生物化学杂志。作者手稿；PMC 2015年6月29日提供。
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磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（GTP）胞浆型在小鼠骨骼肌能量代谢中的过度表达*s⃞♦
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帕文·哈基米
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
杨建奇
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
杰玛·卡萨德斯
§俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰神经科学系和克利夫兰诊所基金会44195
杜纳·马西隆
¶俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院营养系44106-4935
法蒂玛·托伦蒂诺·席尔瓦
**俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院儿科系，44106-4935
║俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物医学工程44106-4935
科琳·K·奈
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
马可·卡布雷拉
**俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院儿科系，44106-4935
║俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物医学工程44106-4935
大卫·R·黑根
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
克里斯托弗·乌特
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
雅库布·巴格达
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
大卫·H·约翰逊
║俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物医学工程44106-4935
大卫·L·威尔逊
║俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物医学工程44106-4935
约翰·柯万
‡‡俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所基金会消化/肝病和病理学系，邮编：44195
萨蒂什·C·卡汉
‡‡俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所基金会消化/肝病和病理学系，邮编：44195
理查德·汉森
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
‡俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物化学系44106-4935
¶俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院营养系44106-4935
**俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院儿科系，44106-4935
§神经科学系和克利夫兰诊所基金会，俄亥俄州克利夫兰44195
║俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学院生物医学工程44106-4935
‡‡俄亥俄州克利夫兰市克利夫兰诊所基金会消化/肝病和病理学系，邮编：44195
蛋白激酶-C2参与肝和肾皮质中的糖异生，以及肝脏和白色和棕色脂肪组织中的甘油生成（参见参考文献。1查看）。然而，这种酶也存在于多种哺乳动物组织中(2)包括小肠、结肠、乳腺、肾上腺、肺和肌肉；其在这些组织中的代谢作用尚不清楚。为了研究PEPCK-C的生理功能，在小鼠的特定组织中过度表达或消融了该基因。当PEPCK-C在白色脂肪组织中过度表达时，小鼠脂肪组织中的甘油生成率增加，并变得肥胖(三).相反，消融脂肪组织中PEPCK-C的表达会导致脂肪营养不良小鼠(4). 然而，尚未对检测到该酶的其他哺乳动物组织进行系统研究。
我们在转基因小鼠的骨骼肌中过度表达了PEPCK-C基因，以测试代谢和生理后果。骨骼肌被选为靶器官，因为没有明确的迹象表明该组织中PEPCK-C活性高的代谢结果。骨骼肌不合成和释放葡萄糖，尽管多年来有报道称该组织可以制造糖原从头开始因为在骨骼肌中发现了PEPCK-C和果糖-1-6-双磷酸酶活性(5,6). 我们有实验室正在进行的研究的证据三甘油生成发生在骨骼肌中。该途径是糖异生作用的缩写，它涉及从葡萄糖和甘油以外的前体合成甘油-3-磷酸（用于甘油三酯合成）。然而，以前还没有报道在骨骼肌中发生甘油三酯生成，因此在该组织中过度表达PEPCK-C的代谢影响程度并不明显。
PEPCK-C是一种主要的反补体酶(7). 然而，它也能够合成草酸酯，从而补充柠檬酸循环，因此它具有成为补体酶的潜力。无论哪种情况，都可以预测，增加骨骼肌中PEPCK-C的活性将增加动物体内柠檬酸循环流量；肝脏PEPCK-C的消融大大降低了柠檬酸循环流量(8). 这在骨骼肌等组织中尤为重要，因为在剧烈运动过程中，柠檬酸循环中间产物的水平变化很大，以适应产生支持肌肉收缩的能量所需的总循环流量的大幅增加。柠檬酸循环阴离子的增加主要是由于回补。然而，任何进入柠檬酸循环的四五碳中间产物都必须被去除，因为它在循环中不能完全氧化成二氧化碳。因此，PEPCK-C可能有助于柠檬酸循环阴离子的产生和随后的去除(7). 如果是这样的话，这种酶是肌肉中柠檬酸循环功能的重要组成部分。在本研究之前，PEPCK-C在哺乳动物骨骼肌能量代谢中的关键作用这一概念尚未得到验证。
我们的结果表明，过度表达PEPCK-C基因（约9单位/克肌肉）的转基因小鼠的体力活动水平大大提高，这一水平可以延伸到老年（24个月或更大）。这部分是由于线粒体数量增加和骨骼肌中高浓度的甘油三酯所致。过度表达PEPCK-C基因的小鼠的体脂也很少，尽管它们比对照组多吃了60%。研究了这种效应的生化基础。
实验程序
转基因小鼠的产生与分析
