在整个起搏周期中，钙通过SNc多巴胺能神经元的L型通道进入三，4将其与腹侧被盖区（VTA）中受PD影响较小的相邻多巴胺能神经元进行对比5(). 虽然显著，但这种内流对起搏并不必要，因为用二氢吡啶L型通道拮抗剂伊拉地平治疗可以消除胞浆钙振荡，但使起搏保持不变6().
起搏时通过L型钙通道的钙内流增加SNc多巴胺能神经元线粒体氧化应激（a） 起搏模式下SNc多巴胺能神经元的体细胞全细胞记录（左侧显示为投影图像）。在面板底部，显示了树枝状Fluo-4荧光（红色痕迹）的2PLSM测量。右侧显示了使用伊拉地平后的一组类似测量结果；注意，起搏率没有变化，但树突状钙瞬变消失（绿色痕迹）（n=10个神经元，P<0.05）。（b） VTA多巴胺能神经元的一组类似测量结果；这些神经元持续缺乏树突状钙振荡（n=6个神经元）。（c） TH-mito-roGFP构造示意图。在构建物下方，对表达有丝分裂原GFP的SNc多巴胺能神经元进行单细胞RT-PCR分析，显示酪氨酸羟化酶（TH）和Cav1.3钙通道mRNA的表达，而不是钙结合蛋白（CBD）或GAD67 mRNA；所有5个受检神经元均获得类似结果。（d） 上图是一个低倍放大的TH-mito-roGFP转基因小鼠中脑图像，显示SNc和VTA神经元表达。底部，高倍放大的SNc神经元图像，显示细胞质而非核标记。（e） Mn-SOD免疫染色重叠（红色）显示培养的roGFP SNc神经元中与丝裂原原GFP共定位。（f） VTA神经元的线粒体roGFP测量；在使用二硫苏糖醇（DTT）（绿色痕迹）和赤藓糖醇（红色痕迹）之前（对照，黑色痕迹）和之后。按方法所述绘制相对氧化曲线。（g） SNc多巴胺能神经元（黑色痕迹）的Mito-roGFP测量显示，基底氧化程度较高；用伊拉地平治疗可减少线粒体氧化（绿色痕迹）。（h） 左框图总结了对照组（n=9）和伊拉地平治疗组（n=5）VTA多巴胺能神经元的平均氧化还原测量值；对照组（n=14）、伊拉地平（n=9）和Ru360（n=8）处理SNc多巴胺能神经元；SNc神经元的氧化程度显著高于VTA神经元（P<0.05）；伊拉地平和Ru360均显著降低氧化作用（P<0.05）。来自年轻有丝分裂roGFP小鼠（P10-P12）的SNc多巴胺能神经元的氧化程度始终低于成年神经元（P<0.05，n=8）。（i） 方框图总结了在接近生理温度（34-35°C）（n=14）和室温（20-22°C）下（n=5）的脑切片中SNc多巴胺能神经元的平均有丝分裂原GFP测量值；在室温下，氧化作用显著降低（P<0.05）。所有图中的统计显著性用星号表示，并使用非参数检验来比较多个组（Kruskal-Wallis ANOVA和Dunnet的事后检验）。
在起搏过程中，钙的进入是以代谢为代价的，因为它必须被三磷酸腺苷（ATP）依赖性过程挤压。这种需求主要通过线粒体通过氧化磷酸化（OXPHOS）来满足。超氧化物和活性氧（ROS）是氧磷的副产品，增加了钙进入造成线粒体氧化应激的可能性。为了确定是否是这种情况，产生了表达具有线粒体基质靶向序列（mito-roGFP）的绿色荧光蛋白（roGFP）的氧化还原敏感变体的转基因小鼠7。为了限制单胺能神经元的表达，丝裂原GFP在酪氨酸羟化酶启动子的控制下表达(). 这些小鼠SNc和邻近VTA的多巴胺能神经元强烈表达与线粒体标记物共定位的丝裂原GFP(;补充图1)为监测线粒体基质蛋白的氧化提供了一种可逆的定量方法。由于mito-roGFP的表达仅限于一小部分神经元，因此可以使用双光子激光扫描显微镜（2PLSM）监测年轻成年小鼠脑切片深处单个神经元的线粒体氧化还原状态。
