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电子生活。2015; 4:e07304。
2015年5月11日在线发布。 数字对象标识：10.7554/eLife.07304
预防性维修识别码：项目经理4456606
PMID：25962097

一种保守的组氨酸调节HSPB5结构以触发伴侣活性以应对应激性酸中毒

波尼·拉贾戈帕尔,1 谢霆锋（Eric Tse）,2 安德鲁·博斯特,1 斯科特·德尔贝克,1 雷氏,1 丹尼尔·索斯沃思,2,*和瑞秋·E·克莱维特1,*
沃尔克·多奇，审阅编辑器
沃尔克·多奇，德国歌德大学；
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

小分子热休克蛋白（sHSPs）是重要的“保持酶”伴侣，可形成大的组装体，并对pH和温度压力作出动态反应，以保护客户蛋白免受聚集。虽然sHSPs的α-晶体结构域（ACD）二聚体是通用的构建块，但ACD如何传递结构变化以响应压力以促进保持酶活性尚不清楚。我们发现HSPB5的二聚体界面在生理pH上不稳定，保守组氨酸（His-104）控制界面稳定性和低聚物结构，以应对酸中毒。pH或His-104突变导致的失稳将ACD从二聚体转移到单体，但也会导致HSPB5低聚物状态的大幅度扩张。值得注意的是，His-104突变体不稳定寡聚物是有效的保持酶，可以重组为结构不同的客户端结合复合物。我们的数据支持sHSP功能的模型，其中细胞压力会触发小扰动，从而改变ACD构建块，释放出一种隐秘的伴侣作用模式。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.001

研究生物：无

eLife摘要

蛋白质由一个或多个长链状分子组成，这些分子必须折叠成复杂的三维形状才能正常工作。错误折叠的蛋白质不能发挥作用，并经常聚集成有毒状态，这与许多神经疾病有关，包括阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病。

细胞内温度升高、酸度增加和其他压力条件会阻碍折叠过程，并可能导致现有蛋白质展开和聚集。然而，当细胞经历这些压力时，某些蛋白质——被称为小热休克蛋白（简称sHSPs）——充当“保持酶伴侣”，以保护细胞免受蛋白质错误折叠。

HSPB5是一种与其他蛋白质（称为“客户”）结合并稳定的伴侣蛋白，以防止其聚集。众所周知，HSPB5和其他类似伴侣蛋白的核心结构。但是，尚不清楚伴侣是如何感受到压力条件并作出反应来增加活动以帮助稳定客户蛋白质的。

现在，Rajagopal等人在HSPB5中发现了一种对pH值变化敏感的氨基酸。当细胞内的环境变得更加酸性时，这种氨基酸（组氨酸）会触发HSPB5结构的改变，从而增强伴侣的活性。

然后用另一种氨基酸取代组氨酸，试图将HSPB5锁定到低H状态，模拟应激细胞内的活性HSPB5伴侣蛋白。进一步的实验表明，这个突变的HSPB5是一个超活性的保持酶伴侣，并且它显著改变了其结构，以在保持酶状态下与客户蛋白结合。由此，Rajagopal等人提出了一个模型来解释细胞应激如何触发HSPB5中的微小变化，这些变化通过伴侣分子传播，从而增加其活性。未来的研究将调查HSPB5和其他类似伴侣（与心脏、肌肉和神经疾病相关）的遗传突变是否通过破坏这种反应机制发挥作用。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.002

介绍

细胞有许多策略来应对导致蛋白质错误折叠和聚集的压力条件的后果。蛋白质错误折叠和未缓解的蛋白质聚集的无效解决可能导致神经退行性疾病中出现的斑块、原纤维和其他聚集物种的形成。通常，ATP依赖性伴侣如Hsp70和Hsp90有助于蛋白质重折叠，而ATP非依赖性伴侣如小热休克蛋白（sHSPs）则通过将蛋白质维持在可溶性形式来抑制错误折叠和延迟聚集，从而起到第一反应者的作用。在热休克因子Hsf1的转录调控下，当条件偏离正常值时，例如缺血、缺氧、癌基因激活和化疗，sHSPs的水平可以上升到细胞总蛋白的1%(坎平加和加里多，2012年). sHSP存在于原核生物和真核生物中。人类基因组中编码了10个sHSPs（HSPB1、HSPB2等），大小从15 kDa到25 kDa不等。大多数，包括普遍表达的人类sHSP HSPB5，形成了大的组装体，以多分散低聚物的动态分布形式存在，其性质取决于温度和pH值(Jehle等人，2011年). sHSP的哪种或哪种形式是活跃的，以及它们是如何发挥作用的，这些都是尚未回答的核心问题。此外，sHSP如何与部分未折叠或易聚集的蛋白质（“客户”）相互作用以防止聚集物的形成仍然是个谜。

一些急性细胞应激与酸中毒有关。例如，在缺血性中风后对小鼠大脑的测量显示，缺血组织的pH值为6.4，而正常组织的pH为7.0(McVicar等人，2014年). 细胞pH值的降低可能会导致某些蛋白质的不稳定和/或pI值在6到7之间的蛋白质的溶解度降低。此外，含有极高浓度sHSPs HSPB4和HSPB5的正常晶状体纤维细胞的pH值为～6.5(巴斯内特和邓肯，1985年;Mathias等人，1991年). 这些观察结果提出了一个问题，即一般sHSPs，特别是HSPB5的pH-依赖性特性的性质和决定因素。

在这里，我们报告了pH如何影响HSPB5（也称为αB-晶体蛋白）的结构、生化和功能特性。与所有sHSPs一样，HSPB5有一个保守的中央α-晶体蛋白结构域（ACD），两侧有可变的N端和C端区域。我们对HSPB5-ACD和全长低聚物HSPB5进行了研究，HSPB5-AC是所有sHSPs中发现的二聚体构建块。我们发现ACD二聚体稳定性在生理相关pH范围内降低，并且我们已经确定了一个保守的组氨酸残基，该残基在很大程度上负责观察到的失稳。令人惊讶的是，组氨酸不在二聚体界面上，但其谷氨酰胺或赖氨酸突变部分或全部重演了ACD二聚体和低聚物中的低pH行为。突变蛋白使我们能够探测二聚体界面不稳定的后果，而不需要额外的复杂因素，这些因素是在不同pH值下进行实验时产生的。破坏二聚体界面稳定性的突变会产生超大的低聚物，这些低聚物可以重新排列，与模型客户蛋白形成长寿命复合物。我们的研究揭示了HSPB5/客户交互作用的一种隐秘模式，这是以前在非应激条件下使用野生型蛋白检测到的。结果强调了保持酶工作方式中的机制差异，并表明HSPB5具有执行其功能的多种方式。

结果

核磁共振溶液结构和15N弛豫揭示HSPB5-ACD的构象可塑性

由于ACD二聚体是sHSP低聚物的基本、稳定折叠的构建块，我们首先试图定义它们对生理相关范围内pH变化的响应。虽然已经解决了HSPB5-ACD的多种结构，但它们之间存在差异，以及获得结构的条件不同（即pH 4.6、6.0、7.5、8.5、9.0）(克拉克等人，2011年). 我们认为这种情况需要在与我们研究相关的溶液条件下确定结构。HSPB5-ACD在pH 7.5，22°C下的溶液结构(图1A、B)根据NMR数据计算，包括主链和侧链化学位移、NOE和RDC(表1). 在所有先前确定的HSPB5-ACD二聚体结构（PDB 2WJ7、3L1G、2KLR、2Y22、4M5S和4M5T）中，每个亚单位都采用六股β-三明治结构，两个ACD通过长β6+7链的反平行排列形成二聚体(图1A、B、C). 已解决的sHSP ACD结构之间的一个显著差异是，二聚体出现在两条β6+7链的不同排列中(Clark等人，2011年;Hochberg等人，2014年). 在这里报道的溶液结构中，二聚体界面将Glu117放置在Glu117'的对面(图1D). 除两个外，在所有可用的HSPB5-ACD结构中都可以观察到该寄存器，它也是其他后生动物sHSP ACD结构的主要对齐方式。

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pH 7.5下HSPB5-ACD的溶液结构系综是一种抗平行二聚体。

(A类)RosettaOligomer测定的十个ACD结构的主干痕迹在所有残基上对齐（RMSD为1.4º）。二聚体的亚单位显示为蓝色和灰色。(B类)图示为HSPB5-ACD集成中一个成员的卡通表示。使用先前定义的ACD结构命名法标记β-三明治结构的六股。二聚体是由β6+7链在界面上的反平行排列形成的。循环5/6在蓝色子单元中突出显示。(C)求解解决方案结构的ACD构造的序列显示为突出显示的二级结构元素。(D类)如图所示，β6+7链在二聚体界面处的排列使Glu-117与Glu-117'交叉。在以前的报告中，这种对齐被称为“APII”(克拉克等人，2011年). (E类)覆盖所有可用HSPB5-ACD结构的原生质体。所有成员的溶液核磁共振结构（本文；PDB2N0K）和固态核磁共振结构；Jehle等人，2010年)分别以深灰色和浅灰色显示。显示了五种晶体结构：（1）2WJ7（黄色）、（2）3L1G（橙色）、（3）4M5S（绿色）、（4）4M5 T（红色）和（5）2Y22（蓝色）。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.003