构建了一个包含2 kbα-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的嵌合基因(9)该基因与小鼠PEPCK-C cDNA的1976-bp片段相连，随后是牛生长激素（bGH）mRNA的3′-未翻译区的710-bp片段（参见). α-骨骼肌动蛋白基因启动子是Laurence H.Kedes博士（南加州大学）赠送的礼物。选择该基因启动子是因为它已被证明限制了连接结构基因在骨骼肌中的转录，而棕色脂肪组织中的表达水平较低(10). 这些小鼠是由凯斯西储大学医学院转基因小鼠核心设施按照前面详细描述的程序生产的(11,12). 在产生的34只小鼠中，通过Southern印迹鉴定了6只阳性建立子，分别命名为品系A、B、C、D、E和F。在55°C温度下，在含有50 m的缓冲液中隔夜裂解，从小鼠尾部分离出DNA米KCl，10米米三氯化氢，pH 8.3，2.5 m米氯化镁20.1%明胶、0.45%Nonide P-40、0.45%吐温20和24 mg/ml蛋白酶K。DNA用PstI消化，所得片段用1%琼脂糖凝胶电泳分离，并转移到Gene Screen Plus®（PerkinElmer Life Sciences）。人α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的690-bp片段()根据国家生物技术信息中心（NCBI）BLAST预测判断，该基因与小鼠基因组中的序列没有显著同源性，被用作杂交探针。为了增加骨骼肌中PEPCK-C的活性，将创始品系C和D一起培育，以创建一个新品系，命名为品系CD（参见). CD（C）系纯合小鼠+/+，D+/+)用于大多数实验。
PEPCK-C的生成亩老鼠A类，一个包含2 kb人α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的嵌合基因，与小鼠PEPCK-C的cDNA连接，随后连接到bGH的3′端（有关详细信息，请参阅“实验程序”）。这个阴影条代表用于Southern印迹小鼠基因组DNA的DNA探针。B类，整合到宿主细胞基因组中的转基因的两个拷贝的示意图。基因组DNA的PstI消化产生1.9 kb片段和不同长度的片段，这取决于基因组中其他PstI位点的位置。这个影线棒代表用于Southern印迹小鼠基因组DNA的DNA探针。图中显示的Southern印迹B类是来自建立系A、B、C、D和野生型（WT）小鼠的DNA。创始系C和D（CD）交叉的DNA模式也显示在最后两条车道上；纯合子CD小鼠被称为PEPCK-C公司亩老鼠。C类，CD十字的示意图，用于生成PEPCK-C亩这些研究中使用的小鼠。该面板显示了杂交小鼠不同阶段骨骼肌中PEPCK-C的活性水平。C或D基因型杂合子小鼠的PEPCK-C活性在1.2-3.4单位/g骨骼肌之间（通过Southern blotting无法区分这些小鼠的特定基因型）。PEPCK-C的活性值亩小鼠和野生型动物表示为中所示小鼠数量的平均值±S.E圆括号。D类是CD小鼠和对照动物（WT）骨骼肌中PEPCK-C mRNA的Northern印迹。肝脏中的PEPCK-C mRNA也呈阳性对照。E类是来自肝脏、心脏、肾脏和骨骼肌的PEPCK-C的蛋白质印迹(S.肌肉)PEPCK-C的亩小鼠和对照组（WT）。
动物护理
这些小鼠被饲养在凯斯西储大学动物资源中心，由全职兽医监督。本研究中描述的研究得到了凯斯西储大学医学院动物护理和使用委员会的批准。
RNA分析
使用QuickPrep总RNA试剂盒（Amersham Biosciences）从小鼠组织中提取总RNA(13)，并按照前面的详细描述进行Northern印迹(13). 简而言之，通过琼脂糖凝胶电泳分离20µg总RNA，转移到Gene Screen Plus膜，并与PEPCK-C cDNA的1.0-kb SmaI片段杂交。DNA探针用[α-32P] dATP。
PEPCK-C的测定
各种小鼠组织在0.25中均质米蔗糖，含5米米pH 7.4和1 m条件下的三氯化氢米二硫苏糖醇。通过在30000×克在4°C下放置30分钟，用Ballard和Hanson方法测定PEPCK-C的活性(14). 采用蛋白质印迹法测定肝脏、心脏、肾脏和骨骼肌中PEPCK-C的水平。PEPCK-C抗体由F.J.Ballard博士（澳大利亚阿德莱德）善意提供。
血液和组织中代谢产物的测定
通过腹腔注射阿维汀（0.5 ml 20 mg/ml溶液/25 g体重）将小鼠麻醉。使用Encore®血糖仪（拜耳公司）测定血液中的葡萄糖浓度。使用MICROTAINER®血浆分离管（BD Biosciences）从全血中生成血浆。三酸甘油酯、分级胆红素、β-羟丁酸、白蛋白、总蛋白、血尿素氮、胆固醇、肌酐、肌酸激酶、甘油三酯和游离脂肪酸的浓度由兽医诊断服务（马什菲尔德实验室）测定。
使用改良的Folch方法提取肌肉甘油三酯等. (15). 简单地说，新鲜肌肉样品中没有任何可见的非肌肉材料，并称重两份。每个样品通过IKA-ULTRA-TURRAX T 25碱性组织搅拌器均质，并通过将组织匀浆在2:1氯仿：甲醇溶液中培养48小时，在4°C下提取总脂质。通过添加MgCl进一步定义了这两个相2和离心。提取并丢弃上清液，并将剩余层置于空气中干燥。使用甲醇KOH（0.5）皂化甘油三酯n个)在70°C下保持75分钟，用6n个盐酸。所得脂肪酸用己烷提取三次。使用Labconco CentriVap浓缩器在25°C下干燥含有甘油的水相。甘油的浓度使用荧光分析法测定，基本上如Wieland所述(16); 该值用于计算组织中甘油三酯的浓度。
家庭笼子活动测试
在行为测试开始前6周，将所有小鼠单独关在笼中。在进行家庭笼子活动测量之前，每天三次在笼子里观察老鼠15分钟，以排除可能会干扰家庭笼子运动测量的异常行为，如运动或梳妆刻板印象、震颤、异常筑巢和整体运动功能（异常步态事件）。在光阶段进行了两次观察，在暗阶段进行了一次。在每个15分钟的时间点观察五只小鼠，每只小鼠观察30秒。
在测试开始前24小时，将所有小鼠带入测试室，以适应房间和测试条件，其中包括用干净的顶部替换标准的水/食物固定顶部，并在笼子内放置饲料和液体源（Hydrol®）。在同一试验中对所有小鼠进行了测试。将动物笼子放在充电耦合设备（CCD）相机（松下）正下方的桌子上，使用跟踪系统（Noldus，Ethovision 3.1 Pro，Leesburg，VA）连续观察22小时，从下午3点开始，到下午1点结束。跟踪系统自动计算行驶距离、速度、后仰次数、转角和角速度（进一步排除与刻板印象相关的跑步）。数据以1小时为间隔嵌套，以简化统计分析。试验结束后，将装有标准食物和水的铁丝网放回笼子，然后将小鼠送回其房间。
最大运动能力
在喂食、性别匹配和年龄匹配的PEPCK-C中测定运动表现和运动能力亩小鼠和对照组。小鼠在啮齿动物跑步机上进行剧烈运动（俄亥俄州哥伦布市哥伦布仪器氧气系统），使用标准运动跑步测试评估有氧能力（VO最大值2)最大跑步耐力和最大跑步速度。为了鼓励老鼠跑步，在跑步机的后部安装了一个电击网。电击网格设置为提供0.2毫安的电流，这会导致不舒服的电击，但不会对动物造成身体伤害。当老鼠精疲力竭时，电击停止，这是因为它们无法跑10秒。
