临床效益，但获得性耐药性仍然普遍存在，并限制了总体生存效益。最近的研究表明，致癌变化可以导致肿瘤细胞代谢的改变，使细胞对营养物质（如谷氨酰胺氨基酸）产生依赖性。在这里，我们评估了获得性耐药的黑色素瘤细胞是否表现出谷氨酰胺依赖性，以及谷氨酰胺代谢是否可以成为治疗耐药细胞的潜在分子靶点。
方法
同基因BRAFi敏感父母V600型BRAF公司使用突变黑色素瘤细胞系和耐药（通过vemurafenib慢性治疗获得）亚系评估谷氨酰胺摄取和谷氨酰胺剥夺敏感性的差异。为了评估更广泛的抗性机制，还研究了亚系对BRAFi+MEKi具有抗性的等基因对。由于耐药细胞对谷氨酰胺缺乏症的敏感性增加，我们使用了谷氨酰胺酶抑制剂BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚]和L-左旋-DON（6-Diazo-5-oxo-我-去甲亮氨酸）治疗体内外MAPK途径抑制剂（MAPKi）耐药细胞群。
结果
我们证明，与MAPKi敏感细胞相比，MAPKi获得的耐药细胞摄取更多的谷氨酰胺，并且对谷氨酰胺缺乏的敏感性增加。此外，发现BPTES和L-DON在降低MAPKi耐药亚系细胞存活率方面比亲本细胞群更有效。我们还展示了突变体美国国家科学院对突变株谷氨酰胺成瘾至关重要美国国家科学院驱动阻力。在体内测试时，我们发现来自耐药细胞的异种移植物对BPTES或L-DON治疗比来自亲代细胞的更敏感。
结论
我们的研究证明了靶向谷氨酰胺代谢作为抑制黑色素瘤获得性MAPKi耐药性的替代策略的潜力。
关键词：黑色素瘤、Vemurafenib耐药性、谷氨酰胺、癌症代谢、，V600型BRAF公司,美国国家科学院、BPTES、L-DON
背景
黑色素瘤是最具侵袭性的皮肤癌之一，每年约有76100人受到影响，2014年约有9710人死亡[1,2]. 据美国癌症协会称，过去30年来，黑色素瘤的发病率一直在稳步上升[2]. 肿瘤基因突变BRAF公司在大约50-70%的转移性黑色素瘤中发现了编码丝氨酸-苏氨酸激酶的基因，该激酶是RAS–RAF–MEK–ERK信号级联的重要组成部分[1,三]. 中的突变BRAF公司通常在缬氨酸转化为谷氨酸的残渣600中发现(V600E版本BRAF公司)并导致过度活跃的BRAF激酶，导致不受控制的细胞增殖和癌基因成瘾[1,4,5].
用小分子抑制剂如vemurafenib（PLX4032）和dabrafenib对BRAF激酶进行单药抑制，或将BRAF抑制剂与MEK1/2抑制剂如cobimetinib和trametinib进行双药联合，已相继证明可提高患者生存率[6–11]. 然而，即使双药合用具有卓越的疗效，疾病控制也常常因获得性耐药性的发展而中断。遗传抗性机制最常见的结果是通过以下途径重新激活MAPK途径美国国家科学院或克拉斯突变，V600E/K型BRAF公司扩增或选择性剪接[5,12,13]. 相比之下，非遗传耐药机制通常导致MAPK路径冗余生存，受体酪氨酸激酶（如PDGFRβ）表达上调[5,12–14].
最近有研究表明，可以利用肿瘤细胞代谢来治疗癌症[15]. 20世纪20年代，奥托·沃伯格（Otto Warburg）发现癌细胞在有氧的情况下消耗非常高的葡萄糖并分泌大量的乳酸，被认为是“沃伯格效应”[15]. 这种低效消耗是为了满足肿瘤细胞中常见的生物合成和能量生产需求而设计的[16]. 研究表明，除了葡萄糖外，一些癌细胞还表现出“谷氨酰胺成瘾”，以支持刺激细胞增殖的合成代谢过程[17]. 谷氨酰胺已被证明是核苷酸和蛋白质合成所必需的氮的提供者，并影响蛋白质翻译的关键调节器，即雷帕霉素复合物（mTORC）的哺乳动物靶点1[17]. 研究还指出，致癌变化可以调节癌细胞中的谷氨酰胺代谢。例如，致癌c-myc与高亲和力谷氨酰胺转运体的转录调控有关，以促进谷氨酰胺水解[17]. 胰腺导管腺癌（PDAC）细胞也被证明强烈依赖谷氨酰胺，谷氨酰胺代谢的这种重新编程被发现是由致癌介导的关键代谢酶的转录上调驱动的克拉斯[18]. 在黑色素瘤中，已有研究表明谷氨酰胺转运体ASCT2在V600E型BRAF公司突变型黑色素瘤，在谷氨酰胺摄取和细胞增殖中起关键作用[19]. 因此，破坏谷氨酰胺代谢可以作为治疗肿瘤的一种方法，这是非常合理的。
癌症细胞对谷氨酰胺上瘾的发现导致了旨在损害谷氨酰胺代谢的治疗方法。谷氨酰胺酶抑制剂的最新研究，谷氨酰胺酶是一种催化我-谷氨酰胺我-谷氨酸和氨对癌症的治疗潜力巨大。例如，6-重氮-5-氧代-1-去甲亮氨酸（L-DON）将谷氨酰胺酶靶向其活性部位以抑制肿瘤生长[20–22]. 另一种谷氨酰胺酶抑制剂，双-2-[5-（苯乙酰胺基）-1,3,4-噻二唑-2-基]乙基硫醚（BPTES）及其类似物显著抑制多种肿瘤类型（包括淋巴瘤、乳腺癌和胶质瘤）体内肿瘤异种移植物的生长和体外癌细胞的增殖[23–27].
