突触前NMDA受体在活动依赖性BDNF分泌和皮质纹状体LTP中的重要作用

TBS诱导LTP的轴心NMDAR激活要求

接下来，我们探讨了TBS诱导的皮质纹状体LTP的机制。以往对海马CA3-CA1突触的研究表明，TBS在生理性镁²⁺-含药溶液可诱导一种LTP，涉及突触前促进递质释放，并需要突触前BDNF的表达(Zakharenko等人，2003年;Zakharenko等人，2001年). 在皮质纹状体突触，TBS诱导的LTP也依赖于NMDAR的激活(图1G和1H)，但是否涉及突触前NMDAR尚不清楚。因此，我们通过删除关键的NMDAR亚单位GluN1直接检查了这个问题(Tsien等人，1996年)用条件基因缺失方法从突触前皮层神经元中提取。为了实现这一目标，我们共同注射了一种编码Cre和mCherry的腺相关病毒（AAV）载体（AAV-CMV-Cre-2a–mCherry），以及另一种含有Cre依赖性基因表达盒的AAV载体，该基因表达盒编码高效通道视紫红质-2（ChR2）变体，用于更快的神经元刺激[ChETA_总费用; AAV-DIO（双浮动反向开放阅读框）-hChR2（E123T/T159C）-EYFP](Berndt等人，2011年)进入野生型（WT）小鼠或敲入型小鼠的初级运动皮层（M1）(格林1^{飞行/飞行})其中GluN1基因(格林1)两侧有两个液氧磷站点(Tsien等人，1996年). 这些小鼠在病毒注射4周后用于切片记录。两种AAV载体的表达应导致Cre依赖性格林1-与ChETA一起删除_总费用–EYFP在同一皮层神经元中的表达格林1^{飞行/飞行}老鼠(图2A和图S2A)，由于ChETA的Cre介导重组要求_总费用–EYFP表达。注射AAV后，M1区Cre表达神经元和背纹状体M1衍生轴突中GluN1蛋白的免疫染色缺失，证实了GluN1表达的Cre依赖性缺失格林1^{飞行/飞行}老鼠(图S2A)注射AAV的M1中C表达的皮层神经元缺乏NMDA诱导的内向电流格林1^{飞行/飞行}小鼠与对照神经元的比较(图S2B).

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图2

LTP依赖于功能轴NMDAR和BDNF表达

（A） 描述LTP光遗传学诱导方法的示意图。使用野生型纹状体切片，从MSN胞体进行全细胞记录，格林1^{飞行/飞行}，或Bdnf公司^飞行注射AAV（AAV-Cre-2a–mCherry和AAV-DIO-ChETA）的小鼠_{欧盟委员会}-EYFP）在记录前4周在M1区域。表达ChETA的轴突_{欧盟委员会}-通过光脉冲（0.2–1 ms；λ=480 nm）选择性激活EYFP和Cre（绿色）。

（B） 显示表达ChETA的皮质轴突的纹状体切片的典型共焦图像_总费用（绿色）和通过全细胞记录吸管装载Alexa 594染料（红色）的MSN（及其树突）。

（C） LTP诱导光刺激的TBS模式示意图，以及纹状体MSN对连续突发刺激的光诱发复合EPSP反应示例。

（D）上部面板：具有代表性的轨迹（平均10个EPSP），显示基线期间（-5～0分钟；左）或具有TBS模式的光脉冲后35～40分钟（右）的光诱发EPSP反应。下部面板：来自一个代表性实验的数据显示，光遗传刺激后EPSP反应增加。黑色条，具有TBS图案的光脉冲。

（E） 所有光遗传学LTP实验总结。测试光脉冲诱发的平均EPSP振幅（0.5 Hz），显示为视基因TBS前后的归一化平均EPSP幅度（以横线标记）。野生型小鼠（“WT”）：在缺乏（“CTL”，30-40分钟时为基线的291±44%）或存在“APV”（100µM，106±29%）或“TrkB-IgG”（2µg/ml，109±160%）的情况下。“Bdnf−/−”（142±17%）和“格林1^-/”(135±17%）：来自小鼠的数据Bdnf公司一个d格林1通过表达Cre而删除的基因Bdnf公司^飞行和格林1^{飞行/飞行}小鼠。平均值±标准偏差（n=5-9片，每片至少4只小鼠）。

（F） （E）中所示数据的皮质纹状体切片视基因TBS后30～40分钟内EPSP平均振幅的累积百分比图（**P<0.01，Kolmogorov-Smirnov检验）。另请参见图S2.