图1——源数据1。

核磁共振溶液结构和已发表结构的比较。

给出了溶液结构与已发表结构之间的主干均方根偏差（rmsd），以及实验测量的剩余偶极耦合（RDC）值与每个已发表结构的计算值（PALES相关系数）之间的相关性。括号中的值是在不包括β链之间的回路区域的情况下计算的。2KLR和溶液结构系综之间的原聚体-原聚体和二聚体-二聚体rmsd是每个系综中所有结构的所有成对组合之间的平均值。溶液结构系综和晶体结构之间的Rmsd值是系综中十个结构和晶体结构间所有成对Rmsd的平均值。2KLR：固态核磁共振结构；2WJ7：pH 9.0时的晶体结构；3L1G：pH 4.6时的晶体结构；4M5S：pH 6.0时的晶体结构。

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图1—源数据2。

十个人类sHSP的多序列比对。

使用ClustalOmega对序列进行比对。HSPB5-ACD的结构特征如下：ACD用蓝线表示；His-104由蓝色箭头标识；回路5/6显示在红色方框中；二聚体界面如绿色方框所示。所有ACD组氨酸残基均以粗体显示。

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表1。

HSPB5-ACD结构的核磁共振数据和精细化统计

内政部： 网址：http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.007

核磁共振距离和二面体约束热休克蛋白B5-ACD
距离约束
 总NOE838
  残余物内310
  Inter-residue公司
   顺序(|我−j个| = 1)255
   中等范围(|我−j个| < 4)85
   长范围(|我−j个| > 5)188
  分子间的36
 总二面角约束
  φ（TALOS）72
  ψ（TALOS）72
 剩余偶极耦合（RDC）
  1H（H）-15N个RDC81
结构统计
 违规（平均值±标准差）
 距离约束（Ω）0.48 ± 0.45
 二面角约束（°）14.4 ± 14.7
 平均成对有效值偏差（Ω）*
  沉重2.46±0.97
  骨干1.48±0.6
*计算了十个精细结构中的平均成对r.m.s.d。

在原单体水平上，HSPB5-ACD结构非常相似，尽管在不同的条件下和通过不同的技术进行了解决(图1E和图1——源数据1). 除了连接β5和β6+7的环（称为环5/6；残基His-104–Gly-112）外，两个核磁共振谱系（此处报告的溶液状态和固态PDB 2KLR）和五个晶体结构都重叠良好。回路5/6在我们的溶液集合（pH 7.5）和三种晶体结构（2WJ7[pH 9.0]、3L1G[pH 4.6]和2Y22[pH 8.6]）中向上弯曲。在“环向上”构象中，环5/6残基通过二聚体界面与其他亚单位接触。相反，在固态核磁共振系综（2KLR；pH7.5）和两种晶体结构（4M5S[pH6.0]；4M5T[pH6.5]）中，环路5/6略微向下弯曲。因此，在pH 6.5和7.5之间溶解的结构中，已经观察到两种环构象，这表明环在生理pH范围内是动态的。

为了研究HSPB5-ACD的动态过程，我们15N弛豫测量。大多数主链酰胺氮具有15北T2值介于30和40 ms之间，但环路5/6和二聚体界面中的共振具有T2<30 ms，表示它们在毫秒时间尺度内经历环境变化（未显示数据）。为了更好地探测这个时间范围，我们进行了核磁共振15溶液结构条件下的N弛豫补偿CPMG弛豫分散度测量（700μM ACD，pH 7.5，22°C）。从两个磁场强度（600和800 MHz）下收集的光谱中获得的弛豫曲线示例如所示图2A二十个共振给出了可以分析的曲线；其中，有一半的数据符合两国模型(χ红色2；减少的X平方<10；图2-源数据1). 这表明ACD二聚体正在一个主要物种（即溶液结构系综中显示的物种）和一个或多个次要物种之间交换。次要物种的性质将在下文中讨论。的值k个前任，单个共振的交换率在760秒之间−1和1119秒−1从单个共振的拟合数据中获得的值范围的差异小于两倍，这表明表现出交换的残基可能涉及相同的动力学现象。进行交换的残基沿着二聚体界面和环路5/6(图2B). 这些发现与根据ACD二聚体的晶体结构推断的二聚体界面和环5/6的表观塑性一致。对现有HSPB5-ACD结构和核磁共振弛豫数据的分析表明，（1）HSPB5原聚体结构在较宽的pH范围内保持不变，（2）存在两个塑性区域，即二聚体界面和环5/6。

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15N-CPMG弛豫分散实验检测二聚体到单体的交换。

(A类)弛豫色散测量揭示了一个两态转变。代表性松弛-弥散曲线15N横向松弛率（R2，有效)绘制为场强的函数，（νCPMG公司)如图所示（有关详细信息，请参见材料和方法）。在pH 7.5和22°C下，在800 MHz（红色）和600 MHz（黑色）的静态场强下记录数据。的值k个前任、δω和铅使用程序GUARDD提取。(B类)HSPB5-ACD二聚体的主干表示用交换残基的Cα原子表示，这些残基很好地符合以球体表示的两态模型。共振显示760 s范围内的弛豫速率−1至1119秒−1主要发生在二聚体界面和环5/6中。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.008

图2来源数据1。

在22°C和pH 7.5条件下对0.7 mM HSPB5-ACD进行的弛豫分散实验的参数。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.009

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HSPB5-ACD经历pH-依赖性二聚体解离

为了评估ACD二聚体的热力学稳定性，通过等温滴定量热法稀释测量测定二聚体-单体离解常数，其中高浓度ACD被滴定到缓冲液中。所得等温线符合简单的二聚单体平衡模型(表2). 我们在两个生理pH值（pH 7.5和pH 6.5（25°C）下进行了测量，获得了分别为2±2μM和30±16μM的离解常数。pH值为7.5时的值与在相同pH值下进行串联MS/MS测量得出的2μM值非常一致(Hochberg和Benesch，2014年). 二聚体也因温度升高而不稳定K（K）D类在pH值7.5、37°C时为36±2μM。因此，HSPB5-ACD二聚体因pH值从7.5降低到6.5或温度从25°C升高到37°C而不稳定。

表2。

ITC测定HSPB5-ACD的二聚体-单体离解常数*

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.010

温度酸碱度K（K）d日（百万分之一）ΔH（卡/摩尔）
25摄氏度7.50.002 ± 0.0028772 ± 3960
25摄氏度6.50.030 ± 0.0163242 ± 432
37摄氏度7.50.036 ± 0.0029328 ± 527
*有关实验细节和数据分析，请参见“方法和材料”。

1H、，15在pH 7.5和6.5下收集的HSPB5-ACD的N-HSQC光谱显示出广泛的变化(图3A). 此外，在pH7.0和pH6.0之间收集的光谱具有显著的峰倍增现象，该现象主要在pH6.0下解决，因此，仅根据pH7.5下的现有共振分配来分析pH引起的光谱变化(Jehle等人，2009年)具有挑战性。因此，我们使用在pH 6.5和pH 6.0下收集的标准三重共振光谱将HSPB5-ACD光谱指定为pH 6.5，以便我们可以通过pH滴定系列跟踪各个共振。扩展的区域1H、，15N-HSQC pH系列如所示图3B在没有另一个依赖pH的过程的情况下，作为pH的函数，由经历质子化/脱质子化事件的残基引起的共振将以连续的方式转移。与滴定残留物接近的残留物的共振也显示出类似的行为。由于酸性质子的快速开/关速率，这种过程将出现在所谓的“快速交换”核磁共振体系中。在pH值高于6.7时，HSPB5-ACD光谱中的一些共振表现出快速的交换pH行为，与可电离基团的质子化/去质子化一致。在pH 6.7及以上收集的光谱中，His-119的共振说明了这一行为(图3B). 当pH值<6.7时，一些共振加倍并出现在新的位置（例如，标记为87、119和135的共振图3B). 这种行为是中慢速交换的例证，表明存在两种在核磁共振时间尺度上缓慢相互转换的状态。峰的相对强度反映了这两种状态的相对数量，因此随着pH值的降低，HSPB5-ACD的一个新物种越来越多。

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HSPB5-ACD在pH值7.5到6.5之间发生构象转换。