在这项研究中，我们证明黑色素瘤抵抗细胞比其对vemurafenib敏感的细胞吸收谷氨酰胺的速度更快，对谷氨酰胺饥饿更敏感。此外，我们还表明，谷氨酰胺酶抑制剂BPTES和L-DON可用于体外有效治疗耐药细胞，并可用于体内治疗肿瘤。我们建议靶向谷氨酰胺代谢可作为一种替代治疗策略，以靶向对vemurafenib耐药的肿瘤。
方法
细胞培养
如前所述，产生了人类黑色素瘤亲本（vemurafenib敏感）株[4]. 简单地说，直接从患者活检中建立细胞，并在RPMI 1640培养基中培养我-谷氨酰胺、10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素和两性霉素[4]. M229父母之前被描述为BRAFV600E型纯合子和M249亲本被描述为V600E型BRAF杂合子，对vemurafenib介导的体外和体内生长抑制同样敏感[4]. 将细胞维持在含有10%胎牛血清（Omega Scientific，Inc）和4mM的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中我-谷氨酰胺（Omega Scientific，Inc）。
Vemurafenib（PLX 4032）单药耐药（SDR）子线M249和M229V600E型BRAF公司慢性接触vemurafenib在体外产生阳性突变[12]. 简言之，M229亲本系每3天用1 mM的PLX4032处理4-6周，以获得克隆克隆[12]. PDGFRβRNA上调被发现有助于M229耐药性[12]. 通过连续滴定PLX4032至10mM，获得M249抗性子系[12]. M249抗性子线显示为美国国家科学院（Q61K）激活突变在亲代M249细胞系中不存在，该突变被证明有助于抵抗[12]. M249和M229耐药细胞用10%胎牛血清（Omega Scientific，Inc）保存在DMEM中，4 Mm我-谷氨酰胺（Omega Scientific，Inc）和1μM vemurafenib（PLX4032）（Plexxikon）。
如前所述，产生了双BRAF抑制剂（vemurafenib）和MEK抑制剂（selumetinib）耐药细胞系[28]. 简言之，M249 DDR5双耐药细胞系（DDR）是通过用vemurafenib和selumetinib增量处理M249亲本细胞系而产生的，并且含有这两种突变V600E型BRAF公司放大和129层MEK1型突变[28]. M249双耐药细胞在上述含有1μM vemurafenib（Plexxikon）和1μM selumetinib（Selleck化学品）的培养基中培养。
营养素摄入
父母和单个耐药细胞以2×10接种5和1×105细胞/孔，分别置于6孔板中，一式三份，并允许培养过夜。只将培养基作为亲代细胞和耐药细胞的对照。在细胞达到60%汇合后的24和48小时，收集细胞培养基并转移到微离心管中，然后放置在Nova Bioprofiler 100plus分析仪（Nova生物医学）中，以测量营养吸收。此外，使用Biorad TC20自动细胞计数器对细胞进行计数。测量后，从读数中减去纯培养基对照值，并计算值/细胞。
DIMSCAN细胞体外细胞毒性试验
将M249和M229亲本、单药耐药（SDR）细胞和M249 DDR5双药耐药细胞（DDR）分别接种在3000个细胞/孔和2000个细胞/井的96孔板中。在治疗前让细胞沉淀过夜。过夜培养后，用1×PBS清洗细胞，以去除培养基的痕迹。亲代细胞用有或无培养基处理我-谷氨酰胺或d日-葡萄糖，10μM BPTES[双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚]（LT Pharma，Inc.）或10μM L-DON（6-Diazo-5-oxo-我-去甲亮氨酸）（Sigma-Aldrich）单独使用。单一耐药细胞与1μM vemurafenib联合治疗。将双耐药细胞与1μM vemurafenib和1μM selumetinib联合治疗。将BPTES储备溶液溶解在二甲基亚砜中，达到10 mM的最终工作浓度，并在−20°C下储存。将L-DON溶解在水中，最终浓度为100 mM，并储存在−20°C下。每口井都添加了二甲基亚砜和纯水控制。细胞也用不含谷氨酰胺或含葡萄糖的透析胎牛血清的培养基处理（Gemini Scientific）。将处理过的细胞培养24、48和72小时。为了准备DIMSCAN分析，将0.5%曙红Y添加到96孔板上孔之间的空间。将10 mg/ml的二醋酸荧光素（FDA）溶液添加到0.5%曙红Y溶液中，使工作浓度为40μg/ml，以添加到细胞中。孵育20分钟后，使用基于荧光的数字图像显微镜系统DIMSCAN扫描细胞的荧光[29]. DTT（洛杉矶儿童医院）使用DIMSCAN数据分析仪对结果进行分析，以获得存活率。
蛋白质斑点
将M249和M229亲本和单个耐药细胞接种在6 cm的培养皿中过夜，第二天获得60%的融合。用1×PBS洗涤细胞。向细胞中添加含有或不含谷氨酰胺的培养基。24小时后，用RIPA缓冲液对细胞进行裂解，蛋白酶抑制剂和裂解产物在SDS凝胶上运行。将凝胶转移到硝化纤维素膜上，并用抗切割PARP（细胞信号技术）检测以评估细胞凋亡。