然后我们检查了光遗传光刺激是否能使ChETA去极化_总费用-使用注射上述两种AAV载体的WT小鼠，以爆发模式表达M1神经元，并在纹状体MSN中激发突触反应。在这些老鼠身上，科塔_总费用在M1轴突中表达格林1删除(图S2A). 表达ChETA的M1锥体神经元胞体的全细胞记录_总费用冠状切片(图S2D)在100Hz突发刺激期间，对短暂光脉冲（0.2–1.0 ms；λ=480 nm）的响应显示出可靠的峰值(图S2E). 此外，TBS模式的光刺激诱导的复合EPSP与TBS模式电刺激诱导的EPSP相似，但具有更快的峰值时间(图2C;图S2F–S2I).

从背外侧纹状体的MSN记录显示，“测试”刺激（低频单光脉冲；0.03 Hz）可靠地以恒定振幅诱发EPSP(图2D). 此外，这些TBS模式的光刺激也使所有记录切片（6个切片中的6个切片；图2E). 此外，APV治疗阻断NMDAR或细胞外BDNF被结合BDNF的可溶性配体TrkB-IgG螯合（p<0.01；图2E和2F). 因此，TBS模式的光刺激诱导的光生LTP与电诱导的LTP相当。进一步分析LTP诱导后是否改变了突触前或突触后的特性。当通过绘制1/CV图分析变异系数（CV）的变化时²相对于TBS引起的平均EPSP振幅变化（通过基础EPSP振幅归一化）(Faber和Korn，1991年)我们发现LTP的表达与突触前释放的概率增加有关(图S2J). 与TBS前相比，TBS后30分钟EPSP振幅的配对脉冲比率[PPR；刺激间期（ISI）=50 ms]显著降低（p<0.05；图S2K). 此外，我们还发现TBS诱导的突触后修饰，如在光遗传TBS后NMDAR-和AMPAR-介导的诱发突触后兴奋电流（EPSCs；NMDA/AMPA比率）显著降低（p<0.05；图S2L). 因此，TBS诱导的LTP伴随着突触前和突触后的变化。

接下来，我们检测了视基因LTP诱导格林1^{飞行/飞行}M1轴突中GluN1的Cre依赖性缺失小鼠。与在对照WT小鼠中发现的结果相反，相同的光遗传TBS导致纹状体切片中的LTP显著降低格林1^{飞行/飞行}小鼠（p<0.01）；图2E和2F)表明皮质激素性LTP需要功能性轴突NMDAR。皮质神经元的树突状NMDAR不太可能参与，因为这些纹状体切片的冠状切片已经将轴突从M1的细胞体上切断。对基础EPSP反应和复合EPSP的分析表明，TBS模式的光刺激不受抑制NMDAR或减少皮层轴突中GluN1表达的影响(图S2N–S2Q)表明LTP的缺乏不是由于NMDAR介导的突触传递活动发生改变。最后，我们发现突触后NMDAR对TBS诱导的LTP也是必需的，因为当NMDAR拮抗剂MK-801（1 mM，参见休谟等人，2003年)通过记录吸管透析到记录的MSN中(图S2M).

TBS诱导LTP中轴突BDNF的需求

通过选择性消除BDNF的表达，进一步研究了轴突BDNF在TBS诱导的LTP中的重要性Cre-loxP公司删除Bdnf公司使用AAV感染相同策略的M1皮层轴突中的基因（见实验程序；图S2R和S2S). 我们发现，皮层轴突BDNF表达的缺失导致基底突触传递减少，并显著降低TBS期间的复合EPSP反应(图S2N–S2Q)表明BDNF表达减少导致突触前损伤。这些结果与Schaffer侧支CA1突触的结果相似Bdnf公司基因敲除小鼠(Patterson等人，1996年;Pozzo-Miller等人，1999年). 此外，我们发现光遗传学TBS在Bdnf公司-缺陷的皮质轴突在纹状体切片中受到刺激Bdnf公司^{飞行/飞行}小鼠（p<0.01）；图2E和2F). 因此，TBS诱导皮质醇LTP需要突触前轴突中的NMDAR和BDNF。突触前BDNF缺失的切片中基础突触传递减少可能导致TBS期间突触后NMDAR的次优激活，部分解释了LTP诱导失败的原因。

分泌的BDNF可以诱导突触增强的观点得到了进一步的支持，这一发现是，外源性BDNF（200 ng/ml）处理脑片可以提高皮质纹状体突触的基础突触传递，但APV治疗阻止了BDNF诱导的突触增强(图S2T和S2U). 这种NMDAR依赖性以及BDNF和光遗传学TBS诱导的增强在时间过程和增强幅度上的相似性表明，这两种形式都是由相似的机制介导的。

