白血病。 作者手稿； PMC 2015年12月1日提供。
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PTPROt介导的p53/Foxm1调控抑制CLL小鼠模型中的白血病表型 , 1 , 1 , 三 , 2 , 4 , 5 和 1, 2
塔斯尼姆·莫提瓦拉 1 俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学系，俄亥俄州哥伦布威克斯纳医学中心，邮编：43210
胡班库泰 1 俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学系，俄亥俄州哥伦布市韦克斯纳医学中心，邮编43210
尼古拉·扎内西 三 俄亥俄州立大学分子病毒学、免疫学和医学遗传学系，韦克斯纳医学中心，哥伦布，俄亥俄州43210
弗兰克·弗里索拉 2 俄亥俄州立大学综合癌症中心，俄亥俄州哥伦布市韦克斯纳医学中心，邮编：43210
莫晓奎 4 俄亥俄州立大学生物统计中心，韦克斯纳医学中心，哥伦布，俄亥俄州43210
娜塔拉詹·穆图萨米 5 俄亥俄州立大学内科，韦克斯纳医学中心，俄亥俄州哥伦布43210
萨姆森·雅各布 1 俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学系，俄亥俄州哥伦布威克斯纳医学中心，邮编：43210
2 俄亥俄州立大学综合癌症中心，俄亥俄州哥伦布市韦克斯纳医学中心，邮编：43210
1 俄亥俄州立大学分子和细胞生物化学系，俄亥俄州哥伦布威克斯纳医学中心，邮编：43210
2 俄亥俄州立大学综合癌症中心，俄亥俄州哥伦布市韦克斯纳医学中心，邮编：43210
三 俄亥俄州立大学分子病毒学、免疫学和医学遗传学系，韦克斯纳医学中心，哥伦布，俄亥俄州43210
4 俄亥俄州立大学生物统计中心，韦克斯纳医学中心，哥伦布，俄亥俄州43210
5 俄亥俄州立大学内科，韦克斯纳医学中心，俄亥俄州哥伦布43210
补充资料 1
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2
补充，图1。 16个月大的PTPROt-Tg小鼠的淋巴细胞发育。 骨髓和脾脏中的B细胞发育（B220和IgM染色）和脾脏的T细胞发育（CD4和CD8染色）。
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三。
补充，图2。 TCL1-Tg小鼠和PTPROt/TCL1双Tg小鼠的基因表达变化。 微阵列数据的灵巧路径分析显示，当比较TCL1-Tg与NTg以及TCL1-Tgvs PTPROt/TCL1双Tg时，生物功能发生显著变化，p值表示功能受到随机机会调节的可能性
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4
补充，图3。 相对于NTg小鼠，Foxm1转录靶点在TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠中的表达。
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摘要 慢性淋巴细胞白血病中编码PTPROt的基因甲基化并被抑制。 PTPROt展品 在体外 通过调节B细胞受体信号传导的抑癌特性。 在这里，我们生成了具有PTPROt的B细胞特异表达的转基因（Tg）小鼠。 虽然这些小鼠的淋巴细胞发育正常，但与TCL1-Tg小鼠CLL模型相比，将其与TCL1 Tg小鼠杂交可获得生存优势。 在检测到CLL症状之前对脾脏B淋巴细胞进行基因表达谱分析，然后进行Ingenuity Pathway分析，结果表明TCL1-Tg与非转基因（NTg）和TCL1-Tg-PTPROt/TCL1双Tg中最显著的调节功能是相同的，并且与本研究具有生物学相关性。 此外，在TCL1-Tg小鼠中，趋化因子Ccl3、致癌转录因子Foxm1及其靶点的增强表达在双Tg小鼠中显著受到抑制，表明PTPROt具有抗白血病发生的保护作用。 这项研究还表明，PTPROt介导的Foxm1调节涉及p53的激活，p53是Foxm1的转录抑制因子，通过抑制B细胞受体信号传导来促进激活。 这些结果确立了PTPROt的体内肿瘤抑制功能，并确定p53/Foxm1轴是PTPROt介导的BCR信号抑制的关键下游效应。