跑步机测试的类型
我们在本研究中包括三种类型的剧烈运动测量（跑步机测试）。首先，我们评估了未经训练的PEPCK-C的能力亩控制老鼠跑得更远。动物最初适应跑步机环境30分钟。为了热身和进一步熟悉跑步机跑步，要求小鼠以10米/分钟的相对轻松的速度跑30分钟。然后将跑步机的速度提高到20米/分钟，我们记录了小鼠运动的持续时间和跑到筋疲力尽的距离。精疲力竭在操作上被定义为尽管受到轻微的电刺激刺激，但小鼠无法或拒绝保持其跑步速度的时间。
其次，我们确定了VO最大值2这两种类型的小鼠。在跑步之前，小鼠在封闭的跑步机及其周围环境中适应60分钟。在此期间，测量全身耗氧量VO2、二氧化碳生产VCO2在动物安静休息时，测定呼吸交换比（RER）。然后，小鼠开始以5 m/min的速度在跑步机上行走，并以0°的坡度进行10分钟的热身。然后将跑步机的坡度设置为25°，每2分钟增加2米/分钟的速度，直到小鼠筋疲力尽。两个VO2和VCO2在整个运动测试期间持续监测。根据RER数据评估运动期间的底物利用率。在运动前后采集血样以测定乳酸。
第三，PEPCK-C亩不同年龄的对照小鼠在跑步机上适应30min，然后以10m/min的跑步机速度（设置为0°）进行30min的热身。然后，我们将跑步机的速度每分钟增加1米/分钟，并确定小鼠在筋疲力尽之前可以跑的最大速度。
全身脂肪的磁共振成像分析
A馈送PEPCK-C亩使用7T/30-cm Bruker BioSpin小型动物磁共振扫描仪对小鼠和两个对照动物进行成像。采用多层、多回波自旋回波采集技术，利用120mm大鼠容积线圈发射和接收，T1加权和呼吸门控（重复时间/回波时间=900/9ms，512×256矩阵，110×41mm视野，33层），获得整只小鼠的高分辨率冠状图像。为了分离内脏和皮下脂肪组织隔室，使用通用软件包（明尼阿波利斯梅奥诊所Analyze 6.0）手动分割腹壁内的内腔。在这些图像中，脂肪呈超高密度，我们可以通过交互设置阈值来分割脂肪组织。内脏和皮下脂肪组织体积是根据体素数量乘以单个体素的体积来计算的。采集了类似的单层图像以供发布（利用重新聚焦回波快速采集，TR/TE=1000/12 ms，512×512矩阵，100×60 mm视野）。在3周内重复采集图像，以检查测量重复性。
组织的组织学和电镜分析
从隔夜禁食的PEPCK-C中分离出骨骼肌亩和对照小鼠，并立即固定在福尔马林溶液（Sigma）中的液体N中2，或在Tissue Tek®OTC化合物（Sakura Finetek Inc）中，分别用于苏木精和伊红染色、琥珀酸脱氢酶和NADH脱氢酶染色或电子显微镜染色。细胞实验室和电子显微镜设备在凯斯西储大学医学院进行组织化学和电子显微镜分析。
老化对PEPCK-C容量的影响亩要运行的鼠标
PEPCK-C公司亩小鼠和对照组被关在单笼中，直到它们达到24-27个月大，然后测试它们的最大跑步速度。
结果
PEPCK-C的产生亩老鼠
使用标准DNA微注射技术生成了六个转基因小鼠创始系。导入小鼠的嵌合基因包含α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的2-kb片段(9)，与小鼠PEPCK-C的1976-bp cDNA相连，随后与bGH基因的3′端相连(). 嵌合基因DNA并入四个创始系基因组的模式如所示这些创始小鼠中的每一只都以不同的水平表达嵌合基因，这取决于PEPCK-C酶活性和特异性mRNA的水平(). 为了增强PEPCK-C活性对肌肉代谢的影响，我们通过共同培育创始品系C和D创建了一个新的小鼠品系(). 这种繁殖产生的小鼠肌肉中PEPCK-C活性水平不同(); 随后，这些动物被用于确定过度按压PEPCK-C对骨骼肌代谢的影响。在创始品系C和D经过九代杂交后，我们创建了一个纯合小鼠系，我们称之为PEPCK-C亩老鼠。
PEPCK-C在肌肉中的表达
通过从PEPCK-C分离的几个组织的Northern和Western印迹来评估转基因的表达亩鼠标和控件(). 在PEPCK-C的骨骼肌中检测到反式基因转录的PEPCK-CmRNA亩老鼠；在对照动物的肌肉中未发现来自转基因的PEPCK-C mRNA。使用PEPCK-C特异性抗体，通过Western blotting观察到相同的模式。在小鼠骨骼肌中观察到的PEPCK-CmRNA水平在我们的PEPCC-C品系中不同亩小鼠在共同繁殖创始品系C和D的过程中(). 这反映在这些小鼠肌肉中PEPCK-C活性的变化中(). 纯合PEPCK-C亩小鼠腓肠肌、比目鱼肌和膈肌中的PEPCK-C活性为～9单位/g；相反，来自对照小鼠的相同肌肉具有约0.08单位/克的PEPCK-C活性(). 由于PEPCK-C的基因是从α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子表达的，所以所测定的所有骨骼肌类型都具有相同的活性。此外，PEPCK-C的心脏肌肉小鼠酶活性为0.74单位/g；在小鼠心脏中通常检测不到PEPCK-C的活性。我们经常注意到，PEPCK-C在其肝脏中的活性较高亩小鼠比对照组(). 这种活性增加不是由于转基因的转录，因为由位于转基因3′端的bGH基因的805-bp SmaI-EcoR1片段组成的特定cDNA探针没有与肝脏mRNA杂交（数据未显示）。肝脏PEPCK-C活性升高很可能是由于转基因小鼠体内的内源性PEPCK-C基因被诱导转录，这是由于这些小鼠的高能量利用水平所致。肌肉中PEPCK-C基因过度表达的生理效应的后续研究集中于PEPCK-C的使用亩骨骼肌中酶活性约为9单位/g的小鼠。
表1
| PEPCK-C公司亩 |
|---|
| 单位/g | n个 |
| 骨骼肌 | 9.15 ± 1.03 | (4) |
| 索莱乌斯 | 9.28 ± 1.26 | (4) |
| 腓肠肌 | 8.86 ± 2.04 | (4) |
| 膈膜 | 8.00 ± 1.93 | (4) |
| 心脏 | 0.74 ± 0.33 | (2) |
| 肝脏 | 5.00 ± 0.33 | (11) |
| 骨骼肌（WT） | 0.08 ± 0.02 | (8) |
| 肝脏（WT） | 3.09 ± 0.13 | (6) |
家庭笼子中的活动
在产生PEPCK-C纯合系的过程中亩我们注意到，与对照组相比，来自C和D创始系的小鼠的体力活动显著增加；老鼠在笼子里不停地奔跑。PEPCK-C的系统分析亩于是进行了小鼠实验。我们的初步观察没有发现任何明显的刻板印象样移动、过度梳理或步态异常的迹象，所有这些都是PEPCK-C在家庭笼子活动测量中的潜在混淆因素亩小鼠或对照组。两组的转向角和角速度相似，因此在实验组中排除了旋转（刻板印象式运动的常见例子）。家庭笼子活动测量表明，PEPCK-C亩与对照动物相比，小白鼠在家中的笼子里明显更活跃(). 这表现在旅行距离大大增加，饲养频率增加。同样，PEPCK-C亩与对照组相比，小鼠在笼子里的运动速度明显加快().