轴突NMDARs升高活动诱导的突触前钙²⁺

由于已知BDNF分泌为Ca²⁺-从属的(Leβmann和Brigadski，2009年)，增强Ca²⁺由于轴突NMDAR的激活而引起的升高可能解释了功能性轴突NMDA对LTP诱导的需求。我们通过直接测量钙来检验这种可能性²⁺突触前皮质轴突的变化，使用钙²⁺-传感器GCaMP5(Akerboom等人，2012年)在M1皮层轴突中特异表达。将含有Cre依赖性GCaMP5结构的AAV载体注入M1Emx1-核心两周后检查小鼠和注射小鼠的皮质纹状体切片。我们发现，电刺激具有TBS模式的M1轴突会导致背侧纹状体皮质轴突中GCaMP5荧光的长期升高(图3A)TBS后约400秒衰减至基线(图3A). 此外，我们发现初始Ca²⁺升高（TBS后30–90秒）主要受到CdCl预处理的抑制₂（100µM）或钙²⁺-游离溶液（含2 mM EGTA的无钙ACSF²⁺)，表示细胞外钙的需求²⁺通过钙的流入²⁺通透性通道（p<0.0001，CTL vs.Ca²⁺-游离或CdCl₂;图3A和3B). 另一方面，持续的钙²⁺刺激期后（TBS后100–300秒）的升高在很大程度上取决于钙²⁺从内部存储释放，因为轴突钙延长²⁺当细胞内钙²⁺通过环噻唑酸（CPA；30µM）预处理耗尽了储存（p<0.01，CTL与CPA相比；图3A和3B). 此外，TBS诱导的长期钙²⁺APV的出现也基本消除了血压升高（p<0.01，CTL vs.APV；图3A和3B)与NMDAR介导轴突Ca的参与一致²⁺触发Ca的累积²⁺从内部仓库释放。最后，这种延长的轴突Ca²⁺升高不是由于有害的钙²⁺电刺激引起的反应Emx1-核心表达GCaMP5和ChETA的小鼠_总费用-mCherry显示出TBS诱导的Ca延长²⁺海拔（高达～400秒），通过APV预处理消除(图S3).

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图3

TBS诱导钙²⁺皮质轴的高度取决于轴突NMDAR

（A） 背侧纹状体皮质轴突终末GCaMP5荧光信号的测量。上部记录道：代表性实验中TBS诱导GCaMP5荧光的样品记录。不同的实验条件用颜色编码（与下图相同）。该图描述了TBS诱导GCaMP5荧光随时间变化的分数变化的所有实验结果（ΔF_t吨/F类₀). 平均值±标准偏差（n=44–82，至少来自4个切片）“CTL”（对照）：ACSF（含2 mM Mg²⁺和100µM苦曲霉毒素）。“+APV”：具有100µM APV的ACSF。“氯化镉₂“：含100µM CdCl的ACSF₂.“+CPA”：普通ACSF，含30µM CPA。“0钙²⁺“：不添加Ca的ACSF²⁺和2 mM EGTA。

（B） 平均ΔF汇总_t吨/F类₀（±s.e.m.）在TBS应用后30–90和100–300秒。条上的颜色与（A）相同。点和片（带括号）的数量用条表示（**，p<0.01；***，p<0.001；单向方差分析事后的，事后的测试）。平均ΔF_t吨/F类₀在30–90s期间：CTL，0.45±0.06；APV，0.30±0.06；氯化镉₂, 0.10 ± 0.03; CPA，0.30±0.05；0钙²⁺, 0.06 ± 0.02. 平均ΔF_t吨/F类₀在100–300秒内：CTL，1.02±0.22；APV，-0.05±0.04；氯化镉₂, 0.24 ± 0.07; CPA，0.37±0.08；0钙²⁺, 0.08 ± 0.06.

（C） 背侧纹状体皮质轴突终末GCaMP5荧光信号的测量。上部记录道：代表性实验中HFS诱导GCaMP5荧光的样品记录。不同的实验条件用颜色编码（与下图相同）。该图描述了HFS诱导GCaMP5荧光随时间变化的分数变化的所有实验结果（ΔF_t吨/F类₀). 平均值±标准误差（n=28–87，至少来自5个切片）。“CTL”：ACSF（含100µM苦毒毒素，2 mM Mg²⁺). “低镁²⁺“：低镁²⁺ACSF（<200µM Mg²⁺). “低镁²⁺/+APV“：低镁²⁺带100µM APV的ACSF。“0钙²⁺“：不添加Ca的ACSF²⁺和2 mM EGTA。

（D） 平均ΔF汇总_t吨/F类₀（±s.e.m.）在HFS应用后30–90和100–300秒。颜色代码与（C）中的相同。点和片的数量（带括号）用条表示（*，p<0.05；***，p<0.01；单向方差分析事后的，事后的测试）。对于30−90秒：CTL，0.14±0.03；低镁²⁺，0.31±0.04；低镁²⁺/+APV，0.18±0.03；0钙²⁺, 0.04 ± 0.02. 100–300秒：CTL，0.25±0.05；低镁²⁺, 0.63 ± 0.09; 低镁²⁺/+APV，0.26±0.06；0钙²⁺, 0.07 ± 0.05.