(A类)1H（H）-15在pH 7.5和6.5（22°C）的200µM HSPB5-ACD样品上获得的N HSQC光谱显示了两种状态。覆盖在pH 7.5（黑色）和6.5（红色）下收集的全光谱（左侧）。在pH值7.5时，观察到82/85个非脯氨酸残留（由于与H快速交换，未检测到残留G64、L65和S1392O） ●●●●。在pH 6.5时，出现约～65个附加峰，表明存在两种构象。右边的方框区域提供了峰值倍增的清晰示例。一些共振（标记在左侧面板中）在pH值为7.5时从其原始位置消失，在pH值6.5时无法通过光谱检查确定其新位置。(B类)完整pH滴定系列的示例（在pH 8.4[蓝色]、7.5[黑色]、7.0[青色]、6.7[绿色]和6.5[红色]下收集的光谱）。H119的共振行为作为pH的函数说明了两个依赖于pH的过程（见正文）。其化学变化从pH值8.4快速变化到7.5（实心箭头），并改变方向，从pH值7.0缓慢变化到6.5（虚线箭头）。所示区域包含在相同pH范围内经历缓慢交换转变的其他几种共振。(C)经过缓慢交换转变的残基在ACD二聚体的表面上以彩色突出显示。扰动>0.2 ppm的残留物为红色；扰动在0.1-0.2ppm之间的为橙色。(D类)弛豫色散数据分析得出15N主要物种和次要物种之间的化学位移（ΔδN计算). ΔδN的值计算（蓝色）与从15pH值7.5和6.5时的N化学位移，即ΔδN(7.5−6.5)（红色），在直方图中。这两个参数之间的一致性支持了这样一种观点，即弛豫分散实验检测到的次要形式是在较低pH下填充的ACD的单体形式。

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pH值为7.5和6.5时的光谱分配允许识别受pH依赖性转变影响最大的残留物。“高”pH值形式（pH 7.5）和“低”pH值类型（pH 6.5）之间的化学位移差Δδ（pH7.5–pH值6.5)对每个NH共振进行了计算（参见“材料和方法”）。在滴定过程中表现出较大化学位移扰动（>0.2 ppm）和/或变化轨迹的共振主要来自两个结构区域（图3C)：二聚体界面（残基F113–I124）和环5/6。根据pH依赖性K（K）D类通过ITC获得的值，二聚体到单体的离解可能是核磁共振波谱中观察到的pH值低于7的缓慢交换过程的来源。

上述发现增加了在pH 7.5下通过松弛分散检测到的次要物种是ACD单体的可能性。除了汇率外，次要物种的部分种群(铅= 1 −帕)，并且可以从弛豫弥散数据分析中提取给定共振（δω）下主组分和次组分之间的化学位移差(克莱克纳和福斯特，2011年). 七个共振提供了对次要物种分数种群的估计，铅，作为～5%，与根据K（K）D类由ITC测量。我们比较了15N化学位移（δω）与实验测定的pH 7.5和pH 6.5下ACD之间化学位移的差值ΔδN（pH7.5-pH值6.5). 如中所示图3D二聚体界面残基的对应关系非常密切，支持以下观点：在pH值7.5时通过松弛分散检测到的次要物种与pH值低于7时填充的单体形式相同。

最后，我们在37°C（pH 7.5）下进行了弛豫分散测量，以确定生理温度下的结合/解离速率。对于二聚体到单体的转变，测量的交换率将取决于浓度：

k个e（电子）x个= k个米d日[单体]+k个d日米, 

哪里k个医学博士是单体-二聚体缔合的速率常数k个糖尿病是二聚体解离的常数。我们收集了两种蛋白质浓度（700和200µM；pH 7.5，37°C）下的松弛分散数据。二聚体界面残余物弛豫分散数据的全局拟合给出k个前任～1500 s的值−1和460秒−1分别为700和200µM HSPB5-ACD。浓度依赖性证实了观察到的交换是由二聚体离解/缔合引起的。基于K（K）D类(=k个糖尿病/k个医学博士)在36μM的ACD亚基中，700μM ACD单体的浓度为～100μM。这给出了k个医学博士= 1.1 × 107M（M）−1秒−1（在扩散控制的双分子缔合范围内；Northrup和Erickson，1992年)和k个糖尿病=400秒−1因此，几个核磁共振参数加上ITC测量提供了一幅长二聚体界面以400 s的速度解离的图片−1在pH 7.5、37°C下，并且随着pH降低到7以下而不稳定。在相同条件下，低聚物中全长HSPB5亚基的交换速度慢得多，为10−3秒−1(Peschek等人，2013年). 因此，亚单位离开低聚物的速率并不是由ACD二聚体的破坏决定的，结果表明低聚物内的二聚体界面可能在亚单位在HSPB5低聚物中的停留期间多次断裂和重组。

保守的组氨酸负责HSPB5-ACD二聚体的失稳

ACD二聚体的排列形成了正负电荷表面的斑块，穿过结构两面的二聚体界面(图4A). 在pH 7.5和22°C下，二聚体更稳定，静电力可能处于平衡状态，但类似电荷的高密度表明稳定性较弱。二聚体界面处或附近的质子化事件或其他重排可能会打破平衡并触发二聚体解离。HSPB5-ACD具有较高的组氨酸含量，在89个总残基中有5个His残基（5.6%，是所有蛋白质组平均His频率的两倍以上）。在二聚体结构中，十个组氨酸残基中的八个（每个原聚体中五个）成对定位（两个His-83/His-104对和两个His-101/His-119对），并集中在二聚物的中心(图4B). 总的来说，组织和表面静电表明组氨酸残基在触发依赖pH的二聚体解离中可能起作用。

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His-104在二聚体-单体转变中起着关键作用。

(A类)HSPB5-ACD在pH 7.5时的静电表面（使用实验测定的组氨酸pK计算R（右）值）显示穿过二聚体界面的正（蓝色）和负（红色）电荷斑块。(B类)HSPB5-ACD的五种组氨酸（蓝色和青色条）成对出现，位于二聚体界面附近。(C)核磁共振观察到，His-104突变改变了二聚体平衡。的覆盖层1H（H）-15H104K-ACD（左侧面板）和WT-ACD（右侧面板）显示了pH 7.5（黑色）和pH 6.5（红色）下的N HSQC光谱。在pH值为7.5时，在WT-ACD中观察到一组峰，并且随着pH值的降低，由于单体构象而出现的峰出现。属于二聚体界面的峰，例如R120和R116，在pH 6.5和H104K-ACD两种pH条件下从其原始位置消失（虚线圆圈）。(D类,E类)的扩展区域1H（H）-15WT-、H104K-和H104Q-ACD的N HSQC光谱。WT-和H104K-ACD使用与面板中相同的配色方案C；H104Q-ACD覆盖层为蓝色（pH 7.5）和红色（pH 6.5）。(D类)H104K-ACD（左侧面板）和WT-ACD（右侧面板）的比较。虚线连接H104K-ACD和WT-ACD中类似位置的共振。该示例表明，残基87、95、119和136的峰在H104K-ACD（在两个pH值下）中的位置与WT-ACD在pH 6.5下的位置相似。(E类)H104K-ACD（左上图）、WT-ACD（右上图）和H104Q-ACD（下图）的光谱相同区域的比较。在两个pH值下，在H104Q-ACD光谱中观察到两种形式（二聚体和单体），而在两个pH值下，在H104K-ACD中仅观察到对应于单体的峰。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.012

图4——源数据1。

pKR（右）列出了HSPB5-ACD组氨酸侧链咪唑环（22℃）的值和互变异构状态。

n.d.：未确定，因为共振在pH值7.5以下变宽，无法检测到。

内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.07304.013

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图4——图补充1。

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His-104是带电和氢键相互作用动态网络的中心。

顶部面板：显示了解决方案集合的十个单独成员。二聚体的一个原聚体呈青色；另一个原体是灰色的。His-104显示为填充空间的球体；与His-104接近的羰基以棒状表示示出；靠近His-104的侧链以棒状图表示；环5/6和二聚体界面中的侧链，如图所示；底部面板：显示了环向上（以青色显示；本出版物PDB 2N0K）和环向下构象（以紫色显示；来自2KLR）的示例，以说明两种构象中潜在相互作用伙伴的重排。如上所述，二聚体中的第二亚单位以灰色显示。

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为了识别候选组氨酸，pK（K）R（右）根据咪唑环核（Nδ1、Nε2、Hδ2和Hε1）的NMR化学位移，确定了这些值和互变异构态，并将其作为pH值的函数进行了测量K（K）R（右）五个His残基中的四个残基的值为：His-101和His-111的低值<6，His-83和His-119的值分别为6.6和7.7(图4——源数据1). A点K（K）R（右）无法确定His-104，因为其侧链共振在pH值低于7.5时变宽并消失。虽然His-104没有定位在二聚体界面上，但其主链NH共振的行为与二聚体与单体之间发生交换的二聚体表面上的主键NH共振类似，表明它由于二聚体到单体的转变而经历了环境变化。在pH值为7.5且可检测到咪唑共振的情况下，His-104作为不太常见的Nδ1H互变异构体存在，而其他四个His残基位于更常见的Nε2H互变构体中。在12.4 ppm的化学位移下观察到His-104的Nδ1H发生共振，表明其为氢键。在溶液系的成员中，有几个潜在的氢键伙伴靠近His-104：His-83、Glu-105和Glu-106的主链羰基，以及Arg-107和Arg-116的侧链基团(图4-图补充1). 总之，数据表明His-104在pH 7.5的ACD二聚体中具有特定构象，并通过氢键稳定。