引言 蛋白酪氨酸磷酸酶O型受体（PTPRO）是一种膜锚定的酪氨酸磷酸酯，在不同组织中具有不同的功能。 最初克隆为肾小球上皮蛋白1（GLEPP1） 1 具有肾小球滤过和足细胞结构功能 2 该蛋白在大脑中也高水平表达，在神经细胞的轴突生成和分化中发挥作用 三 发现在B淋巴细胞中鉴定的截短亚型（PTPROt）可促进细胞周期停滞 4 我们小组和其他人进行的一系列研究表明，它在不同类型的癌症中的甲基化和抑制作用 5 - 10 及其 在体外 和 体外 生长抑制特性 5 , 7 , 8 , 11 除了了解其功能外，包括我们在内的几项研究还确定了其在不同细胞类型中的底物，例如轴突中的eph受体 12 淋巴细胞中的SYK、Lyn和ZAP70 13 , 14 骨髓性白血病的BCR/ABL 11 HCC中的VCP 5 最近使用大量人体样本的研究表明，PTPRO在乳腺癌中具有预后功能 15 食管鳞癌的生物标志物功能 16 因此，这些研究强调了PTPRO表达的生理意义及其在患病状态下的失调。
慢性淋巴细胞白血病（CLL）是最常见的成人白血病，2012年新增16060例 17 尽管在过去几十年中，治疗方法取得了进步，5年相对生存率有所提高，但慢性淋巴细胞白血病（CLL）仍然无法治愈。 在CLL中，已确定异常蛋白酪氨酸激酶活性（例如Lyn、SYK、ZAP70）及其下游信号支持恶性增殖和生存的作用。 尽管激酶活性的异常主要是由于酪氨酸激酶基因的过度表达，但蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的缺乏抵消了激酶活性的作用，也参与了慢性淋巴细胞白血病的病理过程。 在这方面，我们已经表明 PTPROt公司 在原发性CLL中被转录和表观遗传机制显著下调 7 以及CLL的TCL1-Tg小鼠模型 18 相对于相应的正常B细胞。 此外，PTPROt通过去磷酸化BCR信号成分Lyn激酶在B细胞受体（BCR）信号传导中发挥重要作用 14 和Syk 13 此外，ZAP70是一种酪氨酸激酶，在B-CLL中异常表达并预测不良结果，是一种 真诚地 PTPROt底物 14 .
尽管所有迹象表明PTPROt在CLL中作为一种肿瘤抑制剂发挥着关键作用，但尚未进行任何研究来证明其在CLL的体内功能。 此外，根据对人类CLL样本和小鼠CLL模型的研究，已经确定了CLL肿瘤发生的几种机制 19 , 20 在这些机制中，CLL细胞中TCL1癌基因的异常表达与分子亚型和增殖状态相关 21 重要的是，TCL1在小鼠B淋巴细胞中的异位表达在衰老过程中会引起类似于人类CLL的淋巴增生性疾病 22 我们以前的研究已经证明在这种小鼠模型中PTPROt受到抑制 18 这些观察结果为利用CLL的TCL1-Tg模型探索PTPROt在白血病发生中的作用及其相关机制提供了理论基础。在这里，我们描述了在B细胞中特异性表达PTPROt的转基因小鼠的产生。 这些小鼠发育正常，寿命正常。 此外，它们在淋巴细胞发育中没有任何缺陷。 将这些小鼠与TCL1-Tg小鼠CLL模型杂交，可以缓解CLL的特征，例如脾脏重量增加和白血病CD5/CD19细胞群的积聚。 此外，与TCL1 Tg小鼠相比，双Tg小鼠表现出增加的寿命。 在探索PTPROt这种保护功能的机制时，我们观察到趋化因子Ccl3（CLL患者疾病进展的已知标志物）和Foxm1在双Tg小鼠中的抑制作用，与TCL1-Tg小鼠相比，这表明Foxml在CLL的发病机制中有直接作用。 此外，我们已经证明，抑制B细胞受体信号可以激活p53来抑制这些小鼠中FoxM1的表达。