（E） 纹状体切片示意图格林1^{飞行/飞行}在M1衍生轴突中表达Cre-2a–mCherry和GCaMP5的小鼠。红色：仅限Cre（mCherry）。绿色：仅GCaMP5。黄色：Cre+GCaMP5。下面高分辨率的荧光图像显示了包含这三种轴突的典型背纹状体区域。空箭头：表达Cre+GCaMP5的轴突。填充箭头：仅表达GCaMP5的轴突。

（F） GCaMP5荧光随时间变化的代表性记录痕迹（ΔF_t吨/F类₀)在三次TBS（bar）发作期间，在添加APV之前和之后，以及在APV被清除后，仅从GCaMP5记录到轴突（绿色）和轴突共同表达GCaMP4和Cre（黄色）。仅表达Cre的轴突未检测到GCaMP5信号。

（G） 以类似方式记录的所有数据汇总（平均值±s.e.m；n=12-15），如(f），仅表达GCaMP5的轴突(“Grin1-CTL”)和同时表达GCaMP5和Cre的轴突(“格林1^−/−”）在3个纹状体切片中。

（H） 平均ΔF汇总_t吨/F类₀（±s.e.m.）在TBS应用后30–90和100–300秒。颜色代码与（F）和（G）相同。两只老鼠的穿孔数和切片数（带括号）用横条显示（**，p<0.01；未配对t吨-测试）。在控制条件下（基线），平均ΔF_t吨/F类₀30-90年代：格林1CTL=0.27±0.06；研磨机1^−/−=0.15±0.04，平均ΔF_t吨/F类₀在100–300秒内：格林1CTL=0.74±0.15；格林1^−/−= 0.22 ± 0.05. 在存在APV（+APV）的情况下，平均ΔF_t吨/F类₀30-90年代：格林1CTL=0.20±0.07；格林1^−/−=0.14±0.06，平均ΔF_t吨/F类₀在100–300秒内：格林1CTL=0.01±0.05；格林1^−/−= 0.09 ± 0.09. APV被冲刷（冲刷）后，平均ΔF_t吨/F类₀30-90年代：格林1CTL=0.14±0.07；格林1^−/−=0.04±0.02，平均ΔF_t吨/F类₀在100–300秒内：格林1CTL=0.35±0.09；格林1−/− = 0.05 ± 0.03. 另请参见图S3.

自HFS诱导低镁LTP以来²⁺这种情况还需要细胞外BDNF(贾等人，2010)可能由皮层轴突终末分泌，以应对钙升高²⁺，我们进一步研究了HFS是否也能够激活NMDAR依赖的轴突Ca²⁺高程。我们发现HFS诱导非常小的轴突钙²⁺正常镁含量增加²⁺溶液，但有强大的轴突Ca²⁺低镁地区的海拔²⁺APV基本上废除的解决方案(图3C和3D). 这些结果支持低镁²⁺这种条件有助于HFS诱发的谷氨酸释放诱导突触前NMDARs的激活，随之而来的Ca²⁺触发BDNF分泌和LTP所需的升高（见下文）。

直接测试轴突NMDAR在TBS诱导的Ca中的作用²⁺高程，我们删除了格林1通过将含有AAV的突触蛋白启动子驱动的GCaMP5（AAV-hSyn-GCaMP4）与AAV-CMV-Cre-2a–mCherry共同注射到M1皮层神经元，选择性地在M1皮层神经细胞中表达格林1^{飞行/飞行}老鼠(图3E). 这使我们能够将来自轴突的GCaMP5信号与功能性NMDAR（仅表达GCaMP6格林1-CTL“）和GluN1缺失的轴突（共同表达GCaMP5和Cre；”格林1^−/−“）在相同的矢状旁皮质纹状体切片中(图3E). 我们在“格林1-电TBS显示纹状体背侧CTL轴突²⁺海拔被APV可逆废除(图3F和3G)与NMDAR参与TBS诱导的钙²⁺积累。相反，相同的TBS未能诱导持续的Ca²⁺同一切片中GluN1缺失轴突的升高（p<0.01；图3H). 因此，TBS诱导的轴突钙确实需要轴突NMDAR的激活²⁺积累。

BDNF分泌需要NMDAR激活

使用MYC标记的BDNF蛋白的免疫染色Bdnf-myc公司敲除小鼠(Dieni等人，2012年)我们发现，背侧纹状体中的大多数内源性BDNF-MYC蛋白定位于皮质轴突中的致密核心小泡，如它们与致密核心小囊标记物嗜铬粒蛋白B或预先加载到M1神经元的染料示踪物共同定位所示(图S4)纹状体细胞或多巴胺能纤维中内源性BDNF-MYC无明显表达(图S4). 这与纹状体BDNF的皮质起源一致(Altar等人，1997年). 鉴于TBS能有效诱导钙延长²⁺皮层轴突升高(图3)因此，轴突BDNF的分泌可能由TBS通过NMDAR依赖性Ca触发²⁺发出信号。