His-104共振对二聚体到单体转变的敏感性表明它是pH触发的主要候选物。用Gln或Lys替换His-104，并将突变ACD与WT-HSPB5-ACD进行比较。如上所述(图3A、B)在pH值低于7时，在WT ACD的光谱中观察到双峰现象，与ACD单体相对应的新峰出现在pH值较低时。这个1H（H）-15H104Q-ACD的N HSQC光谱即使在pH值为7.5时也有双峰，这两组峰对应于WT光谱中已经指定的二聚体和单体峰(图4E，下部面板）。H104K-ACD-HSQC光谱在两种pH条件下都有一组单一的共振，但即使在pH 7.5下，这些峰也与单体相对应(图4C–E). 因此，用谷氨酰胺取代His-104会破坏二聚体的稳定性，从而在pH 7.5和NMR浓度下观察到近似相等的群体。104位的谷氨酰胺很难模仿His-104形成的Nδ1H键。用带正电的赖氨酸取代His-104可产生主要是单体的ACD，pH值为7.5。我们没有确定K（K）D类通过稀释ITC实验得出的突变值，因为起始ACD浓度必须是K的十倍以上D类根据核磁共振波谱中二聚体和单体峰的相对布居，我们可以估计K（K）D类对于H104Q-ACD为～100–500μM（在[ACD]=200μM时，二聚体和单体的数量大致相等），KD类H104K-ACD大于1 mM（基于我们无法检测含有200μM蛋白质的样品中的二聚体共振）。虽然只有数量级，但这些估计表明，用Gln或Lys取代His-104会使二聚体失稳100倍以上。为了确定突变His-104的效果是否特异，其他四个His残基分别突变为Gln。突变ACD保留了WT-ACD的pH依赖性光谱行为（数据未显示）。总之，数据表明His-104位于环路5/6的底部(图4B)作为一个热点，其构象、氢键能力和质子化状态强烈影响HSPB5-ACD二聚体界面的稳定性。

不稳定的二聚体界面触发HSPB5低聚物的大膨胀

为了揭示HSPB5低聚物结构中二聚体界面稳定性的后果，我们比较了全长H104Q-和H104K-HSPB5与WT-HSPB5的特性。尺寸排除色谱结合多角度光散射（SEC-MALS）提供了有关低聚物尺寸和多分散性的信息，并且允许使用负染电子显微镜（EM）观察单个低聚物颗粒(图5). WT-HSPB5低聚物的SEC-MALS数据证实了先前报道的低聚物尺寸的pH-依赖性变化(Jehle等人，2011年;Baldwin等人，2011年a). pH值为7.5时，分子量（Mw个)在440 kDa至500 kDa的洗脱峰之间测定。平均Mw个465kDa对应于～24个亚单位的质量，与以前的报告一致(Aquilina等人，2003年;Peschek等人，2009年). pH 6.5时，WT-HSPB5低聚物洗脱较早，平均Mw个720 kDa，相当于每个低聚物约36个亚基，每个低聚体平均增加12个亚基(图5A). 在pH 7.5和6.5条件下收集的WT-HSPB5低聚物的阴性EM显微照片和单粒子图像显示了两种pH下的大球状结构(图5——图补充1A). 在二维投影平均值（由单粒子数据集的无参考比对生成）中，WT-HSPB5低聚物通常是球形的，并且具有不同的直径，在pH 6.5时平均大于pH 7.5时的直径(图5B,图5——补充图1B). 因此，SEC-MALS和EM测量结果显示，随着pH值的降低，WT-HSPB5低聚物中的流体动力学半径、粒子尺寸和亚基数量发生了膨胀。

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通过低pH值或His-104突变使ACD二聚体界面失稳，触发HSPB5低聚物的大规模扩增。

(A类)SEC-MALS分析显示蛋白质洗脱剖面（折射率，右Y轴），平均Mw个pH 7.5（蓝色）和pH 6.5（绿色）下的WT-HSPB5和pH 7.5下的H104Q-HPSB5（橙色）和H104K-HSPB5（红色）的（峰值下的水平轨迹对应于左Y轴）。(B类)二维投影类平均值显示了低聚物尺寸的典型集合。(C)SEC-MALS分析显示分别以1:0（绿色）、2:1（浅绿色）、1:1（黄色）、1:2（橙色）和0:1（暗红色）的比例一起孵育的WT和H104K-HSPB5的混合低聚物的洗脱谱和平均Mw。(D类)低聚物直径直方图，显示在pH 7.5（蓝色）和pH 6.5（绿色）下的WT和在pH 7.5下的H104K的低聚物颗粒分数与平均直径（nm）的关系，通过阴性染色EM 2D分类测定。显示了与测量直径相对应的典型2D类平均值。实验一式三份。比例尺（左下方图像）等于10 nm。

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图5——图补充1。

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WT和H104K HSPB5的EM显微照片图像、2D分类和粒径估计。

(A类)pH为7.5和6.5的WT-HSPB5和pH为7.5的H104K-HSPB5的代表性显微图像用0.75%甲酸铀酰负染（比例尺等于20 nm）。单个粒子投影示例如下所示，比例尺等于10 nm。（B）根据5321、5713和5145个单粒子的数据集，WT-HSPB5 pH 7.5、WT-HSPB pH 6.5和H104K-HSPB5 pH 7.5的二维无参考类别平均值。比例尺等于10 nm。（C）HSPB5低聚物的类别平均值、相应的旋转平均值和估计直径（nm）示例。

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为了询问pH值下观察到的低聚物尺寸变化是否是二聚体界面失稳的结果，在pH值为7.5时用SEC-MALS和EM分析His-104突变体。H104K-HSPB5形成非常大的多分散低聚物，范围从785 kDa到840 kDa(图5A)，平均成绩为Mw个810 kDa（～41亚单位）。H104Q-HSPB5低聚物在相对于WT-和H104K-HSPB5的中间位置洗脱。因此，当低聚物由不稳定的二聚体组装时，会招募更多的亚单位。我们认为，由H104K-HSPB5组成的低聚物主要由单体单元构成，而由H104Q-HSPB5组成的齐聚物同时包含二聚体和单体单元。如果这个模型是准确的，我们应该能够通过将含有WT和H104K的亚基混合在一起来重述含有中间尺寸H104Q的低聚物。如所示图5C，WT-HSPB5和H104K-HSPB5滴定液混合物中的洗脱位置和低聚物质量是添加的H104K-HSPB5亚基的函数，符合低聚物由二聚体和单体单元形成的模型。pH 6.5下的WT-HSPB5低聚物的质量范围对应于WT:H104K亚基的1:2比率，这表明pH依赖的低聚物组合可能来自单体亚基和二聚体亚基的组合。

上述结果表明，H104K-HSPB5低聚物代表了低聚物组成连续体的终点，H104Q-和（pH 6.5）WT-HSPB5反映了在不同条件下受欢迎的物种，包括应激性酸中毒。为了询问由单一或部分单体单元组成的低聚物是否具有独特的结构特征，收集并分析了H104K-HSPB5在pH 7.5和WT-HSPB5在pH 6.5下的负染EM图像。在大多数图像中，明确的特征（识别为密度的亮区和暗区）在结构中很明显，表明亚单位的有序排列。颗粒一般为球形，也观察到一些长圆形结构。通过测量每个2D投影平均值生成的圆形平均值的直径，可以获得有关低聚物大小和分布的定量信息(图5——补充图1C). 然后根据相应平均值的直径对单个颗粒进行装箱，以生成分布(图5D). 以这种方式得出的粒径分布与SEC-MALS分析一致：pH值为7.5时，WT-HSPB5的平均直径最小，为15 nm（范围为13–17 nm），H104K-HSPB5的平均尺寸最大，为17 nm，pH值为6.5时，WT-HSPB5为中等，为16 nm。pH 6.5下WT-HSPB5的低聚物覆盖了整个测量直径范围，介于14到>18 nm之间，而H104K-HSPB5的分布偏向于最大尺寸，大多数粒子（>70%）大于16 nm。为了进行比较，WT-HSPB5低温-EM模型的直径(Braun等人，2011年)根据圆形平均值同样确定，测量值为15nm，与我们的测量值吻合良好。总之，结果表明，影响反平行二聚体界面稳定性的条件和/或突变对HSPB5低聚物的大小和结构有显著影响。

具有不稳定二聚体界面的低聚物是有效的保持酶，可以重组以结合客户蛋白

为了确定上述扩张的低聚物结构的功能和机械后果，进行了标准保持酶分析，在没有和存在sHSP的情况下，将模型客户蛋白的聚集作为时间的函数进行监测。在pH值为7.5时，H104Q-和H104K-HSPB5比WT-HSPB5更有效地延迟两个模型客户的大聚集体形成，添加DTT使α乳清蛋白（αLac）不稳定，以及添加DTT和EDTA使乙醇脱氢酶（ADH）不稳定(图6). 结果表明，保持酶活性的增强与二聚体界面的失稳有关。

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HSPB5的His-104突变体可有效延缓模型客户蛋白聚集的开始。