材料和方法 抗体 用于Western blot的抗体：抗-HA（Covance，普林斯顿，新泽西州）、抗-pY（416）Src、Src（Cell Signaling Technology，丹佛，马萨诸塞州）、反pY 4G10（Upstate）、抗pY20、反pY99（Santa Cruz Biotechnology，Inc，达拉斯，德克萨斯州）、防p53（Santa Cruz Bintechnologies，Inc）、抗GAPDH（Millipore，Billerica，MA）、抗Ku-70（Neomarker，Fremont，CA） 以下用于流式细胞术的抗体来自Beckton Dickinson and Company（加州圣何塞）：B220、IgM、CD4、CD8、CD5、CD11b、GR-1。
生成PTPROt Tg小鼠并与TCL1 Tg小鼠杂交获得PTPROt/TCL1双Tg小鼠 为了在小鼠B细胞室中特异性表达PTPROt，使用引物5'-CA扩增人PTPROt cDNA GGATCC公司 CAATGGTTACAGAGAGATATCC-3'和5'-CTA CTCGAG公司 AGCGTAATCTGTGAACGTCGTATGTA公司 GGACTTGCTAACATTCG-3'，并克隆到pEmu质粒的BamHI和XhoI位点（用于在B细胞中表达TCL1的相同质粒 23 ). 限制位点下划线，HA标签对应的序列用粗体表示。 俄亥俄州立大学综合癌症中心的基因工程小鼠模型共享资源对线性化转基因构建物进行了受精卵微量注射，将微量注射的受精卵植入假孕受体小鼠，并对创始小鼠进行断奶。 使用创始小鼠的尾部夹进行Southern blot和PCR基因分型。 在C57BL6背景中生成了两个创始人行。 其中，通过蛋白质印迹分析检测到的建立系F1具有非常低水平的PTPROt表达，而建立系F2具有容易检测到的PTPROt表达( ). 在两个创始系上进行的淋巴细胞发育的初步表征产生了类似的结果（数据未显示）。 因此，这里提供了来自高表达创始者系（F2）的数据，其余的研究都是针对该创始者进行的。 在C57BL6背景下对PTPROt Tg小鼠进行表征。 为了将其与TCL1-Tg小鼠杂交，首先将其与C3H小鼠杂交，以获得与TCL1 Tg小鼠相同背景的C57BL6/C3H背景下的F1代。 然后将这些小鼠与纯合TCL1 Tg小鼠杂交，获得TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠作为窝友。 用半合子TCL1-Tg小鼠进行一组繁殖，获得所有四组小鼠（NTg、PTPROt Tg、TCL1 Tg和PTPROt/TCL1双Tg）作为窝友。
PTPROt-Tg小鼠的特性 使用α-HA（HA-tagged PTPROt）和α-GAPDH（normalizer）对两位创始人F1和F2（A）脾脏以及创始人F2（B）胸腺和脾脏的全细胞提取物进行Western blot分析。 （C） 使用α-pY（416）Src（活性Src/Lyn）、α-Src（总Src）和GAPDH（归一化）对CD19分选的B细胞和非B细胞的全细胞提取物进行Western blot分析。 （D） 使用α-HA（HA标记的PTPROt）、α-SYK（脾酪氨酸激酶）和α-Ku-70（正常化）对CD19分选的脾B细胞的全细胞提取物和富含磷酸酪氨酸的多肽进行Western blot分析。
PTPROt-Tg小鼠的淋巴细胞发育 从7周龄NTg和PTPROt-Tg小鼠（n=3）收集淋巴结、股骨（用于骨髓）、脾脏和胸腺。 使用PBS从股骨中清除淋巴细胞。轻轻压碎淋巴结、胸腺和脾脏以释放淋巴细胞。 使用ficoll梯度从脾细胞悬浮液中去除红细胞。 在FC500流式细胞仪（加利福尼亚州帕萨迪纳Beckman Coulter公司）上分析100万个用适当抗体和相应的同种对照抗体染色的细胞。