为了直接观察纹状体皮层轴突分泌NMDA依赖性BDNF，我们表达了用荧光蛋白标记的BDNF。这是因为成人大脑中内源性BDNF的浓度极低（约150 ng/g组织重量）(松本等人，2008年)目前还没有可靠的方法检测活组织中如此低的浓度。A类Bdnf公司该构建物与pH敏感荧光蛋白（超黄道pHfluorin；BDNF-pH）的cDNA融合(Matsuda等人，2009年)已知其经历相同的细胞内过程，并表现出与天然BDNF相似的生物活性(Matsuda等人，2009年; 参见讨论）。为了限制BDNF-pH在皮层锥体神经元中的表达，我们将一种含有双flox反向BDNF-pH密码子的AAV载体注射到M1CaMKIIa-Cre公司或Emx1-核心老鼠(图4A). 在注射病毒后2周，我们在支配背纹状体的皮质纹状体轴突中观察到BDNF-pH的高水平表达(图4A)轴突BDNF-pH点主要定位于突触前标记物突触素标记的区域，并与突触后标记物PSD-95并列(图4B和4C). 使用副矢状皮质纹状体切片的时间推移双光子显微镜，通过BDNF-pH点的荧光强度变化来监测活动诱导的BDNF分泌，点代表单个或簇状BDNF颗粒(Matsuda等人，2009年).

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图4

轴突BDNF-pH分泌依赖于NMDAR

（A）左侧：使用副矢状皮质纹状体切片对来自皮质轴突的BDNF-pH荧光的活动诱导变化进行成像的示意图。E类_刺激：双极刺激电极放置在M1的第6层。赖特：表达BDNF-pH的皮质轴突的荧光图像。Ctx：皮质，Str：纹状体。

（B）左侧：免疫染色图像显示BDNF-pH点与突触前标记物突触素（箭头）共定位，提示突触前终末存在BDNF-pH。赖特：免疫染色图像显示许多BDNF-pH点与突触后标记PSD-95（空箭头）并列，但很少有共同定位的BDNF-pH和PSD-95点（黄色箭头）。

（C） BDNF-pH荧光点与突触素和PSD-95点共定位的定量测量，用每个光学截面中的总BDNF-pH点进行归一化（平均值±s.e.m.；***，p<0.001，未配对t吨-测试）。统计的纹状体切片数量（来自2只小鼠，每片切片随机取样一个光学切片）显示在条中。

（D） 显示正常记录溶液（“CTL”）或含有APV（“APV”）的溶液中TBS前10 s、后50 s和100 s BDNF-pH点（箭头）荧光变化的示例图像。

（E） CTL中TBS前后BDNF-pH点状荧光的样品痕迹(左边)和APV(正确的)条件。红色：点状荧光降低至基线以下（“分泌融合”）；蓝色：荧光高于基线（“融合无分泌”）；黑色，TBS后无荧光变化（“无融合”）。

（F） 平均荧光分数随时间变化的总结（ΔF_t吨/F类₀)对于记录的所有punta，如（E）所示。

（G） 条形图描述平均ΔF_t吨/F类₀（±s.e.m.）。标点和切片的数量（带括号）用条形图表示。TBS:CTL，−0.15±0.03+APV，−0.018±0.04；**p<0.01，未配对t检验。HFS中：CTL，0.21±0.05；低镁²⁺, −0.26 ± 0.04; 低镁²⁺/APV，0.02±0.06；***p<0.001，单因素方差分析事后的，事后的测试。另请参见图S4.

以前使用BDNF-pH的研究表明，轴突中含有BDNF的颗粒可以进行活性依赖性的外细胞融合，无论是否分泌颗粒物(Matsuda等人，2009年). 这通常表现为初始荧光增加（融合孔开放和BDNF-pH暴露于高pH环境），随后荧光逐渐减少回到基础水平（“融合无分泌物”）或低于基础水平（”融合有分泌物“）(Matsuda等人，2009年). 在皮层轴突的TBS中，我们发现大多数荧光点状物与分泌物融合，BDNF-pH荧光总体降低到基础水平以下(图4D–4F). 在APV（100µM；图4G; p<0.01），但不受多巴胺信号的影响(图S4H)，与TBS-LTP结果一致。另一方面，HFS在低镁中诱导了BDNF-pH荧光的强烈降低²⁺条件下，但通过添加APV或正常Mg，荧光降低变为增加²⁺至记录溶液(图4F和4G; p<0.001，低镁²⁺与正常镁²⁺或低镁²⁺/APV）。这些结果表明NMDAR介导的钙²⁺升高对轴突BDNF分泌至关重要，尽管不分泌BDNF的小泡可能通过NMDAR依赖机制发生融合。最后，我们发现TBS不能触发轴突BDNF分泌和LTP诱导，当内源性Ca²⁺通过CPA预处理，库存被耗尽(图S4H–S4K)，证实了钙的重要性²⁺从内部仓库释放TBS诱导的BDNF分泌和LTP。