（顶面板）在没有（绿色）和存在WT-HSPB5（蓝色）或HSPB5突变体H104K（红色）和H104Q（橙色）的情况下，42°C下DTT变性牛α乳清蛋白的聚集。在存在和不存在HSPB5（40µM）的情况下，使用360 nm的光散射来监测DTT诱导的α-Lac（600µM）的聚集。检测重复进行，并显示平均散射曲线。（底部面板）在存在EDTA和DTT的情况下，在37°C下，在没有（绿色）和存在WT-HSPB5（蓝色）或HSPB5突变体H104K（红色）和H104Q（橙色）的情况下酵母乙醇脱氢酶的聚集。在HSPB5（20µM）存在和不存在的情况下，使用360 nm光的光散射来监测ADH（100μM）聚集。检测重复进行，并显示平均散射曲线。

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为了了解二聚体界面的失稳如何产生更有效的保持酶，我们比较了HSPB5和突变体如何与客户相互作用。我们利用野生型和突变型HSPB5物种提供的α-Lac聚集的长延迟，试图检测sHSP-客户端相互作用。添加DTT后和聚集开始前，用SEC-MALS分析αLac和一种HSPB5的混合物(图7). 虽然在实验期间，WT-HSPB5将αLac保持为可溶性形式，但SEC或SDS-PAGE未检测到这两种蛋白之间的相互作用，表明其保持酶功能是通过高度瞬时的相互作用实现的(图7A). 相反，αLac和H104K-HSPB5的混合物洗脱时具有显著不同的轮廓。洗脱液在7.5和9.2 ml之间的宽峰的SDS-PAGE分析表明，它含有这两种蛋白质(图7B). 该峰的分子量范围很广，从>550 kDa到～250 kDa。αLac和H104Q-HSPB5混合物的洗脱曲线发生了类似但不太显著的变化(图7C). 因此，αLac和H104突变HSPB5s之间形成了长寿命复合物，并且这些复合物明显小于在缺乏客户蛋白的情况下填充的低聚物。

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在αLac模型客户蛋白存在下，H104K-和H104Q-HSPB5低聚物重组为小而长寿命的客户结合复合物。

(A–C)SEC-MALS分析和相应的Mw个WT的(A类)，H104K(B类)和H104Q(C)HSPB5低聚物（亚基浓度为40μM）与αLac（120μM）在无（蓝色）和有（红色）50 mM DTT的情况下孵育，以破坏αLac的稳定性。显示了用DTT（红色痕迹）对相应HSPB5-αLac孵育的峰值部分进行SDS-PAGE分析（插图）。虚线对应于8 ml的WT洗脱和7.4 ml的H104K洗脱(D类)H104K-和H104Q-HSPB5-αLac峰分数的2D投影类平均值对应于B类和C以WT、H104K-和H104Q-HSPB5的代表性平均值显示，在没有αLac底物的培养下进行比较。比例尺（左下面板）等于10 nm。

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图7——图补充1。

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αLac孵育HSPB5的电镜图像和2D分类。

(A类)在SEC-MALS分馏之前，WT-HSPB5和H104K-HSPB5的代表性显微图像和单个颗粒在有或无αLac底物和DTT的培养下培养，显示低聚物尺寸的变化仅发生在H104K-HSPB5和α-Lac上。对于显微照片和单个粒子，比例尺分别等于20 nm和10 nm。（B）SEC-MALS分离后峰1和峰II中分离的H104K-HSPB5-αLac的完整2D投影类平均值。图中显示了分数I中11727个粒子和分数II中9257个粒子的类别平均值，标尺等于10 nm。

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对在含有H104K-HSPB5（或H104Q-HSPB5）和α-Lac的峰上收集的组分进行阴性染色EM(图7D). 在显微照片和单粒子图像中，颗粒看起来完好无损，未结合蛋白的背景很少，这表明突变的HSPB5/αLac复合物在EM稀释后保持稳定(图7-补充图1). 这些颗粒要小得多，并且在结构上与WT-、H104Q-或H104K-HSPB5中观察到的球形低聚物不同。收集了分馏H104K-HSPB5/αLac复合物的大型单粒子数据集，并如上所述确定2D投影平均值。2D平均值(图7D)显示出清晰的结构特征，并揭示突变的sHSP在与模型客户蛋白结合时发生了重大结构重组。在2D平均值中，观察到一些类似于WT-HSPB5的较小球形低聚物，但不再检测到仅在H104K-HSPB5中占主导地位的超大（>16 nm）低聚物。其大小变化很大，可能取决于络合物的取向、化学计量和/或低聚物状态。

为了观察是否与WT-HSPB5形成类似的HSPB5/α-Lac复合物，但不能在SEC-MALS实验中存活，用阴性染色EM分析了未分离的WT-HSPB 5和α-Lac混合物样品（数据未显示）。未检测到较小的物种，WT-HSPB5的球形低聚物保持不变。总的来说，结果表明，具有不稳定二聚体界面的HSPB5低聚物分解并经历剧烈重组，与模型客户蛋白形成稳定的复合物，而pH值为7.5的野生型蛋白则不这样做，并通过与客户的高度瞬态相互作用发挥其保持酶功能。

讨论

尽管它们在维持应激条件下和应激后细胞蛋白的溶解度方面发挥着关键作用，但sHSP结构和功能的决定因素仍不明确。诸如缺血和缺氧等应激与酸中毒有关，在酸中毒中，细胞pH值可降至pH值6.4(McVicar等人，2014年). 由于HSPB5必须在应激条件下发挥作用，我们试图研究pH值对其结构和功能的影响。sHSPs有三个结构区，每个结构区在低聚物组装中起作用。高度保守的ACD对于二聚体的形成是必要的，并且足够的，二聚体被认为是低聚物的基本构建块。N端和C端区域似乎驱动低聚物组装，尽管这些相互作用的细节尚未阐明。我们发现HSPB5-ACD二聚体分解成折叠单体，随着pH值的降低，折叠单体受到青睐。ITC和NMR测量显示ACD二聚体具有适度的亲和力(K（K）D类36μM，pH 7.5，37°C），二聚体以400 s的速度解离−1两个亚单位的长β6+7链以反平行方式排列，形成二聚体界面。这种结构及其相关的氢键可能会提供更高的亲和力。Glu-117和Glu-117'在界面中部的并列以及穿过界面的正负电荷斑块可能有助于适度的亲和力以及我们在界面中观察到的动力学和可塑性。二聚体亲和力比1个pH单位（pH 7.5至pH 6.5）降低了15倍，这可能对应于二聚体界面解离速率的类似增加。HSPB5-ACD二聚体界面的pH依赖性失稳是从低聚物的自然MS研究中推断出来的，它是pH的函数；我们的结果直接证实并量化了这一假设(Baldwin等人，2011年b).

我们鉴定了一个组氨酸残基，它在ACD二聚体界面稳定性中起着关键作用。用Gln或Lys取代His-104显著降低了二聚体的稳定性。核磁共振谱显示，His-104环是两种可能的互变异构形式中较为罕见的，通过作为氢键供体而稳定。对溶液结构系综成员和环5/6向上构象的晶体结构进行分析，确定几个主链羰基是His-104的潜在氢键受体：His-83、Glu-105和Glu-106。氢键电势或几何形状的改变（如H104Q突变）或电荷的改变（例如H104K突变和低pH值）会破坏二聚体的稳定性。在十种人类sHSPs中，His-104是最保守的His残基，出现在十种蛋白质中的八种，非H104的sHSPsGln（HSPB9）或Lys（HSPB7）(图1—源数据2). 与His-104的保守作用一致，HSPB1（His-124）和HSPB6（His-103）中的类似组氨酸也观察到His-104在HSPB5中采用的异常互变状态（Rajagopal和Klevit，未发表的观察结果）。

His-104在二聚体稳定性中的作用的鉴定是出乎意料的，因为尽管二聚体界面上有组氨酸，但His-104不是组氨酸。His-104位于环5/6的起点，环连接链β5和二聚体界面链β6+7(图4B). ACD二聚体的核磁共振弛豫分散分析表明，二聚体界面（116–123）中的残基以两种状态存在，符合二聚体-单体平衡(图2B). 循环5/6中的残留物具有相似的汇率，表明循环运动和结构转型可能是耦合的。然而，要严格证明这两个区域的动力学是耦合的，就需要确定k个前任作为环剩余物和界面剩余物[ACD]函数的值以及收集的数据不允许以足够高的置信度进行此测定。然而，与这个概念一致，观察到亚单位间接触涉及环5/6残基：环5/6顶点的His-111通过二聚体界面与Arg-120'和Tyr-122'接触。这些亚单元间的接触有助于在pH值为7.5的溶液结构中以“环向上”构象定位环5/6(图1E,图4-图补充1). 回路5/6中的大多数残留物被充电（H104-E-E-R-Q-D-E-H111)因此，位于环底部的His-104质子化可能会改变环5/6的构象或位置，破坏涉及环的亚单位间接触，并改变HSPB5-ACD的二聚体-单体平衡。在具有“环向上”构象的结构中，Arg-107和Arg-116的侧链靠近His-104；“向下循环”构象使Arg-107远离His-104，Glu-106靠近His-104(图4-图补充1). 总之，我们认为在两个环中，His-104构象位于静电和氢键相互作用的动态网络的中心，该网络负责调节二聚体界面的稳定性。