AnnexinV/DAPI染色
M249和M229电池以5×10的速度电镀4（父母）和4×10412孔板中的细胞（抗性）。在4×10的条件下对双抗药性线进行电镀412孔板中的细胞。在过夜培养并达到60%融合后，使用电子生物科学试剂和Annexin V染色方案，用荧光染色结合的AnnexinV和碘化丙啶对细胞进行染色。细胞采集是使用来自Beckman Coulter（美国佛罗里达州迈阿密）的9色CyAn ADP完成的。本出版物中报告的研究包括在国家卫生研究院国家癌症研究所支持的分析细胞测定核心中进行的工作，编号为P30CA33572。使用FlowJo数据分析软件（美国俄勒冈州阿什兰）对细胞进行分析。
shRNA敲除
shRNA慢病毒颗粒（Sigma）被用于感染M249单药耐药细胞，感染率为50%，使用聚溴化六甲菊酯（Sigma-）。48小时后选择细胞进行嘌呤霉素耐药性（Sigma）检测。大量细胞群用于实验。使用定量PCR和相对mRNA表达测定评估敲除效率美国国家科学院.
体内异种移植模型
所有动物研究都是根据希望城癌症中心批准的IACUC方案进行的。Nod Scid Gamma（NSG）小鼠注射5×105右侧皮下接种M249亲本或单个耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时三肿瘤细胞体积，小鼠每隔一天腹腔注射15 mg/kg BPTES或载体对照（DMSO）。测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积（mm三)通过乘以（长度×宽度×宽度）/2来计算。给NCr裸鼠（Taconic）注射2×106右侧皮下接种M249单药耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时三，用20 mg/kg的L-DON或溶媒对照（水）每周治疗一次。
统计分析
所有体外实验均一式三份，重复至少三次。图中显示了具有代表性的实验。使用Graphpad软件（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行配对t检验，以计算代表性实验的p值。低于p<0.05的数值被认为是显著的。
结果
韦姆拉非尼耐药细胞对谷氨酰胺的吸收和使用率高于韦姆拉非尼敏感细胞
我们首先旨在评估同基因BRAFi敏感亲本之间的营养吸收是否存在差异V600型BRAF公司突变黑色素瘤细胞系和单药耐药（通过vemurafenib慢性治疗获得）亚系。我们发现M249和M229单药耐药（SDR）细胞对谷氨酰胺的摄取量均高于其亲代细胞（图a） ●●●●。众所周知，谷氨酰胺酶的活性会产生游离氨，因此，我们还测试了NH4+生产[15]. 我们发现M249和M229单药耐药细胞的氨生成量均高于亲代细胞，这表明谷氨酰胺的使用量较高（图a） ●●●●。为了排除耐药细胞代谢普遍增加的可能性，我们还测量了M249和M229亲本和单药耐药细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成（图b） ●●●●。与谷氨酰胺摄取相比，亲代和单个耐药细胞之间的葡萄糖摄取和乳酸生成没有显著差异（图b） ●●●●。这些数据表明，与vemurafenib-sensitive（亲代）细胞群相比，单个耐药细胞的生长和增殖可能更依赖谷氨酰胺。
维穆拉非尼耐药细胞对谷氨酰胺的吸收和使用率高于维穆拉芬尼敏感细胞。将黑色素瘤M249和M229 vemurafenib敏感（亲本）和单药耐药（SDR）细胞系镀成60%的融合细胞，隔夜培养后改变培养基。仅将Medium用作控件。然后培养细胞24小时。然后从生长细胞中取出培养基，测量谷氨酰胺摄取量、NH4
+如材料和方法所述，使用Nova Bioprofiler 100plus进行生产、葡萄糖摄取和乳酸生产。对细胞进行计数，结果表示为一每细胞谷氨酰胺摄取量（mmol/L）和NH4
+每细胞产量（mmol/L）和b条每个细胞的葡萄糖摄取量（mmol/L）和每个细胞的乳酸生成量（mmol/L）代表了三次实验的平均值（±标准偏差）。
Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺缺乏更敏感
为了验证这一点，我们旨在剥夺M249和M229单药耐药细胞的谷氨酰胺和葡萄糖，以观察其对细胞存活的影响。我们发现M249和M229单药耐药（SDR）人群对谷氨酰胺缺乏比葡萄糖缺乏更敏感（图a、 b）。此外，亲代和单个耐药细胞均被剥夺谷氨酰胺，并通过Western blot分析测量PARP裂解来检测细胞凋亡。与亲代细胞相比，M249和M229单药耐药细胞在谷氨酰胺缺乏时PARP裂解水平较高，表明凋亡水平增加（图c、 d）。与蛋白质印迹结果相关，通过膜联蛋白V染色测量，M249单一耐药系中谷氨酰胺剥夺后的凋亡细胞比亲代系更多（图e） ●●●●。为了进一步评估更广泛的耐药机制，还使用了具有获得性vemurafenib和MEK抑制剂双重耐药（DDR）的黑色素瘤等基因亚系。我们测试了含有这两种药物的双耐药（DDR）M249细胞系BRAF公司放大和MEK1型谷氨酰胺敏感性突变。与单一耐药株类似，M249双耐药株对谷氨酰胺缺乏比葡萄糖缺乏更敏感（图f） 。此外，我们通过Annexin V染色检测谷氨酰胺剥夺后的细胞凋亡，发现M249双耐药细胞对谷氨酰胺剥夺也比亲代细胞更敏感（图g） ●●●●。这些结果高度表明，耐药细胞更依赖谷氨酰胺生存，用旨在阻断谷氨酰胺使用的抑制剂靶向谷氨酰胺代谢可能是特异性杀死vemurafenib耐药细胞的一种方法。
Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺缺乏更敏感。一黑色素瘤M249和b条M229单药耐药（SDR）细胞在含有或不含谷氨酰胺（Gln）或葡萄糖（Gluc）的培养基中培养。24小时后，使用微机荧光细胞毒性试验DIMSCAN（n=6，**p<0.01）显示代表性图像和与完全培养基中对照细胞相比的存活分数（存活率%）。Western blot分析也用于评估PARP裂解水平，作为两者凋亡的指标c（c）M249和d日M229亲本和SDR细胞系。e（电子）用AnnexinV和DAPI染色的M249亲代和耐药细胞流式细胞术检测细胞凋亡。M249亲本和SDR细胞在含有和不含谷氨酰胺的培养基中培养24小时。代表于斑点印迹以及AnnexinV阳性细胞的百分比。（f）黑色素瘤双药耐药（DDR）细胞株M249 DDR5在含有和不含谷氨酰胺（Gln）或葡萄糖（Gluc）的培养基中培养。24小时后，使用DIMSCAN（一种基于微机荧光的细胞毒性试验，n=6，***p<0.001）显示与完全培养基中的对照细胞相比的代表性图像和存活率（存活率%）。克用AnnexinV和DAPI染色的M249亲代细胞和DDR细胞流式细胞术检测细胞凋亡。M249亲本和DDR细胞在含有和不含谷氨酰胺的培养基中培养24小时。代表于斑点印迹以及AnnexinV阳性细胞的百分比。
Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂更敏感
为了测试我们是否可以以谷氨酰胺代谢为靶点治疗耐药细胞，我们使用谷氨酰胺酶抑制剂、BPTES和L-DON治疗父母和耐药细胞群。然后，我们评估了治疗后的细胞存活率，并观察了耐药细胞群是否对谷氨酰胺摄取更敏感。我们发现，尽管父母和单一耐药人群都对谷氨酰胺酶抑制剂BPTES和L-DON敏感，但单一耐药细胞与vemurafenib联合使用更为敏感，如细胞存活率降低所示（图a、 b）。为了进一步研究双耐药细胞系是否对谷氨酰胺酶抑制剂敏感，我们测试了M249双耐药细胞株在使用BPTES治疗后的存活率。我们发现双耐药株（类似于单耐药株）对BPTES的敏感性高于双亲（图c） ●●●●。为了解决这种效应是否需要BRAF抑制或BRAF/MEK1抑制，我们在有或无BRAF/MEK抑制剂的情况下，分别用BPTES和无谷氨酰胺处理M249单药和双药耐药细胞系。我们发现，单或双耐药细胞株的治疗不需要抑制剂的存在就能对谷氨酰胺缺乏或BPTES治疗变得敏感（图d） ●●●●。这些结果表明，谷氨酰胺酶抑制剂可能被用作靶向耐药细胞群的策略。
Vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂更敏感。一M249和M229亲本单药耐药（SDR）细胞在培养基对照（DMSO）或10μM BPTES存在下培养48小时。将SDR细胞系与vemurafenib（1μM）和BPTES联合培养。使用DIMSCAN技术评估与载体对照（DMSO）相比的存活细胞百分比（存活率%）（n=6，***p<0.001，*p<0.05）。b条M249和M229亲本和单个耐药细胞在载体对照（水）或10μM L-DON存在下培养48小时。SDR细胞系接受vemurafenib（1μM）和L-DON的联合治疗。使用DIMSCAN技术评估与载体对照（DMSO）相比的存活细胞分数百分比（存活%）（n=6，***p<0.001，*p<0.05）。c（c）M249亲本和双耐药（DDR）细胞在培养基对照（DMSO）或10μM BPTES存在下培养48小时。DDR细胞系与vemurafenib（1μM）、selumetinib（1μM）和BPTES联合培养。使用DIMSCAN技术评估与载体对照（DMSO）相比的存活细胞百分比（存活率%）（n=6，***p<0.001）。d日M249单（SDR）和双（DDR）耐药株在有或无抑制剂（1μM vemurafenib用于SDR，1μM Vemurafeni和1μM selumentib用于DDR）的情况下培养，然后用10μM BPTES或剥夺谷氨酰胺（Gln）处理48小时。使用DIMSCAN技术评估存活细胞分数与载体对照（DMSO）的百分比（存活率%）。
拆除美国国家科学院vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性降低
确定是否获得阻力美国国家科学院突变在M249耐药细胞向谷氨酰胺依赖性转化中起作用，这些细胞具有稳定的美国国家科学院使用短发夹RNA（shRNA）制备了打乱的shRNA对照物。首先，我们评估了shRNA是否能成功降低美国国家科学院在牢房里。事实上美国国家科学院shNRAS敲除细胞中的表达量大大低于对照水平（图a） ●●●●。随后用BPTES处理对照组和shNRAS敲除细胞，并在培养基中不存在BRAF抑制剂vemurafenib的情况下评估细胞存活率。我们发现它被撞倒了美国国家科学院与对照细胞系相比，使细胞对谷氨酰胺酶抑制剂BPTES的敏感性降低（图b） ●●●●。这些结果表明，耐药性在美国国家科学院有助于谷氨酰胺依赖性耐药细胞的重新编程。