视生与电刺激诱导的LTP

我们用光遗传学方法通过高效ChR2（ChETA）的光激活诱导皮质纹状体突触LTP_总费用)-用TBS模式的光照表达轴突。我们的数据表明，高频的短暂光脉冲能够触发快速有效的神经元兴奋，在100Hz的突发内，后期的尖峰偶尔会失败(图S2). 突触后MSN中由光突发触发的复合EPSP与由电性TBS触发的EPSP相当(图S2). 我们的发现是，光学TBS诱导的LTP对NMDAR激活和细胞外BDNF的依赖性与电TBS诱导LTP的依赖性相同(图1H和​和2F）2楼)支持这两种LTP共享共同的细胞机制的观点。此外，我们的研究表明，由于受刺激轴突的特异性，通过结合ChR2表达和靶基因的遗传操作，光遗传LTP最适合研究活动依赖性同突触可塑性和相关突触前机制的作用。

我们的数据表明，光基因TBS诱导LTP表达的时间进程比电刺激诱导的LTP表达慢（比较图1G和​和2E）。第二版). 这可能是由高频突发中光触发的突触前尖峰偶尔失败引起的(图S2)其他因素，例如切片制备（矢状窦旁与冠状窦）和EPSP记录方法（全细胞电流钳与细胞外场记录）的差异也可能导致LTP诱导率的差异。由于矢状窦旁切片中的电性TBS可以激活来自不同皮质区域的轴突，而冠状切片中的视基因TBS只刺激M1皮质轴突表达ChR2，电学和光学TBS也可能刺激了具有不同MSN靶神经元或不同LTP诱导轴突类型特异性时间进程的不同皮质轴突亚群。这种观点也与LTP诱导效果的异质性相一致(Partridge等人，2000年)纹状体背侧不同亚区投射的不同皮质起源(科斯皮托和库尔塔斯·伊林斯基，1981年;McGeorge和Faul，1987年). 最后，通过对M1皮层轴突的特异性刺激，我们的视基因TBS可能揭示了一种特定形式的突触前BDNF-依赖性LTP，它通过慢时间进程的突触前和突触后修饰表达。

突触前NMDAR在突触可塑性中的作用

突触前NMDAR的生理意义已经在之前的一些研究中得到了阐述。除了突触前NMDA对海马和皮层突触谷氨酸释放的自调节作用外(Duguid和Sjostrom，2006年;Kunz等人，2013年;McGuinness等人，2010年)有越来越多的证据表明突触前NMDAR参与活动依赖性突触可塑性。在外侧杏仁核中，丘脑输入释放的谷氨酸可能激活共同活动皮层传入的突触前NMDAR，导致皮层-杏仁核突触的异突触体LTP(Humeau等人，2003年). 目前还没有关于突触前NMDAR参与同突触LTP的报道。突触前NMDAR信号也调节Purkinje细胞小脑平行纤维突触的LTD(Casado等人，2002年;Shin和Linden，2005年)GABA能突触的异突触体LTD与视网膜盖突触LTP的发育相关爪蟾顶盖(Lien等人，2006年). 此外，突触前NMDAR和内源性大麻素受体的同时激活对于第5层锥体神经元之间突触的峰时依赖性LTD是必需的(Sjostrom等人，2003年).

与外侧杏仁核皮层输入的异突触LTP不同，后者独立于突触后NMDAR激活，皮质纹状体突触的LTP需要激活突触前和突触后的NMDAR。纹状体特异性纹状体切片的研究进展研磨机1敲除小鼠显示HFS诱导了皮质纹状体LTP（在低镁状态下观察到²⁺解决方案）被废除(Dang等人，2006年)，表明突触后MSN对皮质纹状体LTP的NMDAR需求，我们的结果证实了这一点(图S2). 此外，我们发现轴突NMDAR的作用(图2)在两个Ca上²⁺升高和突触前BDNF分泌(图3和​和5）。5). 因为分泌的BDNF可以通过TrkB受体介导的信号传导进一步发挥突触前和突触后的修饰作用(Poo，2001年)突触前轴突释放的BDNF可能与突触两侧增强属性的表达有关。

TBS的生理意义

已知TBS触发的神经元尖峰反应模拟生理活动体内例如，背侧纹状体神经元的θ频率活动与纹状体学习有关(DeCoteau等人，2007年;Tort等人，2008年)，以θ范围频率（5Hz）激活皮层传入可以诱导体内无需额外操作纹状体MSN的皮质纹状体LTP(Charpier等人，1999年). 人类研究还表明，具有θ突发模式的皮层激活可以增强人类运动皮层的兴奋性(Huang等人，2005年)通过BDNF相关信令(奇兰等人，2008年).