对所有17种哺乳动物sHSP-ACD结构（9个HSPB5[WT和突变体]、3个HSPB1和3个HSPB6）的调查表明，环5/6存在于两种构象中；HSPB5-ACD溶液结构中的“环向上”构象和“环向下”构象。在“环向上”结构中，穿过二聚体界面的环5/6残基之间的相互作用细节有所不同，再次表明了该区域的可塑性。然而，与His-111、Asp-109和Arg-120相对应的残基在所有情况下都涉及。此外，尽管环5/6主要含有极性和/或带电残基，但它在人类sHSP中非常保守(图1—源数据2). 有几个报告的例子表明，环5/6残基影响二聚体平衡。在HSPB5中，残基His-104、Asp-109和His-111最近与Cu有关2+和锌2+二价阳离子的结合和结合似乎使二聚体界面不稳定(美因茨等人，2012年). 在HSPB1中，与HSPB5的Loop 5/6序列几乎相同，将对应于HSPB5 Glu-105和Glu-106的两个谷氨酸残基替换为Ala导致单体HSPB1-ACD(Baranova等人，2011年). 此外，据报道，HSPB1、R127W（对应于HSPB5编号中的Arg107）中的Loop 5/6突变促进单体超过二聚体(Almeida-Souza等人，2010年). 在每种情况下，环5/6的净电荷变化都会导致单体更受青睐。总之，观察结果表明，环5/6的性质与二聚体界面的稳定性相耦合。值得注意的是，D109H-HSPB5或R127W-HSPB1的单一等位基因的遗传与白内障、肌原纤维肌病和远端遗传性运动神经病有关(Nefedova等人，2013年). 这两种突变都改变了环路5/6的净电荷，这意味着环路5/6在sHSP功能中的结构和/或动态特性具有关键作用。

进入全长HSPB5的背景，我们发现降低pH值或替代His-104对低聚物尺寸和亚单位化学计量有显著影响。观察到低聚物尺寸的连续性，其趋势与ACD二聚体界面稳定性呈反比。H104K-HSPB5的ACD主要是单体，它组装成最大的低聚物，包含40多个亚基。虽然二聚体是sHSP低聚物的基本构建块的概念可以描述特定条件下的情况，但我们的结果表明，低聚物也可以由单体亚基以及二聚体和单体单元的组合构建，并且可以将更多单体亚单位并入给定的低聚物中。这一发现对于未来确定HSPB5低聚物结构的任何尝试都具有重要意义，该低聚物的尺寸大于先前确定的24个低聚物(Braun等人，2011年;Jehle等人，2011年).

His-104突变体使我们能够询问二聚体界面是否以及如何有助于保持酶功能，而不会出现比较不同pH值下模型变性客户蛋白聚集的混淆并发症。两种二聚体确定突变均产生HSPB5，与pH值为7.5的野生型蛋白相比，HSPB5可以延迟模型客户的聚集时间更长。出乎意料的是，His-104突变蛋白形成了比WT-HSPB5大得多的寡聚体，重组后与客户蛋白形成长寿命复合物。EM图像显示，粒子明显较小，与大多数球形的sHSP孤立结构截然不同。在WT-HSPB5抑制客户蛋白聚集的时间段内，我们无法通过SEC或EM检测到客户的复合物。因此，突变的sHSPB5物种通过与pH 7.5下的野生型蛋白质不同的机制来执行保持酶功能。WT-HSPB5通过弱和瞬时的相互作用发挥作用，而突变体通过强和长的相互作用起作用。值得注意的是，与Charcot-Marie-Tooth综合征相关的HSPB1中的两个遗传错义突变，即R127W-HPSB1（在环5/6中）和S135F-HSPB1（在二聚体界面上），与客户蛋白的相互作用比WT-HSPB1更强，寿命更长，如串联亲和纯化所证明的那样(Almeida-Souza等人，2010年). 在高度相关的HSPB4（αA-crystallin）的研究中观察到两种客户结合模式，根据不同客户被称为“高容量”和“低容量”：sHSP化学计量学(McHaourab等人，2002年). 未来的研究仍需确定这些是否反映了此处观察和报告的物种。

在pH 7.5条件下对WT-HSPB5低聚物进行的固体核磁共振研究揭示了三种类型的亚单元间相互作用：（1）ACD-到ACD（即二聚体界面），（2）C-末端区域-到ACD，以及（3）N-末端区域到ACD或其他N-末端区域(Jehle等人，2011年). 当前研究的结果表明，这些相互作用的相对强度和丰度不仅会影响低聚物的大小和结构，还会影响客户蛋白的识别方式。WT-HSPB5中的亚单位交换比我们测量的二聚体到单体转变的交换速率慢几个数量级（10−3秒−1vs约10三秒−1分别在pH 7.5、37°C下；Peschek等人，2013年). 因此，虽然破坏二聚体界面并不是亚单位交换中的速率限制步骤，但破坏ACD二聚体的稳定性会产生寡聚体，寡聚物可以更容易地分解，与客户形成更小的物种，并且这些复合物必须比突变的sHSP寡聚体内更稳定。SEC已检测到豌豆中Hsp18.1的长寿命sHSP-客户端复合物，但在没有客户端的情况下，形成的复合物大于Hsp18(Lee等人，1997年;Stengel等人，2010年). 酵母中的Hsp26也与客户形成比不存在时更大的复合物(Franzmann等人，2005年). 这些例子与我们的研究结果形成了对比，这意味着HSPB5已经进化为通过弱和瞬态交互来执行其保持功能，并且小的扰动可以释放第二种隐秘的客户交互模式（长和长）。高电荷ACD二聚体界面和近端环5/6对静电环境中的微小变化具有极高的敏感性，这些变化可能受到pH值、温度、二价阳离子、其他细胞条件和突变的轻微变化的影响。在人类sHSPs ACD区域记录的大约20个遗传性疾病相关错义突变中，一半以上位于二聚体界面或环5/6的残基中，所有这些都涉及带电残基的替换。

我们最初的目的是确定HSPB5在与应激性酸中毒相关的pH条件下如何发挥作用。我们的结果明确表明，二聚体界面稳定性在生理相关的pH范围内降低，单个组氨酸残基的突变（或质子化）足以使二聚体不稳定。His-104突变体提供了一些关于sHSPs结构和功能调节的一般见解。首先，ACD二聚体界面相对于低聚物形成中涉及的其他相互作用的稳定性可以调节保持酶功能。在我们的研究中，二聚体界面的失稳导致保持酶活性增强。相反的情况是否属实还有待观察。第二，二聚体的稳定性可以由二聚体界面本身以外的残基来调节。这种效应可能是通过保守的带电残基网络实现的，这些残基最终有利于或不利于二聚体而非单体。第三，pH值相对较小的变化或单一错义突变能够将HSPB5从一种弱的、短暂的客户交互模式转移到一种涉及长期共存复合物的模式。我们提出，我们在不同pH（或突变）下观察到的HSPB5的低聚物结构的连续性可能导致客户端结合模式的连续性，从而使sHSP能够根据条件的需要提高或降低其保持酶活性。彻底了解sHSP结构和活性在不同细胞条件下的调节方式，最终将为深入了解这类重要但以前难以解决的蛋白质伴侣的细胞功能提供非常必要的见解。

材料和方法

蛋白质纯化和克隆

如前所述，表达并纯化HSPB5和HSPB5-ACD（残基64-152）(Jehle等人，2009年). 使用Sigma的Quik-Change突变试剂盒进行定点突变。突变蛋白的生长和纯化程序与野生型蛋白相似。

溶液态核磁共振法测定WT-ACD的结构

WT-ACD核磁共振波谱中的共振先前已指定(Jehle等人，2009年). 要从NOES获得距离约束，15N编辑NOESY和13在1 mM上获得脂肪和芳香基团的C编辑NOESY光谱，13C、，15NMR缓冲液中的N-WT-ACD样品（50 mM磷酸钠、pH 7.5100 mM氯化钠、0.1 mM EDTA和1 mM PMSF）。光谱是在配备Avance III控制台和z梯度三共振低温探头的Bruker 950 MHz US2（超屏蔽、超稳定）光谱仪上获得的（北卡罗来纳州坎纳波利斯的David H Murdock研究所）。15N编辑NOESY和13C编辑的光谱是在90%H中以120 ms的混合时间获得的2O/10%天222°C和100%D条件下的O溶液2分别在37°C下的O溶液。使用NMRPipe处理数据(Delaglio等人，1995年)并用NMRViewJ进行分析(约翰逊，2004)和CcpNmr(Vranken等人，2005年). 将NOE分为短约束（3°）、中约束（4°）和长约束（5°），并将其作为距离约束输入RosettaOligomer(Sgorakis等人，2011年). 同二聚体蛋白质中的分子间NOE通常是从含有标记和未标记蛋白质的混合样品的编辑/过滤型NOESY实验中获得的。由于信噪比问题，此方法在WT-ACD的情况下失败。用CS Rosetta测定了二聚体的初步结构(Vernon等人，2013年)和RosettaDock(Schueler-Furman等人，2005年)（见下文）。使用主链化学位移从CS-Rosetta测定β-三明治折叠。RosettaDock给出了APIII寄存器中二聚体的模型（每个亚单位的残基R116相互交叉）。使用这个初步模型，分子内和分子间NOE可以从15N编辑和13C编辑的NOESY光谱。观察到的Hα-HαNOE13C编辑的NOESY光谱明确确认APII寄存器为二聚体界面（Glu-117-Glu-117′相互交叉）。分子内和分子间NOE限制，1H（H）-15将N个RDC和所有化学位移（包括主链和侧链）输入RosettaOligomer，以最终测定WT-ACD二聚体结构。