微阵列分析和实时RT-PCR 使用CD19微球（Miltenyi）对从4个月龄NTg、TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠分离的脾细胞进行CD19+细胞分类。 CD5/CD19抗体染色后，流式细胞仪检测分选细胞纯度>90%。 使用Trizol从细胞中提取RNA，然后进一步纯化。 RNA随后用于Affymetrix平台（moGene1.0 ST）上的微阵列分析，该平台由俄亥俄州立大学综合癌症中心的核酸共享资源执行。 使用RMA方法对数据进行规范化 24 微阵列数据存储在GEO数据库中( {“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE60582”，“term_id”：“60582“}} GSE60582标准 ). 我们使用方差分析（ANOVA），使用SAS软件测试差异表达基因（SAS，Inc；Cary，NC）。 使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA，Ingenuith Systems，Inc，Redwood City，CA）对不同组小鼠之间的生物功能和基因网络进行了鉴定。 使用PrimeTime qPCR分析（IDT）通过实时RT-PCR验证所选基因的表达。
细胞处理 将从TCL1-Tg小鼠分离的CD19选择的脾淋巴细胞保存在添加了10%FBS（Invitrogen）、2 mmol/L L-谷氨酰胺（Invit罗gen）的RPMI 1640（Invitrongen）中，37°C，在含有5%CO的湿化培养箱中 2 用2.5μM SYK抑制剂R406（德克萨斯州休斯顿市塞列克化学）和2.5μM BTK抑制剂PCI-32765（德克萨斯州休士顿市塞勒克化学）处理细胞48小时。
其他统计数据 使用方差分析（ANOVA）对连续变量数据进行分析。 绘制小鼠生存数据（Kaplan-Meier生存曲线），并使用log-rank检验进行分析。 数据分析采用SAS软件。
结果 PTPROt-Tg小鼠的制备及初步鉴定 为了评估PTPROt在CLL中的生理意义，我们在V H（H） 启动子-Eμ增强子，与TCL1 Tg小鼠中驱动TCL1表达的元件相同 23 使用抗HA-epitope抗体评估脾和胸腺细胞全细胞提取物中转基因的表达。 正如预期的那样，转基因在脾脏中特异性检测到，但在胸腺中没有检测到( ). 接下来，通过阳性选择从脾脏纯化的B细胞中研究先前鉴定的PTPROt底物（Lyn和SYK）的磷酸化状态。 用检测活化Src/Lyn的抗pY（416）Src免疫印迹显示，与NTg对应物相比，Tg小鼠的磷酸化显著降低( ). 相反，在用作对照的阴性选择细胞（非B细胞）中未观察到Src磷酸化的改变( )增强组织特异性表达和生化效应，以应对PTPROt过度表达。 由于没有针对磷酸化SYK的特异性抗体，我们从脾B细胞的全细胞提取物中免疫沉淀磷蛋白，然后用抗SYK抗体进行免疫印迹，以确定其在Tg小鼠中的磷酸化状态。 数据表明，在使用抗pY的IP后，Tg样本中的SYK数量减少( )表明Tg小鼠脾脏B细胞中存在低磷酸化。
接下来，对7周龄小鼠进行流式细胞术分析，以确定PTPROt的B细胞特异性转基因表达是否会导致这些小鼠B细胞发育的改变。 采用骨髓、脾脏和淋巴结细胞B220/IgM染色研究前B细胞向B细胞的转化。 在这些淋巴器官中未观察到B220+/IgM+细胞群的显著变化( ). 此外，还通过流式细胞仪分析胸腺和脾脏中的CD4/CD8细胞来研究T细胞的发育。 该分析也没有发现这些淋巴器官中CD4+/CD8+细胞群的任何显著变化( ). 同样，16个月大的Tg和NTg小鼠的B细胞和T细胞发育也无法区分( 补充，图1 ). 这些数据表明，PTPROt Tg小鼠与TCL1 Tg小鼠杂交引起的白血病表型的任何变化都不是由于转基因对B细胞发育的影响。
7周龄PTPROt-Tg小鼠的淋巴细胞发育 （A） 通过IgM和B220的免疫染色研究骨髓、淋巴结和脾脏中的B细胞发育。 （B） 通过CD4和CD8免疫染色研究胸腺和脾脏中的T细胞发育。