在本研究中，我们发现在生理条件下，TBS可以诱导强大的LTP，但HFS不能诱导LTP，除非细胞外Mg²⁺降低到非生理水平，尽管HFS在正常镁中诱导LTP²⁺在某些发育期或特定纹状体亚区已报告过这种情况(Partridge等人，2000年). 将突触前刺激与突触后去极化配对（Pawlak和Kerr，2008；Shen等人，2008）对皮质纹状体突触的NMDAR和D1/D5R依赖性LTP也有效，但相同的配对刺激也可能导致LTD诱导（Shindou等人，2011）。另一方面，TBS可以可靠地诱导LTP，该LTP需要激活两个皮质纹状体突触的NMDAR和BDNF信号(图1G和​和3B；3B公司;Hawes等人，2013年)和海马突触(McGuinness等人，2010年;Zakharenko等人，2003年;Zakharenko等人，2001年).

我们的结果进一步表明，与HFS相比，TBS在激活突触前NMDAR依赖机制以触发皮质纹状体LTP方面具有明显的效果。与HFS不同，TBS能够诱导轴突钙延长²⁺正常镁水平下突触前BDNF的分泌和升高²⁺条件。另一方面，低镁²⁺在这种情况下，HFS在诱导NMDAR依赖性轴突Ca方面变得非常有效²⁺升高和BDNF分泌到与TBS诱导的水平相当的水平(图3和​和4）。4). 最后，两种HFS在低镁中诱导的LTP²⁺(贾等人，2010)TBS完全依赖于细胞外分泌的BDNF(图1和​和2），2)起源于突触前轴突。

与HFS相比，TBS有效激活突触前NMDAR的机制是什么？突触NMDAR激活需要同时检测谷氨酸与NMDAR亚基的结合，并通过去极化诱导Mg的去除²⁺阻止NMDAR通道(Jahr和Stevens，1987年;Mayer等人，1984年). 由于LTP诱导的刺激所触发的细胞外谷氨酸增加可能持续数分钟，如附近胶质细胞中突触活性诱发的谷氨酸转运体电流缓慢衰减所示(Diamond等人，1998年;Luscher等人，1998年)细胞外谷氨酸的增加可能与突触前NMDAR的激活有关。虽然释放的谷氨酸总量TBS与HFS（具有相同数量的棘波）不太可能有实质性差异，但TBS模式中棘波的时间传播提供了胞外谷氨酸对突触前NMDAR的更广泛的一致作用，因为轴突膜去极化的时间比HFS长得多。与其他刺激频率相比，θ频率的轴突放电更有效地通过突触前NMDAR增强递质释放，这一发现支持了这一观点(McGuinness等人，2010年)和HFS仅诱导低水平的全球Ca²⁺增加，除非低镁²⁺使用了溶液(图3C).

电生理学

标准人工脑脊液（ACSF）由130 NaCl、3.5 KCl、1.25 NaH组成（单位：mM）₂人事军官₄，24氯化钠_三，2氯化钙₂，2氯化镁₂和10个葡萄糖（pH 7.3）。用异氟醚对小鼠进行深度麻醉，然后经心灌注约20 ml切片ACSF（ACSF含有10 mM Mg²⁺和0.5 mM Ca²⁺)在解剖大脑之前。在电生理记录或双光子成像之前，使用震动器（徕卡），使用冰切片ACSF（低于4°C）制备矢状面旁纹状体切片（400µm厚），并在正常ACSF中保持30–32°C 1小时。将切片置于记录室中，浸入水中，并在室温（20–25°C）下用含氧ACSF（含有100µM苦曲霉毒素以隔离谷氨酸能突触传递）持续灌注（2–3 ml/min）。

使用多灯700B放大器（分子器件）进行全细胞电流灯记录。数据在2 kHz下过滤，在1–5 kHz下数字化，存储在计算机上，并使用pCLAMP 10（Axon Instruments）进行离线分析。使用配备40倍水浸物镜的红外差分干涉光学系统对纹状体MSN进行可视化，并通过以下固有膜特性进行鉴定：静息膜电位大于−80 mV，体内电流注入引起的向内整流，以及尖峰前的长去极化斜坡。硼硅酸盐玻璃贴片电极在填充含有（mM）140 K-葡萄糖酸盐、5 KCl、0.2 EGTA、2 MgCl的移液管溶液后电阻为3-5 MΩ₂，4 Mg-ATP，0.3钠₂-GTP，10钠₂-磷酸肌酸和10个HEPES（pH 7.3，290–300 mOsm）用于EPSP的全细胞电流灯记录。