PEPCK-C的家庭笼活动肌肉老鼠PEPCK-C的活性亩小鼠和对照组（WT）保持12小时的光/暗循环，按照“实验程序”中的规定进行测定。在22小时内进行的测量包括所覆盖的距离、移动速度、饲养频率和小鼠强烈移动的时间百分比。
移动性参数跟踪像素的位置，这些像素在当前采样帧中被识别为属于被跟踪动物，并将其与前一帧中的像素进行比较。较大的差异（大于用户定义的阈值）被确定为具有较强的流动性，较小的差异（小于阈值）是不动的，而两者之间的值是流动的。这就可以对实验对象的动作或缺乏动作进行精细和量化的分类。在这方面，我们的数据表明，尽管控制和PEPCK-C亩小鼠在移动范围PEPCK-C中的时间百分比相似亩与对照组小鼠相比，小鼠在静止状态下的时间明显减少，在活动能力强的情况下的时间显著增加(). 事实上，PEPCK-C亩小鼠的运动速度比对照组快，这与我们的强运动能力研究结果一致。然而，事实上，这些动物在活动范围内花费了相似的时间，并显示出明显更多的饲养，这排除了活动水平（行驶距离）增加的可能性，这仅仅是由于小鼠的速度不断提高。
跑步机测试
接下来我们测试了PEPCK-C的能力亩老鼠在跑步机上跑远(). 未经训练的PEPCK-C亩小鼠以20米/分钟的速度跑了6公里，而对照组在疲劳前以同样的速度只跑了0.2公里。PEPCK-C亩老鼠在24个月大的时候也能保持非凡的能力进行剧烈运动（参见). 这些老鼠跑步的声音视频包括补充数据.
PEPCK-C公司亩老鼠在跑步机上跑很长距离未经训练的3个月大的PEPCK-C亩对小鼠和对照组（WT）进行了长跑能力测试。将小鼠放在跑步机上（坡度为0°），以20 m/min的速度奔跑直至筋疲力尽，如“实验程序”中第一个方案所述补充数据，请注意，有一段视频记录了PEPCK-C的非凡能力亩老鼠要跑很长的距离。
PEPCK-C的运行能力亩年龄大的老鼠经过培训的PEPCK-C亩按照“实验程序”中详细描述的第三种方案，对不同年龄的小鼠和对照组（WT）在跑步机上跑步的能力进行测试。小鼠以10 m/min的速度适应跑步机（0°坡度）30 min，之后，跑步机的速度每分钟增加1 m/min，直到老鼠筋疲力尽。试验动物的数量如表所示圆括号.
确定RER
耗氧量、二氧化碳生成量（均用于计算RER）以及PEPCK-C血液中乳酸浓度的变化亩接下来，对大强度运动期间的对照组小鼠进行测量，让动物使用“实验程序”中详细描述的第二种运动方案在小鼠跑步机上跑步。在60分钟的适应期后，小鼠开始以5 m/min的速度在跑步机上步行，坡度为0°，进行10分钟的热身。然后将跑步机的坡度设置为25°，每2分钟将速度增加2 m/min，直到小鼠筋疲力尽。PEPCK-C的静息耗氧率亩老鼠(n个=9）为48 ml/kg/min，而对照组为47 ml/kg/min。静息血乳酸浓度为3.7 m米在PEPCK-C中亩小鼠和4.9米米在控件中(). PEPCK-C亩小鼠跑了32分钟，而对照组跑了19分钟最大值2PEPCK-C的亩小鼠为156ml/kg/min，而对照组为112ml/kg/min。PEPCK-C血液中的乳酸浓度亩小鼠身高3.7米米最大强度运动后，对照组小鼠的乳酸水平达到8.1m米.PEPCK-C的RER亩小鼠在休息期间为0.77，在运动期间缓慢增加，到力竭时（跑步31.9分钟）为0.91。相比之下，对照动物(n个=10）开始实验时，RER为0.79，在精疲力竭（剧烈运动19分钟）时迅速增至0.99。
表2
| 变量 | 野生型 | PEPCK-C公司亩 |
|---|
| n个=10 | n个=9 |
| VO（旁白）2静止时（ml.kg−1最小值−1) | 46.9 ± 9.6 | 47.7 ± 10.9 |
| VCO公司2静止时（ml.kg−1最小值−1) | 37.3 ± 9.34 | 40.9 ± 14.1 |
| RER（录像机2/VO（旁白）2)处于静止状态 | 0.79 ± 0.05 | 0.77 ± 0.05 |
| 休息时血乳酸（m米) | 4.90 ± 0.34 | 3.70 ± 0.17 |
| VO（旁白）最大值2（ml.kg）−1最小值−1) | 112.3 ± 20.9 | 156.4 ± 8.06* |
| VCO公司2VO处最大值2（ml.kg）−1最小值−1) | 110.8 ± 21.0 | 142.0 ± 8.48* |
| VO处的RER最大值2 | 0.99 ± 0.08 | 0.91 ± 0.03* |
| 血乳酸（m米)运动后 | 8.12 ± 5.0 | 3.70 ± 1.00* |
| 最大速度（m/min，25°坡度） | 23.4 ± 4.79 | 36.6 ± 7.60* |
| 最大运行时间（min） | 19.2 ± 4.76 | 31.9 ± 7.63* |
是所选PEPCK-C之间差异的图形表示亩小鼠和对照动物展示了PEPCK-C非凡的代谢特性亩老鼠。这只动物跑了43分钟直到筋疲力尽，而它的对照窝友跑了13分钟，它筋疲力竭时的RER为0.82（对照动物的RER是1.07）。尤其引人注目的是血液中乳酸浓度的差异。尽管PEPCK-C亩小鼠和对照组以几乎相等的血乳酸浓度开始运动，在力竭时，对照组动物血液中的乳酸浓度上升到17 m米而PEPCK-C血液中的乳酸亩小鼠保持在运动前记录的相同低水平。我们得出的结论是，PEPCK-C亩小鼠在运动期间严重依赖脂肪酸作为肌肉的能量来源，因此在这段时间内不会产生乳酸，尽管运动很费力。对照组小鼠迅速从脂肪酸代谢转向利用肌肉糖原作为燃料；这导致这些动物血液中的乳酸浓度显著升高。
PEPCK-C燃料利用率的图形图亩在剧烈运动中控制老鼠该图是未经训练的PEPCK-C的RER变化的图形图亩老鼠和对照动物。数据来自于一个较大的PEPCK-C组亩老鼠(n个=9）和控制室友(n个=10）表示为RER是用一台完全封闭在环境室中并配备有测速装置的跑步机进行评估的，该跑步机可测量耗氧量和二氧化碳输出量的变化。小鼠在试验室中适应60分钟，然后将跑步机的速度（设置为25°坡度）设置为10 m/min和30分钟，然后每2分钟增加2 m/min，直到小鼠筋疲力尽（见“实验程序”中描述的第二个方案）。在运动前后采集血样，以测定乳酸。在整个运动期间，持续监测小鼠的耗氧率和二氧化碳生成率。
PEPCK-C的摄入量和身体成分肌肉老鼠