1H（H）-15在溶于500µl含有10%Pf1噬菌体的NMR缓冲液中的500µM蛋白质样品上测量N个残留偶极偶联物（RDC）。IPAP（同相/反相）1H（H）-15N HSQC光谱是在配备有z梯度、三重共振冷冻探头的Bruker Avance III 800 MHz光谱仪上获得的。在NMRView中分析光谱以获得RDC值。PALES程序(Zweckstetter等人，2004年)用于计算文献中公布的不同结构的RDC。

Rosetta低聚物

Rosetta对称fold-and-dock协议可用于确定对称同二聚体的结构。该协议从扩展链开始，同时探索折叠和对接自由度。它由四个能量函数复杂性增加的低分辨率阶段组成，其中对称碎片插入与对称刚体试验交错进行。在低分辨率步骤中，侧链使用一个定位在Cα碳上的单一、残留物特定的伪原子表示。最后，对侧链进行对称重组，并对侧链、刚体和主干自由度进行基于梯度的最小化。在这个高分辨率步骤中，使用了罗塞塔的全原子能量函数。构象搜索主要由实验数据指导，包括分子内和分子间NOE距离约束和RDC。在蒙特卡罗试验和基于梯度的最小化过程中，Rosetta使用了与实验数据和计算数据之间的rmsd成比例的惩罚项。NOE距离在Rosetta中建模为原子对约束。对于结构模型，使用Levenberg–Marquardt非线性平方拟合算法拟合RDC。在保持对准张量的轴向分量（Dα）和菱形分量（R）不变的情况下，对对准张量方向进行了优化。根据RDC数据的粉末模式分布估计Dα和R的值分别为21.5和0.35。共生成10000个模型，其中1000个最低的模型被选择用于聚类分析。在排名最好的簇中具有最低罗塞塔全原子能的十个模型被选择作为最终的结构系综，并以PDB 2N0K的形式存储在蛋白质数据库中。

pH滴定法和pK的测定R（右）通过核磁共振

1H（H）-15N HSQC-TROSY光谱是在配有z梯度三重共振探针的内部Avance III 500 MHz光谱仪上，在pH值为9.3、8.56、7.86、7.44、7.0、6.83、6.7、6.52和6.0的核磁共振缓冲液中的WT-ACD（200µM）上获得的。通过添加少量1N HCl或NaOH调整溶液的pH值。环碳键氢（H）之间的长程关联ε1和Hδ2)和环氮（Nε2和Nδ1)提供组氨酸互变异构状态的信息(Pelton等人，1993年). 这些相关性在1H（H）-15N HSQC光谱使用WATERGATE进行水抑制，并将INEPT延迟设置为1的整数倍/J型全日空航空公司哪里J型全日空航空公司是单键N-H耦合常数的值。pK（磅/平方公里）R（右）组氨酸残基的值通过H的化学位移测定ε1，N个ε2、和Nδ1原子作为pH值的函数。使用Prism（GraphPad），使用改进版的Henderson–Haselbach方程，对化学位移与pH值进行非线性回归拟合：

δ哦b条秒=δH（H）A类+δA类−10第页H（H）−第页K（K）第页1+10第页H（H）−第页K（K）第页,

δ光突发事件是在特定pH值下观察到的化学位移，以及δ哈和δA类分别是完全质子化和去质子化状态下的化学位移。

pH引起的化学位移扰动（CSP）

CSP（Δδ（pH7.5–pH值6.5))计算如下：

Δδ=1/2(((ΔH（H）N个)2+(ΔN个5)2)),

哪里Δδ是酰胺基在pH 7.5和6.5时的化学位移差，ΔHN和ΔN是酰胺质子和15N主链酰胺的化学位移分别不同。

15N-CPMG弛豫色散实验

为了探测ms时间尺度中的构象起伏，15N有效松弛率(R（右）2，有效其是固有弛豫速率的总和，R（右）20和化学交换率，R（右）前任)使用文献中描述的脉冲序列测量WT-ACD(Korzhnev等人，2004年). 在22°C和37°C两种场强（800和600 MHz）下，对200和700µM样品进行了实验。的值ν自旋回波使用的频率为25、50、75、100、150、175、200、300、600和1000赫兹。扫描之间的循环延迟为2.2秒，总CPMG延迟（T）为20毫秒。使用NMRPipe对光谱进行处理和分析，强度与ν自旋回波用程序GUARDD进行分析(克莱克纳和福斯特，2012年). WT-ACD中85个可观察到的残留物中，有32个残留物的值为R（右）2，有效(∞)–R（右）2，有效（0）>8秒−122°C时，其中R（右）2，有效（∞）和R（右）2，有效（0）是ν自旋回波值分别为25 Hz和1000 Hz。其中，16个残基可以用简化的χ来拟合双位点交换模型2<10，这表现出两种交换机制（a）快速交换（模型2，k个前任>>δω）和（b）慢交换（模型3，k个前任<< δω).k个前任δω分别是主要状态和次要状态之间的汇率和化学位移差。在慢交换制度下，参数，铅（次要状态的总体）和δω可以从拟合中提取，此外k个前任在快速汇率制度中，只有k个前任可以从配合中提取。对于拟合优度的估计，目标函数χ2确定如下：

χ2=∑一我我v（v）c（c）第页米克(R（右）2,e（电子）（f）（f）哦b条秒(v（v）c（c）第页米克)−R（右）2,e（电子）（f）（f）C一我c（c）(v（v）c（c）第页米克)σ(R（右）2,e（电子）（f）（f）哦b条秒(v（v）c（c）第页米克)))2,

哪里R（右）2,e（电子）（f）（f）C一我c（c）是有效弛豫率的计算值，σ是观察到的实验不确定度R（右）2，有效它是根据两个重复值的数据集估计的ν自旋回波在这种情况下，在25和200 Hz下收集重复数据集。中报告的错误k个前任,铅，和δω值是从100个蒙特卡罗模拟中估计的，并报告为优化拟合参数与其100个元素分布的标准偏差。

K的测定D类

二聚体-单体离解平衡常数的值，K（K）D类用等温滴定量热法（ITC）测定。在MicroCal ITC上执行ITC200万TM华盛顿大学分析生物制药中心的热量计。将WT-ACD样品透析成50 mM磷酸钠和100 mM氯化钠，pH值为7.5或6.5。将200µl 1 mM WT-ACD和300µl缓冲液分别置于样品和参考细胞中。进行了40次1µl注射，并测量了放热。使用MicroCal Origin软件拟合数据，以获得K（K）D类焓热（ΔH）的变化。

Holdase分析

使用96 well平板阅读器（BioTek）和pH 7.5和250μL微孔体积的PBS溶液，对所有保持酶进行两次分析。使用DTT变性牛α乳清蛋白（Sigma L6010）作为模型底物，并使用360 nm的光散射在42°C下监测存在和不存在WT-和突变HSPB5的蛋白质聚集。向600µMαLac中添加40µM sHSP（亚单位浓度）。αLac的聚集是通过添加DTT至最终浓度50 mM诱导的。模型底物酵母乙醇脱氢酶（Sigma A8656）的聚集是在37°C下通过添加EDTA和DTT至最后浓度5 mM实现的。在存在和不存在WT-和突变HSPB5的情况下，监测聚集体的光散射。向100µM乙醇脱氢酶中添加20µM sHSP（亚基浓度）。