在VTA多巴胺能神经元中，丝裂原GFP的基础氧化很低(). 相比之下，邻近的SNc多巴胺能神经元中丝裂原GFP的氧化明显更高(). 在起搏与VTA神经元相似的青少年SNc多巴胺能神经元中，线粒体氧化应激也较低(). 为了验证这种压力不是脑切片的伪影，我们制造了第二只转基因小鼠，在巨细胞病毒启动子的控制下表达了丝裂原GFP，在大脑皮层、纹状体和海马中产生了强大的神经元表达。在这些小鼠的脑切片中，每个区域的主要神经元都没有任何明显的线粒体氧化(补充图2)，演示切片就其本身而言不会产生氧化应激。
对线粒体氧化应激起重要作用的是通过质膜L型通道的钙内流。拮抗L型通道显著降低丝裂原GFP氧化的程度()就像通过冷却来减缓起搏一样(). L型通道拮抗剂对邻近VTA多巴胺能神经元基质蛋白的氧化没有影响(). Ru360阻断钙从细胞质进入线粒体8roGFP氧化减少（不影响起搏）()表明它有助于推动OXPHOS9。
DJ-1的功能丧失突变与常染色体隐性遗传早发型PD有关10虽然DJ-1本身不是一种抗氧化酶，但它对氧化还原敏感，并参与线粒体超氧化物生成激活的信号级联。为了检测其在SNc多巴胺能神经元中的作用，将DJ-1基因敲除小鼠与TH-mito-roGFP小鼠杂交。这些小鼠的SNc多巴胺能神经元具有正常的起搏和细胞内钙浓度的振荡(). 然而，在这些神经元的生理温度下，基础有丝分裂-rGFP氧化几乎完成，因此在较低的温度下重新检查细胞。这些研究证实了野生型和DJ-1基因敲除神经元在高温下氧化的强烈差异(). 这种差异实际上被L型钙通道的拮抗所消除(). 相反，邻近VTA多巴胺能神经元的线粒体不受DJ-1缺失的影响().
DJ-1基因敲除小鼠SNc多巴胺能神经元氧化应激升高（a） DJ-1基因敲除小鼠脑切片中SNc多巴胺能神经元的体细胞全细胞记录显示正常起搏（顶部）和细胞内钙振荡（底部）；在所有被检测的五个神经元中也得到了类似的结果。（b） 线粒体丝裂原GFP氧化（红色痕迹）高于对照SNc多巴胺能神经元（黑色痕迹）；依沙地平预处理使有丝分裂-绿色荧光蛋白（绿色痕迹）的氧化正常化；实验在20-22°C下进行。（c） 盒图总结了野生型SNc神经元（n=9）、DJ-1基因敲除SNc细胞（n=6）和DJ-1敲除神经元在伊拉地平预处理后的平均丝裂原GFP测量值（n=7）；野生型和DJ-1基因敲除组之间的差异显著（P<0.05），使用和不使用伊拉地平治疗的敲除组间的差异也显著（P<0.01）。（d） 方框图总结了34-35°C下野生型VTA多巴胺能神经元（n=9）、野生型SNc多巴胺能神经细胞（n=14）和DJ-1敲除VTA多巴曼能神经元（红框）（n=4）的平均线粒体GFP测量值。VTA多巴胺能神经元不受DJ-1缺失的影响（P>0.05）。