PEPCK-C的体重亩对小鼠和对照组进行了测定，并与动物的平均每日食物摄入量有关(). 三种PEPCK-C亩在体重基础上，受试小鼠的食物摄入量平均比对照组多60%。尽管吃得多，18个月大的PEPCK-C亩磁共振成像检测表明，小鼠体重减轻，体脂肪显著减少(). 脂肪组织体积内脏仓库为0.4±0.2 ml，皮下为1.3±0.8 ml。相比之下，6个月大的对照小鼠的内脏仓库为0.7±0.3，皮下脂肪组织为1.2±0.4。年龄和遗传背景相似的对照小鼠的内脏和皮下脂肪是PEPCK-C的2-3倍亩小鼠（分别为2.7±1.1和2.7±0.9）。标准误差表示在3周内每周对这些小鼠进行成像所获得的可变性。
PEPCK-C的食物摄入量和相对体脂亩鼠标和控件A类、平均每日食物消耗量(右侧面板)计算了五个对照组（WT）和17个PEPCK-C小鼠的体重亩在3周内每天都有老鼠。体重(左边)在3周内，每周对同一只小鼠进行三次测定。这些值表示为平均值的平均值±S.E。B类磁共振成像显示T1加权引起的高密度脂肪组织。动物是18个月大的PEPCK-C亩小鼠（CD18）、一个18个月龄的对照组（WT）和一个6个月龄对照组（WM）。内脏和皮下脂肪组织的体积根据“实验程序”进行计算
肌肉甘油三酯含量与PEPCK-C活性的关系亩老鼠
选择具有不同PEPCK-C活性水平的小鼠进行分析。这些动物是从C和D创始系的单个小鼠中产生的。这些动物肌肉中的PEPCK-C活性在对照组为0.08单位/g，在各种PEPCK-C中分别为1.20、2.52和3.90单位/g肌肉老鼠(). 动物肌肉中的甘油三酯浓度与骨骼肌中测定的PEPCK-C活性密切相关。肌肉中PEPCK-C水平与甘油三酯浓度之间观察到的关系可能是由于组织中甘油三酸酯生成速率的增加，尽管这仍有待实验确定。与生化测量结果一致，来自PEPCK-C的骨骼肌亩苏木精-伊红染色法分析小鼠(H&E染色)与对照组相比，具有高脂浓度(). 似乎PEPCK-C骨骼肌中的高浓度甘油三酯亩老鼠提供了维持其非凡活动水平所需的燃料。
PEPCK-C骨骼肌中甘油三酯浓度与PEPCK-C活性的关系亩小鼠和对照（WT）动物PEPCK-C的活性和骨骼肌中甘油三酯的浓度根据“实验程序”进行测定。活性单位为37°C下每分钟转化为产物的底物1µmol。
PEPCK-C骨骼肌的组织学分析亩鼠标和控件A类苏木精伊红染色(H&E染色)显示PEPCK-C肌肉中脂质内含物的骨骼肌亩老鼠。B类琥珀酸脱氢酶染色。C类NADH脱氢酶染色。所有幻灯片都放大了X200倍。
PEPCK-C血液中的代谢物亩老鼠
在喂食和禁食的PEPCK-C的血液中测定了一些代谢物的浓度以及肌酸激酶的活性亩和对照小鼠(). 最显著的区别是禁食的PEPCK-C血液中的肌酸激酶活性显著增加亩老鼠；这些动物血液中这种酶的活性几乎是对照组的四倍。喂食PEPCK-C的人血液中胆固醇、游离脂肪酸和甘油三酯水平也较低亩老鼠。喂食PEPCK-C后血液中葡萄糖的浓度亩小鼠的体重增加超过了对照组小鼠的体重。
表3
| 联邦调查局人员
| 禁食
|
|---|
| 野生型 | PEPCK-C公司亩 | 第页价值 | 野生型 | PEPCK-C公司亩 | 第页价值 |
|---|
| 胆固醇（mg/dl） | 105.6 ± 12.7 (5) | 65.8 ± 10.2 (9) | 0.03一 | 83.3 ± 8.2 (6) | 60.2 ± 8.7 (6) | 0.08 |
| 游离脂肪酸（mEq/升） | 0.56 ± 0.09 (7) | 0.39 ± 0.06 (10) | 0.10 | 0.62 ± 0.23 (6) | 0.50 ± 0.10 (6) | 0.66 |
| 甘油三酯（mg/dl） | 95.7 ± 17.7 (7) | 58.7 ± 7.5 (10) | 0.05一 | 64.6 ± 22.3 (7) | 48.3 ± 8.0 (6) | 0.53 |
| 酮体（mg/dl） | 1.91 ± 0.23 (7) | 2.82 ± 0.77 (10) | 0.35 | 6.2 ± 1.2 (6) | 6.3 ± 2.0 (6) | 0.96 |
| 葡萄糖（mg/dl） | 150.7 ± 8.1 (3) | 217.7 ± 6.6 (3) | <0.01一 | 119.0 ± 7.3 (5) | 136.4 ± 5.0 (9) | 0.09 |
| 血尿素氮（mg/dl） | 29.3 ±2.9 (7) | 29.1 ± 1.8 (10) | 0.95 | 21.8 ± 4.6 (5) | 27.0 ± 2.8 (5) | 0.36 |
| 肌酐（mg/dl） | 0.11 ± 0.02 (7) | 0.16 ± 0.03 (10) | 0.22 | 0.12 ± 0.02 (5) | 0.13 ± 0.02 (6) | 0.66 |
| 肌酸激酶（单位/升） | 276.2 ± 108.5 (6) | 324.8 ± 69.0 (10) | 0.70 | 121.5 ± 13.1 (6) | 446.0 ± 130.2 (5) | 0.02一 |
| 总胆红素（mg/dl） | 0.27 ± 0.12 (7) | 0.11 ± 0.01 (10) | 0.13 | 0.76 ± 0.38 (5) | 0.10 ± 0.00 (2) | 0.35 |
| 总蛋白质（g/dl） | 4.86 ± 0.20 (7) | 4.60 ± 0.07 (10) | 0.18 | 4.76 ± 0.14 (5) | 4.33 ± 0.44 (3) | 0.25 |
| 白蛋白（g/dl） | 2.73 ± 0.11 (7) | 2.93 ± 0.14 (10) | 0.32 | 3.06 ± 0.18 (5) | 2.53 ± 0.26 (3) | 0.14 |
PEPCK-C的肌肉亩小鼠含有更多的线粒体
剧烈运动期间燃料利用的巨大差异表明肌肉能量代谢发生了深刻变化。PEPCK-C骨骼肌的组织化学分析亩小鼠和对照动物的琥珀酸脱氢酶和NADH脱氢酶活性显著增加(). 这些结果与骨骼肌中大量线粒体相一致。这是由三种PEPCK-C在骨骼肌中增加的线粒体DNA支持的亩小鼠与对照动物的比较(). 电子显微镜图像如所示显示PEPCK-C比目鱼肌线粒体显著增加亩小鼠相对于对照组。
PEPCK-C骨骼肌线粒体含量增加亩老鼠A类，PEPCK-C骨骼肌线粒体DNA的相对浓度亩小鼠和对照组（WT）。这个插入是从三种PEPCK-C中分离出的DNA的Southern印迹亩小鼠和两只对照动物。B类，来自PEPCK-C的比目鱼肌电子显微照片亩小鼠和对照动物（WT）的线粒体数量增加(箭头).