的击倒国家可再生能源管理局vemurafenib耐药细胞对谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性降低。用shNRAS或shControl慢病毒颗粒感染黑色素瘤M249耐药细胞，48小时后筛选出对嘌呤霉素耐药的细胞。一定量PCR检测shControl和shNRAS感染细胞中NRAS的相对mRNA表达。b条shNRAS或shControl细胞在10μM BPTES存在下培养48小时或与载体对照（DMSO）一起培养。与载体对照（DMSO）相比，使用DIMSCAN分析测定存活细胞百分率（存活率%）（n=6，*p<0.05）。
Vemurafenib耐药黑色素瘤对体内谷氨酰胺酶抑制剂治疗敏感
由于体外数据证明了谷氨酰胺酶抑制剂治疗耐药细胞系的潜力，我们询问这些抑制剂在体内是否也有效。为此，对NSG小鼠进行异种移植实验，给小鼠注射M249亲本（vemurafenib敏感）和M249单药耐药细胞系，然后用谷氨酰胺酶抑制剂BPTES治疗。如图所示a、 与注射亲本（敏感）细胞的小鼠相比，注射M249单药耐药细胞的小鼠BPTES显著抑制肿瘤生长。由于BPTES治疗对母细胞肿瘤生长的影响最小，我们接下来重点验证靶向谷氨酰胺代谢是否能有效抑制耐药肿瘤生长，使用不同的谷氨酰胺酶抑制剂L-DON。同样，我们发现L-DON有效地阻止了对vemurafenib耐药的肿瘤生长（图b） ●●●●。
对Vemurafenib耐药的黑色素瘤对体内谷氨酰胺酶抑制剂治疗敏感。一Nod Scid Gamma（NSG）小鼠注射5×106右侧皮下接种M249亲本或单个耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时三肿瘤细胞体积，每隔一天通过腹腔注射给予15 mg/kg BPTES或载体对照（DMSO）治疗。测量肿瘤的长度和宽度。肿瘤体积（mm三)计算方法为（长×宽×宽）/2。图表表示平均肿瘤体积±SD。b条裸鼠注射2×106右侧皮下接种M249耐药细胞。当肿瘤大小达到平均100 mm时三肿瘤细胞体积，每周两次通过腹腔注射给予20 mg/kg L-DON或溶媒对照（水）治疗。图表表示平均肿瘤体积±SD。
讨论
在此，我们证明，与对vemurafenib敏感的细胞相比，M249和M229抗vemuraffenib细胞已被重新编程，变得越来越依赖谷氨酰胺。此外，我们还发现，获得抗性增加了这些细胞对谷氨酰胺缺乏的敏感性。我们还证明，除了单药耐药株外，双药耐药株同时含有BRAF公司放大和MEK1型突变对谷氨酰胺缺乏变得敏感。我们成功地利用了这种对谷氨酰胺的敏感性，用谷氨酰胺酶抑制剂BPTES或L-DON和vemurafenib的组合杀死了这些单药和双药耐药细胞。在单药耐药和双药耐药病例中，观察到细胞存活率降低。此外，击倒国家可再生能源管理局在M249抗性细胞中，降低了这些细胞对两种谷氨酰胺酶抑制剂的敏感性，这表明抗性获得性突变可能会影响这种对谷氨酰胺依赖性的增加。这些结果也在体内获得，因为用BPTES或L-DON注射M249单药耐药细胞治疗小鼠，导致肿瘤体积显著减少。
单药治疗BRAF抑制剂，如vemurafenib和dabrafenib，已证明改善了V600E型BRAF公司突变型黑色素瘤，目前已被美国食品和药物管理局批准用于治疗[13]. 此外，BRAF抑制剂与变构MEK1和MEK2抑制剂的联合治疗也在临床试验中，已批准用于治疗BRAF公司突变性黑色素瘤[7,13,28,30,31]. 然而，与单剂疗法一样，BRAF和MEK抑制剂的联合疗法也通过进一步扩增现有的耐药性突变或通过重新激活MAPK途径，导致耐药性机制的发展[9,13,28]. 这些耐药机制导致了对替代治疗方案的需求[13]. 最近，使用针对程序性死亡1通路（PD-1）及其配体之一的拮抗抗体、程序性死亡配体1（PD-L1）和CTLA-4/B7（细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4）的阻断，阻断限制T细胞反应的免疫调节检查点与抗CTLA-4拮抗单克隆抗体（mAbs）的相互作用已证明在黑色素瘤患者中具有很高的临床益处[32,33]. 除了以免疫反应为靶点外，是否以代谢改变为靶点来治疗耐药黑色素瘤细胞尚不清楚。我们的研究表明，抑制谷氨酰胺代谢可能是治疗单耐药和双耐药肿瘤类型的一种有希望的方法。
我们的数据表明，不同的耐药模型都可能导致“谷氨酰胺成瘾”，因此，确定这些细胞如何能够重新编程为谷氨酰胺依赖的优先代谢至关重要。未来，研究谷氨酰胺转运蛋白或参与谷氨酰胺代谢途径的代谢酶，以评估突变如何直接影响这些细胞的固有代谢，这一点非常重要。这将有助于开发更具靶向性的治疗方法，用于靶向谷氨酰胺依赖性肿瘤。
总的来说，这些数据表明，vemurafenib单药耐药株和vemuraffenib/selumetinib（MEK抑制剂）双药耐药株对谷氨酰胺和谷氨酰胺酶抑制剂都敏感。因此，靶向谷氨酰胺代谢可能是未来治疗vemurafenib耐药黑色素瘤的有用工具。
结论