DJ-1在减轻线粒体氧化应激中所起作用的线索来自于用阳离子染料四甲基罗丹明甲酯（TMRM）测量线粒体内膜（IMM）电位(;补充电影). 在VTA多巴胺能神经元中，TMRM荧光在长时间内是强健和稳定的(). 相反，相邻SNc多巴胺能神经元的线粒体TMRM荧光反复下降，然后又上升到峰值，表明线粒体暂时去极化(;补充电影). 这种“闪烁”在很长一段时间内（>60分钟）是稳定的，是SNc多巴胺能神经元特有的，并辩称它不是制剂的产物(补充图2). 使用能斯特方程将IMM电位与线粒体与核TMRM荧光比率联系起来11线粒体电位的闪烁似乎是适度的，对应的IMM去极化仅为20-30 mV。
线粒体闪烁依赖于超氧化物的产生和线粒体解偶联蛋白的补充（a） 四甲基罗丹明甲酯（TMRM）孵育脑片中的SNc多巴胺能神经元标记线粒体；显示了从中进行荧光测量的感兴趣区域（ROI）（黄色圆圈）。（b） 鱼藤酮（红色痕迹）应用前后SNc多巴胺能神经元（黑色痕迹）的代表性荧光时间序列；在所有检测的细胞中也观察到类似的结果（n>20）。为了进行比较，显示了典型VTA多巴胺能神经元的时间序列（蓝色轨迹）（n=10）。（c） 左图，伊拉地平浴前（黑色痕迹）和浴后（绿色痕迹）的TMRM荧光测量；右方框图总结了应用伊拉地平（n=5）或Ru360（n=6）前后对照细胞的闪烁平均频率，两者均显著降低了闪烁频率（P<0.05）；总结从荧光测量推断出的相对电压变化平均幅度的方框图；在所有条件下，振幅均相似（P>0.05）。（d） 左图，MPG浴前和浴后荧光时间序列（绿色痕迹）；右侧，汇总平均频率和振幅测量值的方框图（n=5）；MPG显著降低闪烁频率（P<0.05），但不降低闪烁幅度（P>0.05）；京尼平降低了闪烁的频率和幅度；右侧方框图总结了京尼平前后的平均振幅和频率测量值（n=5）；京尼平显著降低两个参数（P<0.05）。亲环素D基因敲除组的两项测量结果均正常（n=10；P>0.05）。
用伊拉地平拮抗质膜L型钙通道可显著降低闪烁率(;补充影片)正如Ru360阻止钙进入线粒体一样(). 然而，使用细胞渗透性抗氧化剂N-（2-巯基丙酰基）-甘氨酸（MPG）清除活性氧也可以减弱闪烁()这表明，由钙进入而非钙本身引起的氧化应激是线粒体闪烁的原因。这一推论与线粒体闪烁大约比胞浆钙浓度（c.f。，，).
众所周知，超氧化物的产生会触发两种离子通道的开放，这两种通道会使IMM去极化。其中之一是渗透率转换孔（PTP）12然而，在缺乏亲环素D（PTP的关键调节剂）的SNc多巴胺能神经元中，TMRM闪烁是正常的()反对PTP的角色。众所周知，环孢菌素A可以对抗PTP，减少IMM闪烁，但它也可以减缓或停止起搏（和钙内流），使其成为一种不可靠的诊断工具。
解偶联蛋白（UCP）是另一类线粒体离子通道，其开放概率因超氧物而增加13.UCP开放适度降低了IMM潜力14，使其成为从TMRM测量值推断出的IMM电位下降的合理中介体。已经克隆了五个UCP，其中三个在SNc中稳健表达（UCP2,4,5）15UCP拮抗剂京尼平的应用16显著降低线粒体闪烁的频率和幅度()就像用三磷酸腺苷透析神经元一样(补充图3)，为UCP调解提供支持17UCP激活引起的适度去极化被认为可以减少超氧化物的生成，而不会显著影响ATP的生成，从而形成一个保护性的负反馈系统，补充酶对活性氧的防御17，18如果是这样的话，用京尼平阻断UCP应该会导致超氧化物水平和线粒体蛋白质氧化增加。事实上，京尼平显著提高了SNc多巴胺能神经元中丝裂原GFP的氧化，而它对VTA多巴胺能神经细胞的线粒体氧化没有影响，而VTA多巴胺能神经细胞中的UCP防御没有参与().