PEPCK-C的老化亩老鼠
我们注意到PEPCK-C肌肉小鼠存活时间更长，看起来比对照组更健康，而且雄性和雌性PEPCK-C亩小鼠在21个月大时具有繁殖活性；一个PEPCK-C亩小鼠在30个月大时出生（数据未显示）。因此，我们测试了PEPCK-C的运行能力亩并使用“实验程序”中详细描述的第三种方案对不同年龄段的小鼠进行对照。给小鼠30分钟的跑步机适应期，然后进行30分钟的热身期，在热身期内以10 m/min的速度跑，不抬高跑步机。跑步机的速度每分钟增加1米/分钟，直到小鼠筋疲力尽(). 在所有年龄段的测试中，PEPCK-C亩小鼠的表现明显好于对照动物。12至18个月大的PEPCK-C亩小鼠的平均最高速度为45 m/min，而6个月龄的对照小鼠的平均最大速度为22 m/min。蛋白激酶-C亩18个月龄至24个月龄的小鼠的速度也高于2-6个月龄对照动物。
讨论
α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子已广泛用于转基因小鼠骨骼肌特异性基因的表达(9,10,17). 基因启动子（从−2000到+239）在所有类型的横纹肌中驱动高水平表达，并在发育过程中以组织特异性方式进行调节(9). 小鼠后肢的α-骨骼肌动蛋白基因启动子的转录大约在胚胎第14天开始，此时它取代α-心脏肌动蛋白作为主要的肌动蛋白。克拉彭等. (10)利用小鼠α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子驱动解偶联蛋白-3（UCP-3）结构基因在转基因小鼠骨骼肌中的表达。他们报告了骨骼肌中UCP-3反式基因的表达，棕色脂肪组织中也发现了少量（5%）的反式基因活性。通过逆转录PCR检测，在小鼠的其他12个组织中没有UCP-3 mRNA。我们还注意到PEPCK-C基因主要在转基因小鼠的骨骼肌中表达。通过Northern印迹法在所测的四个创始株系中的任何一个心脏中均未检测到PEPCK-C mRNA，但在与创始株C和D（PEPCK-C）杂交后产生的小鼠中发现了该mRNA亩老鼠）。我们假设α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子的转录发生在PEPCK-C的心脏中亩PEPCK-C诱导小鼠心肌肥大亩老鼠明显的多动症。PEPCK-C基因的表达对心脏功能的影响尚待确定。然而，PEPCK-C中发现的大多数代谢和行为变化可能是肌肉小鼠是由于PEPCK-C在骨骼肌中过度表达导致的代谢改变，而PEPCK-C在心脏中的存在是对这些小鼠显著增加的体力活动的适应。
值得注意的是，参与代谢途径的单一酶的过度表达会导致小鼠表型的如此深刻的改变。最近有几个转基因小鼠能量代谢显著改变的例子；这涉及PPARδ，一种转录因子(17)或PGC-1α(18)或PGC-1β(19)，转录共同调节器。这些蛋白质基因的过度表达预计会改变肌肉中许多基因的表达。PPARδ基因由α-骨骼肌肌动蛋白基因启动子驱动，转基因在骨骼肌中表达(17). 这些小鼠的1型肌纤维增加，运动能力增强。在转基因小鼠中，从肌肌酸激酶基因启动子转录PGC-1α和PGC-1β的基因，导致1型肌纤维（PGC-1 a）增加(18)II型纤维（PGC-1β）增加(19)在动物的骨骼肌中。过度表达PPARδ的小鼠在精疲力竭前跑了1.5公里(17)与PEPCK-C记录的5-6公里相比亩老鼠().
PEPCK-C过表达引起的最显著的生理差异之一是VO增加了40%最大值2在这些动物中与对照组相比。这种水平的氧化能力与报告的经过训练的小鼠的数据相当，这些小鼠经过10代选择性繁殖，以产生具有出色奔跑能力的小鼠(20). PEPCK-C的氧化能力升高亩小鼠不能归因于运动训练就其本身而言但这很可能是由于这些小鼠的高日常活动水平和基因操作，当两者结合起来时，骨骼肌中的线粒体生物生成显著增加，肌肉中的甘油三酯浓度显著增加。这些细胞变化很可能在运动期间增强肌肉的氧化能力，并提供额外的燃料来支持能量代谢。在这方面，PEPCK-C亩小鼠在最大运动量时血液中不会积累乳酸，在剧烈运动时可以使用脂肪酸作为能量来源。他们的RER为0.91，VO为最大值2排气时为156 ml/kg/min(即.在设置为25°斜坡的跑步机上以递增速度运行37分钟后）。在整个剧烈运动期间，PEPCK-C亩小鼠未产生网乳酸；对照动物的血乳酸浓度为8.12 m米.PEPCK-C肌肉氧化能力的增加亩小鼠最有可能受到葡萄糖/糖原更完全氧化和肌肉中高浓度甘油三酯（高达对照动物的10倍）的支持。
众所周知，耐力训练会增加糖原的储存，并提高骨骼肌对脂肪酸的利用率。然而，喂食PEPCK-C亩小鼠糖原储存量略低（1.3±0.1对1.7±0.3 mg/g组织，第页=0.2），但骨骼肌中的甘油三酯水平高于对照组，并在长时间运动中广泛使用脂肪酸。多姆等. (21)据报道，以28米/分钟的速度奔跑的大鼠血液中既没有乳酸也没有丙酮酸积累，这可能是因为低强度运动可以通过有氧代谢来完成。乳酸和丙酮酸的有氧代谢需要丙酮酸通过丙酮酸脱氢酶复合物脱羧生成乙酰辅酶A，随后在柠檬酸循环中被氧化。他们报告说，以28 m/min的速度跑30分钟的大鼠骨骼肌中的PEPCK-C和丙酮酸脱氢酶复合物增加了2倍；运动停止后5min内，两种酶活性均显著下降。既然没有已知PEPCK-C在任何组织中的变构调节因子，导致其在骨骼肌中活性迅速改变的因素尚不清楚。然而，这种效应非常显著，表明PEPCK-C活性的改变可能是动物对运动反应的一个重要因素。骨骼肌中对烯醇丙酮酸的浓度在运动30分钟后降低50%的观察结果支持了这一点(21).