目前，用于治疗对vemurafenib耐药的黑色素瘤的治疗包括结合BRAF和MEK抑制剂以靶向抑制MAPK通路。由于黑色素瘤的侵袭性及其即使在联合使用BRAF和MEK抑制剂治疗后也能产生耐药突变的独特能力，因此有必要开发替代疗法来规避耐药。我们的研究表明，靶向谷氨酰胺代谢可能是一种潜在的治疗vemurafenib耐药黑色素瘤的方法。
作者的贡献
JHD进行了营养吸收、DIMSCAN增殖分析、敲除研究和体内异种移植实验。TT、MR、XL、MP和YY参与了体内异种移植实验。KR和MR参与营养吸收分析。KR辅助AnnexinV染色和shNRAS敲除细胞系的发育。JW参与DIMSCAN分析。RL和GM产生了249和229个亲本和抗性系以及249个DDR5双耐药系。RL、JHD和MK帮助起草了手稿和数据解释。所有作者阅读并批准了最终手稿。
致谢
我们感谢David Huw Davies对手稿的有益评论。我们感谢Andrea Zuniga对实验的协助。研究得到NIH/NCI 1R01CA183989-01A1和V基金会的支持。MK是生物医学领域的皮尤学者。MR由Ralph M.Parson基金会支持。
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1Bucheit AD，Davies MA。黑素瘤对BRAF抑制剂耐药性的新见解。生物化学药理学。2014;87(3):381–389. doi:10.1016/j.bcp.2013.11.013。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 2美国癌症协会FaF（2014）2014年事实与数据
三。Davies H、Bignell GR、Cox C、Stephens P、Edkins S、Clegg S等。人类癌症中BRAF基因的突变。自然。2002;417(6892):949–954. doi:10.1038/nature00766。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 4Sondergaard JN、Nazarian R、Wang Q、Guo D、Hsueh T、Mok S等。BRAFV600E突变的黑色素瘤细胞系对特定Raf抑制剂PLX4032的敏感性差异。《运输医学杂志》。2010;8：39.网址：10.1186/1479-5876-8-39。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 5Shi H，Kong X，Ribas A，Lo RS。克服PDGFRβ驱动的黑色素瘤细胞对V600EB-RAF抑制的耐药性的组合治疗。癌症研究。2011;71(15):5067–5074. doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-0140。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 6McArthur GA、Chapman PB、Robert C、Larkin J、Haanen JB、Dummer R等。vemurafenib治疗BRAF（V600E）和BRAF的安全性和疗效（V600K）突变阳性黑色素瘤（BRIM-3）：3期随机开放性研究的延长随访。柳叶刀Oncol。2014;15(3):323–332. doi:10.1016/S1470-2045（14）70012-9。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 7Hauschild A、Grob JJ、Demidov LV、Jouer T、Gutzmer R、Millward M等。达布雷尼治疗BRAF突变的转移性黑色素瘤：一项多中心、开放标签、3期随机对照试验。柳叶刀。2012;380(9839):358–365. doi:10.1016/S0140-6736（12）60868-X。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 8Ribas A、Gonzalez R、Pavlick A、Hamid O、Gajewski TF、Daud A等。vemurafenib和cobimetinib联合治疗晚期BRAF（V600）突变黑色素瘤患者：1b期研究。柳叶刀Oncol。2014;15(9):954–965. doi:10.1016/S1470-2045（14）70301-8。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 9Queirolo P、Picasso V、Spagnolo F。联合抑制BRAF和MEK治疗BRAF突变的转移性黑色素瘤。癌症治疗Rev。2015[公共医学][谷歌学者] 10Robert C、Karaszewska B、Schachter J、Rutkowski P、Mackiewicz A、Stroiakovski D等。联合使用达布雷尼和曲美替尼提高黑色素瘤患者的总体生存率。N英格兰医学杂志。2015;372(1):30–39. doi:10.1056/NEJMoa1412690。