DJ-1缺失减弱线粒体膜电位UCP依赖性闪烁（a） 左，SNc多巴胺能神经元（如)京尼平使用前后（红色痕迹）。右方框图总结了对SNc多巴胺能神经元应用伊拉地平（绿色方框）（n=9）或京尼平（红色方框）（n=6）后的平均丝裂原GFP测量值；伊拉地平显著降低氧化，而京尼平增加氧化（P<0.05）。图中还显示了京尼平作用下VTA多巴胺能神经元丝裂原原纤维蛋白（mito-roGFP）测量值的方框图；京尼平对这些测量值没有影响（n=5，P>0.05）。（b） 左，野生型SNc多巴胺能神经元（黑色痕迹）和DJ-1基因敲除（红色痕迹）的TMRM荧光测量。右侧，野生型（n=21）和DJ-1敲除神经元（n=7）的平均频率和振幅数据的方框图；DJ-1基因敲除组闪烁幅度和频率均降低（P<0.05）。（c） UCP表达的定量PCR分析DJ-1型敲除小鼠：VTA和SNc中UCP2 mRNA丰度（相对于GAPDH）没有显著改变（P>0.05，n=9）。右边的条形图显示了UCP4和UCP5 mRNA的丰度，并通过每个样本中UCP2的丰度进行了标准化。UCP4和UCP5 mRNA的相对丰度在DJ-1型敲除小鼠（P<0.05，n=9）。来自DJ-1型敲除小鼠（P<0.05，n=9），而UCP5 mRNA无变化。（d） 对起搏期间通过L型通道进入钙离子与线粒体氧化应激升高和UCP开放相关的结果进行了示意性总结。该模型还提出，氧化DJ-1转位到细胞核，增加UCP4和UCP5的转录，导致IMM中UCP蛋白增加。
在DJ-1型SNc多巴胺能神经元缺失，线粒体闪烁的幅度和频率降低，表明其UCP防御受到损害(). 由于DJ-1主要存在于线粒体外，它不太可能在门控UCPs中发挥直接作用19DJ-1的另一个功能是上调抗氧化蛋白的表达，以应对应激10，20，21对DJ-1敲除子SNc mRNA的定量分析显示UCP2 mRNA水平正常()这表明UCP2并不是闪烁的参与者——这一结论与对UCP2基因敲除小鼠神经元的检测一致（数据未显示）。相反，UCP4和UCP5 mRNA在DJ-1型淘汰赛()，使表达水平降至未受压VTA中的水平。UCP在大脑皮层、纹状体和海马中的表达水平在DJ-1型删除(补充图4). 抗氧化酶锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的mRNA在DJ-1基因敲除的SNc中的表达也基本不变，但MnSOD蛋白的原位免疫反应性较高(补充图5). 这些数据表明，缺乏DJ-1的SNc多巴胺能神经元线粒体氧化应激的升高并不是由于抗氧化酶表达降低，而是由于UCP4和UCP5表达降低，从而减弱了UCP介导的线粒体解偶联对钙诱导应激的响应。
总之，我们的研究表明，成熟的SNc多巴胺能神经元存在基本的线粒体氧化应激。这种氧化应激不是老年、病理或实验准备的结果，而是自主起搏过程中参与L型钙通道的神经元设计的结果。长期以来，这种线粒体氧化应激被认为是PD病因的核心2然而，没有人解释为什么中脑神经元中的这种压力会更大。我们的结果填补了这一空白(). SNc多巴胺能神经元的基础氧化应激通过DJ-1基因的缺失而放大，DJ-1是一种与早发家族性PD相关的基因10DJ-1的缺失降低了SNc中的UCP5和UCP4 mRNA，降低了线粒体对氧化应激的解偶联反应。虽然假设DJ-1型SNc多巴胺能神经元的缺失是由UCP表达缺失介导的，尚待明确测试，这种情况提供了一个例子，说明广泛表达的基因中的突变可能仅在神经元亚群中表现出来。我们的数据也为SNc多巴胺能神经元线粒体DNA（mtDNA）突变随年龄的异常积累提供了潜在的解释22，23这些突变可归因于累积的超氧化物暴露，降低线粒体能力并促进表型下降、蛋白质平衡损伤和死亡24，25。
由于接触二氢吡啶可显著减轻SNc多巴胺能神经元的线粒体氧化应激，我们的研究结果也表明，在特发性和家族性帕金森病中都有潜在的神经保护策略。二氢吡啶在人类中的安全使用历史悠久，具有良好的药代动力学特性，包括跨越血脑屏障的能力26最近的流行病学研究支持其潜在价值，表明使用二氢吡啶可显著降低PD风险27，28。