PTPROt/TCL1双Tg和TCL1-Tg小鼠脾脏B细胞的差异基因表达谱 要评估 体内 为了了解PTPROt的抑瘤作用及其潜在机制，将PTPROt Tg小鼠杂交到TCL1 Tg小鼠CLL模型。 Western blot分析分别检测TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠脾脏B细胞中TCL1和PTPROt及TCL1的表达( ). 通过微阵列分析，在4个月大的小鼠中评估了TCL1-Tg背景中PTPROt过度表达导致的早期基因表达变化。 NTg和PTPROt-Tg小鼠也被包括在分析中进行比较。 在处死时，与TCL1-Tg组相比，PTPROt/TCL1双Tg组的脾脏重量（20%，P=0.007）和细胞总数（36%，P=0.001）显著减少( ). 值得注意的是，NTg和PTPROt-Tg小鼠的这些参数在统计学上没有显著差异。 来自脾脏的CD19+B细胞用于Affymetrix平台上的微阵列分析。 流式细胞术分析证实CD19分选的B细胞纯度>90%（数据未显示）。 接下来，我们试图确定与TCL1-Tg和NTg或PTPROt/TCL1之间基因表达变化相关的功能和网络。 灵巧路径分析（IPA）表明，两种比较中最显著的调节功能是相同的，并且在生物学上也与这些研究相关( 补充，图2 ). 这些观察结果表明，PTPROt可以降低表达TCL1的淋巴细胞的致瘤特性。 具有细胞周期、DNA复制、重组、修复和细胞死亡功能的基因网络在TCL1-Tg小鼠（相对于NTg小鼠）中上调，但在PTPROt/TCL1双Tg小鼠（相对TCL1-Tg小鼠）中下调( ). 该网络中一个功能重要的基因是FoxM1，它是转录因子叉头家族的成员，正逐渐成为癌症诊断和治疗的靶点。 FoxM1最近也被确定为生发中心增殖的主要调节器 25 实时RTPCR对微阵列数据的验证确实表明，TCL1-Tg小鼠中FoxM1的表达增加，而PTPROt/TCL1双Tg小鼠中的表达相对减少( ). 其在TCL1-Tg小鼠脾脏B淋巴细胞中的上调可以解释其增殖增加 26 而对双Tg小鼠的抑制表明PTPROt可以降低表达TCL1的淋巴细胞的增殖潜能。 有趣的是，与NTg小鼠相比，在TCL1-Tg小鼠中FoxM1的其他几个转录靶点也同样上调，但在PTPROt/TCL1双Tg小鼠中没有上调( 补充，图3 & 表1 ). 在Foxm1靶点的细胞周期基因中，Cdc20和Cdc25c也通过实时RT-PCR进行了验证( ). 根据表型数据观察( )，Foxm1和Cdc20的表达在NTg和PTPROt Tg之间没有显著差异( ). 虽然与NTg小鼠相比，PTPROt Tg小鼠中的Cdc25c有小而显著的增加，但TCL1 Tg小鼠的增加和PTPTOt/TCL1双Tg小鼠相对减少要显著得多( ). 除了这些细胞周期调节因子外，在TCL1-Tg小鼠中Ccl3（趋化因子（C-C基序）配体3）的表达也增强，而在双Tg小鼠中则受到抑制。 人CCL3（也称为巨噬细胞炎性蛋白-1a（MIP-1a））的表达是由乳样细胞通过B细胞受体信号在CLL细胞中诱导的，因此与ZAP70的表达相关 27 此外，CLL患者血浆中CCL3蛋白水平与进展风险相关 28 实时RT-PCR也验证了TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠中Ccl3表达的改变( ). 同样，与Foxm1和Cdc20类似，与NTg小鼠相比，PTPROt-Tg小鼠中Ccl3的表达没有显著改变( ). 有趣的是，随着BCR的激活，CLL中CCL3的表达增强 27 由于PTPROt是BCR信号的负调节器 13 , 14 合理的假设是，在两组小鼠中观察到的Ccl3表达的改变是由差异BCR信号引起的。