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 11Flaherty KT、Infante JR、Daud A、Gonzalez R、Kefford RF、Sosman J等。BRAF V600突变黑色素瘤中BRAF和MEK联合抑制。N英格兰医学杂志。2012;367(18):1694–1703. doi:10.1056/NEJMoa1210093。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 12Nazarian R，Shi H，Wang Q，Kong X，Koya RC，Lee H，等。黑色素瘤通过RTK或N-RAS上调获得对B-RAF（V600E）抑制的抵抗。自然。2010;468(7326):973–977. doi:10.1038/nature09626。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 13Spagolo F、Ghiorzo P、Orgiano L、Pastorino L、Picasso V、Tornari E等。BRAF突变型黑色素瘤：治疗方法、耐药机制和诊断策略。Onco靶向治疗。2015;8:157–168. doi:10.2147/OTT。S39096。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 14Shi H、Hugo W、Kong X、Hong A、Koya RC、Moriceau G等。BRAF抑制剂治疗期间黑色素瘤的获得性耐药性和克隆进化。癌症发现。2014;4(1):80–93. doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0642。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 15DeBerardinis RJ，Cheng T.Q的下一篇：谷氨酰胺在新陈代谢、细胞生物学和癌症中的多种功能。致癌物。2010;29(3):313–324. doi:10.1038/onc.2009.358。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 16Parmenter TJ、Kleinschmidt M、Kinross KM、Bond ST、Li J、Kaadige MR等。BRAF突变黑色素瘤对BRAF抑制的反应由糖酵解转录调节器网络介导。癌症发现。2014;4(4):423–433. doi:10.1158/2159-8290.CD-13-0440。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 17Wise DR，Thompson CB。谷氨酰胺成瘾：癌症的新治疗靶点。生物化学科学趋势。2010;35(8):427–433. doi:10.1016/j.tibs.2010.05.003。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 18Son J、Lyssiotis CA、Ying H、Wang X、Hua S、Ligorio M等。谷氨酰胺通过KRAS调节的代谢途径支持胰腺癌生长。自然。2013;496(7443):101–105. doi:10.1038/nature12040。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 19Wang Q、Beaumont KA、Otte NJ、Font J、Bailey CG、van Geldermalsen M等。靶向谷氨酰胺转运抑制黑色素瘤细胞生长。国际癌症杂志。2014;135(5):1060–1071. doi:10.1002/ijc.28749。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 20Kisner DL、Catane R、Muggia FM。DON（6-重氮-5-氧代）的重新发现-我-去甲亮氨酸）癌症研究的最新结果。1980;74:258–263. doi:10.1007/978-3-642-81488-4-30。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 21Sklaroff RB、Casper ES、Magill GB、Young CW。6-重氮-5-氧代的第一阶段研究-我-去甲亮氨酸（DON）癌症治疗代表。1980;64(12):1247–1251.[公共医学][谷歌学者] 22Thangavelu K，Chong QY，Low BC，Sivaraman J.人类肾脏型谷氨酰胺酶（KGA）活性部位抑制机制的结构基础科学代表。2014;4：3827.doi:10.1038/srep03827。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 23Shukla K、Ferraris DV、Thomas AG、Stathis M、Duvall B、Delahanty G等。