过度表达PEPCK-C如何改变骨骼肌的能量代谢？
PEPCK-C公司肌肉小鼠的体力活动水平很高，部分原因是骨骼肌中的甘油三酯储量较大，碳水化合物氧化更彻底，运动后乳酸生成减弱，线粒体增多，食物摄入增加。PEPCK-C活性增加亩小鼠是自发的；早在出生后2周就有明显症状。然而，目前尚不清楚单一酶的过度表达如何能如此显著地改变小鼠的能量代谢。之前提出的几种机制可以部分解释能量代谢的深刻变化。
首先，体力活动的增加需要ATP来驱动肌肉收缩。这种ATP是由柠檬酸循环中增加的中间体流量产生的。由于PEPCK-C使用GTP并产生GDP，而琥珀酰辅酶a合成酶需要GDP，因此PEPCK-C和柠檬酸循环活动之间可能存在联系。几年前，哈恩和诺瓦克(22)注意到棕色脂肪组织的PEPCK-C活性是白色脂肪组织的四倍（基于细胞蛋白质含量），并表明“额外”的PEPCC-C活性参与了一个循环，在这个循环中，酶利用琥珀酰辅酶a合成酶在柠檬酸循环中生成的GTP，从草酸盐中形成对烯醇丙酮酸，它被丙酮酸激酶转化为丙酮酸。然后，丙酮酸可以通过丙酮酸脱氢酶复合体脱羧生成乙酰辅酶A，并在柠檬酸循环中用于发电。由于PEPCK-C位于细胞质中，这一方案需要鸟嘌呤核苷酸在线粒体内膜上移动，或通过线粒体中的核苷二磷酸激酶将GTP转化为ATP，然后再将其转运和转化回GTP。这种酶的不同亚型在肌肉中的细胞内位置尚不清楚，尽管研究表明肝核苷二磷酸激酶存在于线粒体基质外。也有证据表明，GTP可能通过苍术苷不敏感载体直接从线粒体基质转运，但通过该载体的转运速度慢于特征明确的ATP/ADP转座子(23). 然而，非分裂组织中对鸟嘌呤核苷酸的需求量很低，因此运输过程可能足以满足骨骼肌等组织中对鸟嘌呤核酸的生理需求。如果哺乳动物骨骼肌中存在这样一个循环，PEPCK-C的过度表达可以大大提高柠檬酸循环流量的速率，并有助于生成所需的ATP，以支持PEPCK-C增加的体力活动亩老鼠。
第二，PEPCK-C可能参与猝倒或再恢复。崩解是指氨基酸的碳骨架进入最终降解循环时积累的柠檬酸循环阴离子的去除(7). 这一过程在肌肉中尤为重要，在肌肉中，运动和蛋白质转换会产生相当大的氨基酸流量，并随后氧化(24,25). 此外，代谢过程，如肝、肾糖异生和甘油酮异生，基本上是崩解性的，因为它们涉及去除柠檬酸循环阴离子以进行生物合成。从这个角度来看，正常骨骼肌具有某些PEPCK-C活性并不奇怪。纽斯霍姆和威廉姆斯(26)大鼠股四头肌和膈肌中PEPCK-C活性分别为0.37和0.26单位/g；饥饿72h后，股四头肌的这种活动被诱导为8倍。
从骨骼肌中的丙酮酸合成丙氨酸是突变过程的另一个例子。斯内尔和达夫(27)证明谷氨酸和缬氨酸刺激大鼠膈肌释放丙氨酸，这种刺激可以通过添加3-巯基吡啶酸（PEPCK-C抑制剂）来阻断(28). 他们提出，PEPCK-C将柠檬酸循环中由谷氨酸和缬氨酸代谢产生的草酸盐转化为对烯醇式丙酮酸盐，随后通过M型丙酮酸激酶转化为丙酮酸，然后通过丙氨酸转氨酶转氨酶转化为丙氨酸。然而，我们无法检测到PEPCK-C血液或肌肉中丙氨酸浓度的增加亩小鼠与对照小鼠的比较（数据未显示）。
剧烈运动期间或之后，当骨骼肌线粒体中柠檬酸循环中间产物的浓度大幅增加时，崩解也可能很重要。在中等强度运动开始时，肌肉中柠檬酸循环（补骨术）中间体的浓度迅速增加10倍，随着剧烈运动而下降(24). 据推测，柠檬酸循环流量的速率，以及通过呼吸链产生ATP的速率，可能受到循环中中间产物浓度的限制(24,25,29,30); 肌肉中PEPCK-C的存在可能为运动期间或运动后柠檬酸循环中间产物的去除提供了一种机制。在这方面，肝脏中PEPCK-C活性的消融大大降低了柠檬酸循环流量(8,31)因此，酶活性的增加可能会产生相反的效果。
当然，PEPCK-C过表达可能导致补体。PEPCK-C是一种可逆酶在体外（它有一个K（K）等式0.37的米30°C），因此可以推测反应从对烯醇丙酮酸生成草酸酯，以补充柠檬酸循环体内这也会产生GDP，从而刺激琥珀酰辅酶A合成酶的活性，提高柠檬酸循环流量。然而，许多组织含有丙酮酸羧化酶的大量活性，丙酮酸是主要的回补酶，可在线粒体中直接生成草酸酯。
PEPCK-C在骨骼肌中的第三个可能作用是甘油生成。骨骼肌合成并沉积大量甘油三酯以支持能量代谢。我们已经证明，甘油三酯是大鼠比目鱼肌和腓肠肌甘油三酸酯中甘油酯的主要来源，而不是糖酵解。三令人惊讶的是，即使给大鼠喂食高碳水化合物的食物，从这些肌肉中的甘油三酯中分离出来的甘油酯-甘油也来源于甘油生长素，而不是来自糖酵解。因此，PEPCK-C是甘油生成的关键步骤，很可能参与骨骼肌中的甘油三酯-脂肪酸循环(32). 我们还假设PEPCK-C骨骼肌中PEPCK-C的过度表达亩小鼠通过提供合成所需的3-磷酸甘油，导致观察到的甘油三酯沉积。我们计划测定这些小鼠骨骼肌中的甘油生成速率，以直接评估这种可能性。
PEPCK-C的线粒体生物发生亩老鼠