TCL1表达对PTPROt-Tg小鼠表型的影响 （A） 双Tg小鼠PTPROt和TCL1的Western blot分析。 （B） NTg、PTPROt-Tg、TCL1-Tg和双Tg小鼠的脾脏重量和（C）脾细胞总数。 （D） 当比较TCL1 Tg与NTg以及PTPROt/TCL1 T g与TCL1-Tg时，微阵列数据的灵巧路径分析显示了基因表达的变化。基因表示为使用各种形状的节点，这些形状代表编码蛋白的功能类别。 实线/虚线表示直接/间接蛋白质相互作用。 箭头表示激活。 红色/绿色代表较高/较低的表达。
微阵列数据验证 NTg、PTPROt-Tg、TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠CD19分选的脾脏B细胞中（A）FoxM1、（B）Cdc20、（C）Cdc25c和（D）Ccl3的实时RT-PCR。 对PTPROt Tg、TCL1 Tg和PTPROt/TCL1双Tg相对于NTg小鼠以及TCL1和PTPROt/TCL1双Tg小鼠的表达折叠变化进行统计比较。 图中仅描述了具有统计学意义的p值（≤0.05）。
PTPROt在TCL1-Tg小鼠中的表达抑制脾脏中白血病和炎症细胞的数量 在TCL1 tg小鼠中也观察到CD5+/CD19+B细胞的积聚，这是CLL的一个特征 23 为了确定PTPROt的表达是否拯救了双Tg小鼠的这种疾病表型，对8月龄小鼠的脾细胞进行了流式细胞术分析。 之所以选择这个时间点，是因为TCL1-Tg小鼠此时白血病CD5+/CD19+细胞数量显著增加 23 数据确实表明，与TCL1-Tg小鼠相比，双Tg小鼠的CD5+/CD19+脾细胞显著减少( ). 同样，在NTg和PTPROt-Tg小鼠之间，未观察到细胞群分布的显著差异( ). CD5+/CD19+细胞绝对数量图反映了TCL1-Tg小鼠中观察到的显著增加( ，左侧面板 ). 相反，CD5−/CD19+细胞绝对数量图显示TCL1-Tg小鼠中该细胞数量减少( ，右侧面板 ). 单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和CD8的化学吸引剂Ccl3的上调 + T细胞促使我们评估TCL1-Tg和双Tg小鼠脾脏中的这些细胞。 正如预期的那样，TCL1-Tg小鼠脾细胞中CD11b阳性的比例较高，CD11b是单核细胞和巨噬细胞的标记物( ). 与双Tg小鼠相比，TCL1-Tg小鼠的CD8细胞数量更多( ). TCL1-Tg小鼠中CD8细胞群的这种扩增将CD8:CD4比率从PTPROt/TCL1双Tg小鼠中观察到的正常1:1比率增加到~2:1( )以及NTg和PTPROt Tg小鼠( 补充，图1 ). 这些观察结果表明，PTPROt的表达可防止炎症细胞浸润脾脏。
8月龄TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠脾脏中的细胞群 （A） CD5和CD19染色脾细胞的流式细胞术分析（CLL细胞）。 给出了三个分析样本中一个样本的流式细胞术数据。 （B） 在（A）中分析的四组小鼠中CD5+/CD19+（左面板）和CD5−/CD19+（右面板）细胞的绝对数量。 数据表示3个样本的平均值±SD。（C）CD11b染色脾细胞（巨噬细胞/单核细胞）的流式细胞术分析。 给出了三个分析样本中一个样本的流式细胞术数据。 细胞群百分比反映了3个样本±SD的平均值。（D）CD4和CD8染色脾细胞（T细胞）的流式细胞术分析。 给出了三个分析样本中一个样本的流式细胞术数据。
双Tg小鼠比TCL1-Tg小鼠存活时间更长 为了确定PTPROt的表达是否赋予TCL1 Tg小鼠生存优势，监测一组TCL1 Tg（n=47）和双Tg小鼠（n=44）的生存情况。 双Tg小鼠的中位生存期为389天（95%可信区间：346421），而TCL1 Tg小鼠为333天（95%置信区间：313373）。 log-rank检验表明，两组之间的生存概率存在显著差异（p值=0.0114）( )与TCL1-Tg小鼠相比，双Tg小鼠的存活率增加。 这一观察强化了PTPROt的抑癌特性。