作为谷氨酰胺酶抑制剂的双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚3（BPTES）类似物的设计、合成和药理评价。医学化学杂志。2012;55(23):10551–10563. doi:10.1021/jm301191p。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 24Thangavelu K，Pan CQ，Karlberg T，Balaji G，Uttamchandani M，Suresh V，et al.人类肾脏型谷氨酰胺酶（KGA）变构抑制机制的结构基础及其在癌细胞代谢中由Raf–Mek–Erk信号调节。美国国家科学院程序。2012;109(20):7705–7710. doi:10.1073/pnas.1116573109。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 25Le A、Lane AN、Hamaker M、Bose S、Gouw A、Barbi J等。通过TCA循环促进B细胞增殖和存活的葡萄糖非依赖性谷氨酰胺代谢。细胞代谢。2012;15(1):110–121. doi:10.1016/j.cmet.2011.12.009。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 26Seltzer MJ、Bennett BD、Joshi AD、Gao P、Thomas AG、Ferraris DV等。谷氨酰胺酶抑制优先减缓IDH1突变胶质瘤细胞的生长。癌症研究。2010;70(22):8981–8987. doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-1666。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 27Robinson MM、McBryant SJ、Tsukamoto T、Rojas C、Ferraris DV、Hamilton SK等。双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）抑制大鼠肾脏型谷氨酰胺酶的新机制生物化学杂志。2007;406(3):407–414. doi:10.1042/BJ20070039。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 28Moriceau G，Hugo W，Hong A，Shi H，Kong X，Yu CC，等。获得性耐药的可调性联合机制限制了BRAF/MEK联合靶向治疗的疗效，但会导致黑色素瘤药物成瘾。癌细胞。2015;27(2):240–256. doi:10.1016/j.cell.2014.11.018。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 29Keshelava N，Frgala T，Krejsa J，Kalous O，Reynolds CP。DIMSCAN：一种用于联合化疗临床前测试的基于微机荧光的细胞毒性测定。方法分子医学。2005;110:139–153.[公共医学][谷歌学者] 30Chapman PB、Hauschild A、Robert C、Haanen JB、Ascierto P、Larkin J等。使用vemurafenib提高BRAF V600E突变黑色素瘤患者的生存率。N英格兰医学杂志。2011;364(26):2507–2516. doi:10.1056/NEJMoa1103782。 [PMC免费文章][公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 31Flaherty KT、Robert C、Hersey P、Nathan P、Garbe C、Milhem M等。通过抑制MEK提高BRAF突变黑色素瘤的生存率。N英格兰医学杂志。2012;367(2):107–114. doi:10.1056/NEJMoa1203421。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 32Homet Moreno B，Parisi G，Robert L，Ribas A.黑色素瘤的抗PD-1治疗。塞明·昂科尔。2015;42(3):466–473. doi:10.1053/j.seminoncl.2015.02.008。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 33Queirolo P、Morabito A、Laurent S、Lastraioli S、Piccioli P、Ascierto PA等。CTLA-4多态性与接受CTLA-4阻断治疗的黑色素瘤患者总生存率提高的相关性：一项初步研究。癌症投资。2013;31(5):336–345. doi:10.3109/07357907.2013.793699。[公共医学] [交叉参考][谷歌学者] 