分子量（Mw个)SEC-MALS确定

Mw个HSPB5低聚物的含量通过使用WTC-050S5 SEC色谱柱（怀亚特科技公司）和Akta micro（GE Healthcare）进行分离，并使用配备怀亚特QELS DLS的曙光HELEOS II MALS检测器和使用ASTRA VI软件的Optilab rEX差分折射率检测器进行分析来确定。Mw个通过测量选定峰的静态光散射和相应的蛋白质浓度计算出的罗利比确定。牛血清白蛋白作为校准标准。在SEC-MALS之前，将HSPB5样品在37°C下以40μM单体浓度预先培养30分钟，在50 mM磷酸钠、pH 7.5、100 mM氯化钠和1 mM DTT中。为了检查HSPB5在pH 6.5下的行为，允许40μM的蛋白质在37°C的磷酸盐缓冲液（50 mM磷酸钠、pH 6.5、100 mM氯化钠和1 mM DTT）中平衡至少60分钟。在根据αLac保持酶分析确定的类似条件下进行底物结合分析：HSPB5（40μM）与αLac（240μM）预先孵育在37°C的pH 7.5缓冲液中放置10分钟。随后将DTT添加到50 mM的最终浓度，以触发αLac聚集。50分钟后，对样品进行过滤并注入，以进行SEC-MALS分析和分馏。使用ASTRA软件包（Wyatt Technology Corporation）进行光散射数据和计算。

阴性染色EM分析

将HSPB5和HSPB5-αLac样品稀释至约100–200 nM，涂敷在薄的碳涂层铜格栅上，并使用pH～6.0的甲酸铀酰进行负染，基本上如所述(Ohi等人，2004年). 在配备LaB的Tecnai T12透射电子显微镜（FEI）上采集显微图像6灯丝在120 kV电压下工作。在4k×4k CCD相机（Gatan）上以50000倍放大率、2.2欧/像素间距和1.0–1.5μM离焦记录图像。根据CTF估计对显微图像进行相位校正，并使用电子邮箱2(Tang等人，2007年).2D无参考比对和分类使用蜘蛛(Frank等人，1996年)生成投影平均值。对于规模估计，使用蜘蛛。对所有图像的对比度进行标准化，并在旋转平均值上测量直径。根据大小对平均值进行分组，并使用每组的单个粒子总数来获得大小分布。独立数据收集和分析一式三份，以获得误差线。

致谢

我们感谢彼得·布尔佐维奇（Peter Brzovic）、维纳亚克·维塔尔（Vinayak Vittal）和丽莎·塔特尔（Lisa Tuttle）对手稿进行了翔实的讨论和批判性评估。我们感谢Katja K Dove和James Fields收集支持该项目的生化数据，感谢David H Murdock基金会的Kevin Knagge收集950 MHz的核磁共振谱。我们感谢David Baker访问RosettaOligomer软件和计算设施。这项工作得到了NIH拨款1R01 EY017370（给REK）的支持。NIGMS 2T32 GM008268部分支持SD。

资金筹措表

资助者不参与研究设计、数据收集和解释，也不参与将研究成果提交出版的决定。

资金筹措信息

本论文得到了以下资助：

  • 美国国立卫生研究院（NIH）R01 EY017370型Rachel E Klevit。
  • 美国国立卫生研究院（NIH）T32 GM008268号Scott P Delbecq和Rachel E Klevit。

其他信息

竞争性利益

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

作者贡献

公关、概念和设计、数据采集、数据分析和解释、起草或修改文章。

ET、数据采集、数据分析和解释、起草或修订文章。

SPD、数据采集、数据分析和解释、起草或修订文章。

LS，数据采集，数据分析和解释，起草或修订文章。

AJB，数据采集，数据分析和解释。

DRS，概念和设计，数据分析和解释，起草或修改文章。

REK，概念与设计，数据分析与解释，起草或修改文章。

其他文件

主要数据集

生成了以下数据集：

Rajagopal P，Shi L，Baker D，Klevit RE，2015，人类α-晶体蛋白结构域的化学位移分配和结构，HSPB5，http://www.rcsb.org/pdb/search/structdSearch.do？结构Id=2n0k，在RCSB蛋白质数据库（2N0K）公开提供。

工具书类

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2015;4：e07304。
2015年5月11日在线发布。数字对象标识：10.7554/eLife.07304.019

决定书

沃尔克·多奇，审阅编辑器
沃尔克·多奇，德国歌德大学；
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eLife发布编辑决定书和作者对已发表文章的选择的回复（需经作者批准）。显示了同行审查后发送给作者的信件的编辑版本，表明了实质性的关注或评论；次要问题通常不会显示出来。在发送信函之前，审核人有机会讨论决定（参见审查过程). 同样，作者的回复通常只显示了对评审员提出的主要问题的回复。

感谢您将题为“保守组氨酸调节HSPB5结构以触发伴侣活性以应对应激性酸中毒”的研究成果发送至电子生活你的文章得到了约翰·库里扬（高级编辑）和两位评论员的好评，其中一位是沃尔克·多奇，他是我们的评审编辑委员会成员。

评审编辑和其他评审员在我们做出此决定之前讨论了他们的意见，评审编辑整理了以下意见以帮助您准备修订后的提交。

这是一篇写得很好的论文，出乎意料地报道说，人类sHsp高度保守的组氨酸距离α-晶体结构域二聚体界面一定距离，在生理范围内调节界面的稳定性，作为pH值的函数。作者提供了一系列令人信服的证据，并且还表明这种作用是His-104特有的（按αB-crystallin序列）。它们对可能相关的结构变化提供了一个颇具争议的概述。通过使用单位点突变，他们提供了证据，证明His-104的缺失会导致主要由单体构建的大寡聚体，与野生型相比，单体具有更强的保持酶功能。他们利用这一观察结果分离出sHsp和模型底物的复合物，这些复合物比天然组装物小（不寻常）。

总的来说，这是一项很好的研究，它为这种伴侣的寡聚状态的重要性以及这些不同状态之间的转换提供了一致的图片。

需要澄清的几点：

1） 作者声称：“在早期对HSPB5-ACD结构的分析中注意到了环5/6的两个位置，并认为这与结构之间的pH差异有关(Clark等人，2011年). 然而，我们对现有大量结构的分析表明，环5/6位置与pH值或二聚体寄存器无关，表明它在所有条件下都是结构的动态成分。”

这似乎与他们的模型相矛盾，即该环的位置及其交叉界面的相互作用对于确定寡聚物状态很重要，并且该状态随pH值的变化而变化。

2） 这个环路是否显示出更高的机动性（线条更清晰，T更长2次）比其余的蛋白质？这确实表明灵活性很高。

3） His 104的潜在氢键伙伴是什么？这种相互作用如何稳定二聚体？为什么它会被质子化破坏。由于这是这项研究的中心机制结果，作者应该提供一个可能的模型。环区周围结构的详细图也很重要。

2015;4：e07304。
2015年5月11日在线发布。数字对象标识：10.7554/eLife.07304.020

作者回复

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1） 作者声称：“在早期对HSPB5-ACD结构的分析中发现了环路5/6的两个位置，并提出这与结构之间的pH值差异有关(克拉克等人，2011年). 然而，我们对现有大量结构的分析表明，环5/6位置与pH值或二聚体寄存器无关，表明它在所有条件下都是结构的动态成分.”

这似乎与他们的模型相矛盾，即这个环的位置及其交叉界面的相互作用对于确定低聚物状态很重要，并且它会随着pH值的变化而变化.

我们看到了书面声明是如何被解释为相互矛盾的。当我们回到克拉克等人，2011年，我们发现他们没有提出环构象是pH的函数。因此，我们删除了这一不准确之处，并将文本改为：“因此，在pH 6.5到7.5之间求解的结构中，观察到了两种环构象，表明环在生理pH范围内是动态的”。

2） 这个环路是否显示出更高的机动性（线条更清晰，T更长2 次）比其余的蛋白质？这确实表明了很高的灵活性.

这个15北T2ACD二聚体的平均值为30-40毫秒。只有最末端的残数显示更长的值。重要的是，二聚体界面和回路5/6产生的共振更短的T型2值大于平均值（<30msec），表示它们在毫秒时间尺度内经历环境变化。这就是为什么我们求助于15N弛豫补偿CPMG弛豫色散测量实验，专门报告毫秒时间范围内的过程。我们在“核磁共振溶液结构和15N弛豫揭示了HSPB5-ACD的构象可塑性”。

3） His 104的潜在氢键伙伴是什么？这种相互作用如何稳定二聚体？为什么它会被质子化破坏。由于这是本研究的主要力学结果，作者应提供一个可能的模型。这个环形区域周围结构的详细图也很重要.

在溶液系综的成员中，在His-104附近有几个主链羰基（His-83、Glu-105、Glu-106）和几个侧链基团（Arg-107和Arg-116）。我们在小节“保守组氨酸负责HSPB5-ACD二聚体的不稳定”和讨论中补充了信息。同样的一组相互作用基团在不同的组合中也可以在具有环5/6“向上”构象的晶体结构中看到。因此，我们认为这是一个动态的互动网络，我们不太愿意展示一个详细的静态图片，而该图片只反映了正文中许多可能的互动集合中的一个。然而，对环5/6“向下”构象中的结构的分析表明，潜在的相互作用体在这种状态下从His-104中移开，即Arg-107的侧链，而其他的似乎移近，即Glu-106的侧链。我们认为，在两个环中，His-104构象位于静电和氢键相互作用动态网络的中心，该网络负责调节二聚体界面的稳定性。我们在讨论中澄清了这一点，并添加了补充图，图1–图补充1显示了合奏成员的相关区域以及上下循环结构的示例。

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