TCL1-Tg（n=47）和PTPROt/TCL1-Tg（n=44）小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。
Foxm1通过B细胞受体（BCR）信号通路由p53调节 为了确定Foxm1在TCL1-Tg小鼠中上调的机制以及PTPROt对双Tg小鼠的抑制作用，我们使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）来确定TCL1 Tg小鼠相对于NTg小鼠和双Tg鼠中最显著改变的转录因子。 TP53是两种比较中预测在TCL1-Tg小鼠中被抑制的排名最高的转录因子。 相反，与TCL1-Tg小鼠相比，TP53在双Tg小鼠中被预测为激活( ). 有趣的是，TP53可以通过抑制E2F1对FOXM1进行负调控 29 , 30 EMSA对p53 DNA结合活性的分析确实表明，双Tg小鼠的DNA结合活性高于TCL1-Tg小鼠( ). 因为p53本身是由丝氨酸磷酸化调节的 31 Tg小鼠p53活性的改变可能是酪氨酸磷酸化调节信号分子的结果。 因为PTPROt通过靶向Lyn激酶抑制B细胞受体途径 14 和SYK 13 我们使用一种针对SYK（R406）的临床活性抑制剂来确定Foxm1的表达是否由PTPROt通过该途径调节。 我们还测试了一种新的抑制剂，PCI-32765/ibrutinib，它在B细胞受体信号通路中靶向BTK，最近已被FDA批准用于治疗CLL，因为它对Foxm1表达的影响。 实时RT-PCR显示，用抑制剂处理TCL1-Tg小鼠脾B细胞可抑制Foxm1( ). 正如预期的那样，在BCR信号被抑制后，Ccl3的表达也被抑制( ). 我们还观察到p53在抑制剂处理的细胞中表达更高( ). 这些观察结果表明，PTPROt对BCR信号的抑制会诱导p53，而p53又会抑制Foxm1。
Foxm1调节机制 （A） IPA预测了TCL1-Tg小鼠和PTPROt/TCL1双Tg小鼠TP53、E2F1和FOXM1之间的相互作用。 （B） TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠的p53 DNA结合活性。 HepG2（p53 重量 )和Huh7（p53 多用途终端 )分别作为阳性和阴性对照。 （C） 如图所示，通过实时RT-PCR测量从经抑制剂治疗的TCL1-Tg小鼠分离的CD19+细胞中Ccl3和Foxm1表达的折叠变化。 （D） 处理细胞中p53的免疫印迹分析。 数据被标准化为GAPDH。
讨论 在本研究中，我们通过生成具有PTPROt B细胞特异性表达的Tg小鼠，首次研究了PTPROt在CLL中的体内功能。 我们已经证明，这些小鼠发育正常，寿命正常。 此外，先前确定的PTPROt、Lnk和SYK激酶底物的磷酸化在B淋巴细胞中受到抑制，但在Tg小鼠脾脏分离的T淋巴细胞中没有受到抑制。 重要的是，这些小鼠的淋巴细胞发育没有任何显著变化。 该观察结果表明，通过将PTPROt Tg小鼠与TCL1 Tg小鼠（CLL小鼠模型）杂交获得的双Tg小鼠中观察到的任何表型和病理改变，都不是由于PTPROt外源性表达导致淋巴细胞发育改变的结果。
双Tg小鼠的病理学评估表明，与TCL1-Tg小鼠相比，脾脏重量和脾细胞总数减少，表明PTPROt的表达在TCL1表达的背景下具有生长抑制作用。 为探讨PTPROt功能的机制而进行的微阵列分析表明，与非转基因小鼠和双Tg小鼠相比，TCL1-Tg小鼠的基因表达谱表现出致癌特性。 这表明双Tg小鼠的表型与NTg小鼠相似。
一个引人注目的观察结果是Ccl3（巨噬细胞炎症蛋白1a）的显著上调，这是CLL疾病进展的标志 28 在TCL1-Tg小鼠中及其在双Tg小鼠中的抑制作用。 符合其化学吸引功能 28 , 32 TCL1-Tg小鼠CD11b+和CD8+细胞的数量较高，而双Tg小鼠的数量较低。 因此，与双Tg小鼠相比，TCL1-Tg小鼠中CD19+B细胞的百分比降低。 这些结果表明，PTPROt可以抑制支持CLL细胞生长的单核细胞和T淋巴细胞的浸润 33 .