对于使用电刺激的LTP实验，将钨双极电极（WPI）放置在靠近白质的皮质层6上，以0.5 Hz的频率施加测试刺激以检测EPSP。如果V，录制被拒绝_米在记录过程中，变化超过10%，输入电阻变化超过30%，或者基线EPSP的峰值振幅小于2 mV。在记录稳定反应10分钟后，HFS（4组刺激，间隔10秒，每组包含100 Hz的100个峰值）或TBS（10列刺激，间隔10秒，每列包含4个峰值，频率为100 Hz，以5 Hz重复10次）。EPSP振幅的数据显示为1分钟箱的平均值。对于皮质纹状体LTP的光遗传学诱导，一种含有Cre依赖性ChETA的AAV_总费用表达盒（AAV-EF1a–DIO-hChR2（E123T/T159C）-EYFP；UNC Vector Core）与AAV-CMV-Cre-2A–mCherry（Vector Biolabs）以1:1 GC比率联合注射（每个半球0.5µl，滴度为～1×10¹²GC每µl）转化为C57BL/6野生型M1，格林1^{飞行/飞行}，或Bdnf公司^{飞行/飞行}小鼠使用以下立体定位坐标：AP=+0.2，ML=±0.17，DV=-0.10（单位：mm）。至少有4周的时间来充分表达ChETA_总费用和Cre（mCherry）。如上所述，制备冠状纹状体切片（400µm）并从MSN细胞进行全细胞记录。带有准直器（Thorlabs）的高功率蓝色LED（490 nm）安装在显微镜（Nikon）上，并通过LED驱动器（Thorlabs）传送至切片。使用40X物镜，这种配置可以在～8 mW/mm的范围内发出蓝光²超过～0.20毫米²记录切片的区域。在0.2～1 ms的LED照明持续时间下，这些条件足以诱导1.0至10 mV范围内的稳定EPSP。

BDNF-pH和GCaMP5的表达

通过将BDNF-pHfluorin片段插入AAV-DIO载体构建AAV-DIO-BDNF-pH Fluorin。为了制作定制的AAV-DIO载体，将pJ241-Flex（Addgene质粒18925）的双floxed（floxed with two loxPs and lox2722s）基因插入盒通过KpnI和EcoRI限制性内切酶位点插入AAV-EF1a载体。然后，从pCMV5b–BDNF-pHfluorin经PCR-扩增的BDNF-pH Fluorin通过SpeI限制性内切酶位点插入到AAV-DIO载体中，构建AAV-DIO-BDNF-pHluorin。通过测序和限制性内切酶反应验证质粒。为了制备AAV-hSyn-BDNF-Phfluorin，用KpnI和EcoRV限制性内切酶消化AAV-hSyn-ChR2-EYFP以产生AAV-hSyn载体。PCR扩增的BDNF-pHfluorin插入相同的酶位点。AAV-DIO-BDNF-pHfluorin的包装（血清型5）和纯化由UNC Vector Core完成。如前所述，对AAV-hSyn-BDNF-pHfluorin进行包装（血清型2）和纯化(Maheshri等人，2006年). AAV-Flex-GCaMP5和AAV-hSync-GCaMP5购自Penn Vector Core。

将AAV-DIO-BDNF-pHfluorin或AAV-Flex-GCaMP5注入M1Emx1-核心小鼠（每半球500 nl）。对于条件性GluN1敲除，将AAV-CMV-Cre-2A-mCherry与AAV-hSyn-BDNF-pH或AAV-hSync-GCaMP5（GC比率为1:2；每半球总计500 nl）混合注射到M1格林1^{飞行/飞行}老鼠。

双光子激光扫描显微镜

使用配备Spectra-Physics MaiTai HP DeepSee激光器（700至1020 nm）和40X浸水红外物镜（NA 0.8）的LSM 510 META/NLO Axioimager系统（蔡司；加州大学伯克利分校分子成像中心）进行双光子激光扫描显微镜。BDNF-pH和GCaMP5被880nm激光激发。使用500–550 nm带通滤波器采集BDNF-pH和GCaMP5的发射信号。在纹状体薄片中选择视野（512×512像素，0.21µm/像素，0.8µs像素时间），其中皮层投射保持完整，BDNF-pH或GCaMP5在突触毛样结构（1～2µm）显著表达。

为了记录电刺激后BDNF-pH或GCaMP5强度的变化，我们采集了至少100张连续图像（1 Hz）作为基线，使用放置在靠近白质的皮质层6上的钨双极电极（WPI）进行电刺激，然后在刺激后以1Hz的频率至少再拍摄200张图像。为了对BDNF-pH或GCaMP5和mCherry进行双通道成像，使用单个780-nm或880-nm激光进行激发，但使用不同的发射滤光片独立采集发射（BDNF-pH的500-530nm带通滤光片和mCherry的560nm长通滤光镜）。在一些实验中，含有50 mM NH的等渗ACSF₄每次实验结束时，用Cl（pH 7.4）鉴定轴突BDNF-pH。

我们感谢Karl Deisseroth博士赠送AAV-hSyn-ChR2-EYFP和AAV-DIO-ChETA_总费用-EYFP构建，Yves Barde博士构建BDNF-MYC小鼠，Seung Hee Lee博士协助制备AAV-hSyn-BDNF-pHfluorin。这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH NS 036999）和CHDI基金会（CHDI A3794）的资助。