我们的研究清楚地表明，成人PEPCK-C的骨骼肌肌肉老鼠的线粒体比同龄的对照动物多。我们尚未确定线粒体生物发生的发育模式，但假设这发生在生命早期，因为我们注意到PEPCK-C亩小鼠在出生后的前2周内非常活跃。众所周知，收缩活动，如耐力运动，会导致骨骼肌线粒体的生成和I型肌纤维的发育(33). 此外，给小鼠喂食高脂肪食物并给予肝素以增加血液中游离脂肪酸的浓度，从而诱导骨骼肌线粒体的生物生成(34). 这部分是由于PPARγ上调所致(35)，PPARα(36)和PGC-1α(37)，其相互作用通过刺激导致线粒体生物发生的基因转录来促进骨骼肌的氧化能力（参见参考文献33的综述）。PPARα、PPARγ和PGC-1α作用于编码转录因子NRF-1、NRF-2a和Tfam的几个基因的上游，这些转录因子本身可诱导线粒体生物发生。吴等. (38)据报道，调控CREB结合蛋白的换能器是CREB的共同激活物，可诱导PGC-1α基因转录，并诱导肌肉细胞线粒体的生物发生。调节CREB结合蛋白的传感器也被证明具有钙和cAMP敏感性介质的功能，协调两种途径对基因转录的影响(39). 这将肌浆网响应收缩活动释放的钙与诱导骨骼肌线粒体生物发生的转录过程的激活联系起来。运动通过钙信号通路通过钙调神经磷酸酶/心肌细胞增强器因子2（MEF2）信号级联激活p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，从而刺激PGC-1α(40). 钙还可能通过基因启动子上的CRE位点，通过激活钙/钙调素依赖性蛋白激酶途径，对PGC-1α基因转录产生正调控作用(41,42). 最后，剧烈运动会消耗骨骼肌中的ATP，并通过腺苷酸激酶增加AMP的浓度；结果是激活了AMP激活的蛋白激酶。最近的一些研究表明，AMP激活的蛋白激酶通过诱导PGC-1α-NRF途径对线粒体的生物发生是必要的(43–45). 综上所述，目前有关线粒体生物生成机制的信息支持能量驱动刺激（可能与脂肪酸可用性增加有关），例如发生在PEPCK-C骨骼肌中的刺激亩以小鼠为起始因子。柠檬酸循环流量增加引起的体力活动增加可能是这些小鼠能量代谢重新模式化的关键点。
PEPCK-C中的血液代谢产物亩老鼠
血液中肌酸激酶活性升高是骨骼肌损伤的一个广泛使用的标志。通常在剧烈运动或极限运动后观察到(46,47). PEPCK-C中静息肌酸激酶水平升高亩小鼠可能表明肌肉损伤是由于高水平活动引起的持续、反复的压力所致。我们中的一个(48)此前有报道称，运动引起的肌肉损伤与循环肌酸激酶和胰岛素抵抗增加有关。PEPCK-C中喂食引起的葡萄糖升高反应亩小鼠支持这样一种可能性，即尽管这些小鼠身材苗条且高度活跃，但它们可能具有胰岛素抵抗能力。目前正在对这些观察结果进行更详细的评估。另外，肌酸激酶升高可能反映了细胞凋亡和加速的肌肉重塑，这是运动诱导骨骼肌适应的正常部分(49).
PEPCK-C的老化亩老鼠
众所周知，热量限制会延长酵母等物种的寿命(50)啮齿动物(51)增加人体骨骼肌线粒体的生物生成(52); 这可能是由于SIRT1上调，激活PGC-1α基因的转录。虽然我们尚未对小鼠进行详细的衰老研究，但我们注意到PEPCK-C亩与对照组动物相比，老鼠在年老时寿命更长，精力更充沛()尽管每天摄入的食物较多。霍洛西(53)据报道，雌性大鼠可以随意使用轮子，提高了存活率。这些大鼠的食物摄入量随着运动量的增加而增加。我们还注意到，30个月大的女性PEPCK-C肌肉老鼠生下正常大小的幼崽。需要用更多的老鼠对这一现象进行更详细的分析，以最终支持这一初步观察。最后，本研究尚未回答的一个主要问题是，PEPCK-C的大脑发生了什么变化亩导致本报告中详细描述的行为的小鼠。
脚注
*这项工作得到了国立卫生研究院DK058620和DK025541（发给R.W.H.）、GM-66309（发给M.E.C.）、AG12834（发给J.P.K.）、EB004070（发给D.L W.）和CA43703（发给凯斯西储大学综合癌症中心）的支持，由Provost Vision Fund拨款支持Case Western Reserve University School of Medicine Behavior Core Laboratory（发给G.C.），由NASA的grant NNJ06HD81G（发给M.E.C.），以及俄亥俄州BRTT的the Biomedical Structure，Functional and Molecular Imaging Enterprise拨款。这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，必须在此标记“广告“根据《美国法典》第18卷第1734节，仅为了表明这一事实。
s⃞本文的在线版本（可在http://www.jbc.org)包含一段视频，视频中有老鼠进行跑步机测试的声音。
♦这篇文章被选为本周论文。
2使用的缩写是：PEPCK-C，磷酸烯醇-丙酮酸羧激酶（GTP）的细胞溶质形式；bGH，牛生长激素；过氧化物酶体增殖物激活受体PPAR；RER，呼吸交换比；野生型；CRE，cAMP反应元件；CREB，cAMP反应元件结合蛋白；对烯醇式丙酮酸盐、磷酸烯醇式丁酮酸盐。
三C.K.Nye、R.W.Hanson和S.C.Kalhan，未发表的结果。