另一个新的观察结果是在双Tg小鼠中抑制致癌转录因子Foxm1及其靶点。 Foxm1是一种属于转录因子FOX家族的增殖相关转录因子，参与细胞周期基因的调控，是癌症诊断和治疗的重要靶点。 虽然CLL传统上被认为是一种凋亡减少而非增殖增加的疾病，但现在人们认识到CLL细胞增殖，并且在TCL1-Tg小鼠中也观察到这种增殖 26 FOXM1在原发性人类CLL中的上调以前没有报道过，可能是因为使用了外周血淋巴细胞而不是脾细胞。 可以想象，淋巴细胞在脾脏中增殖，一旦进入循环，就会休眠。 因此，以脾淋巴细胞中FOXM1的表达为靶点来抑制其增殖和外周血白细胞计数的增加变得非常重要。
最后，Foxm1调控机制值得评论。 先前的研究表明，B细胞受体途径调节Ccl3的表达 27 由于PTPROt是该途径中激酶的负调节因子，因此可以想象双Tg小鼠中Ccl3的抑制是由BCR信号传导的抑制引起的。 然而，尚未研究Foxm1的这种调节。 有趣的是，微阵列数据的IPA显示，TP53是FOXM1的负调控因子 29 , 30 与NTg小鼠和双Tg小鼠相比，在TCL1-Tg小鼠中被抑制。 为了确定TP53以及FOXM1是否也受到BCR信号通路的调节，我们使用了对该通路中特定激酶的抑制剂。 这项研究确实表明，Foxm1的表达也受B淋巴细胞BCR信号的控制。 重要的是，这项研究描述了重要的肿瘤抑制剂PTPROt和p53之间的关系及其在癌基因Foxm1调节中的作用。 在这种情况下，值得注意的是，CLL患者中与17p染色体缺失相关的p53缺失被认为是导致侵袭性表型的原因 34 , 35 .
补充材料 2 补充，图1。 16个月龄PTPROt-Tg小鼠的淋巴细胞发育。 骨髓和脾脏中的B细胞发育（B220和IgM染色）和脾脏的T细胞发育（CD4和CD8染色）。
三 补充，图2。 TCL1-Tg小鼠和PTPROt/TCL1双Tg小鼠的基因表达变化。 微阵列数据的独创性通路分析显示，当比较TCL1 Tg与NTg和TCL1 Tg与PTPROt/TCL1双Tg时，显著改变的生物功能的变化，p值表示由于随机机会而调节功能的可能性
4 补充，图3。 相对于NTg小鼠，Foxm1转录靶点在TCL1-Tg和PTPROt/TCL1双Tg小鼠中的表达。
致谢 我们感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心（Ohio State University Comprehensive Cancer Center）的微阵列、分析细胞计量学（Analytical Cytometry）和基因工程小鼠建模（Genetilly Engineed Mouse Modeling）共享资源提供技术援助。 我们感谢Kalpana Ghoshal、Sarmila Majumder和Jharna Datta的宝贵讨论； Satavisha Roy寻求实验援助； 和Alexey Efanov为流式细胞术提供帮助。 这项工作得到了NIH拨款CA101956（STJ）的部分支持。
脚注
利益冲突
提交人声明没有利益冲突。
补充材料
补充信息见白血病网站。
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