摩尔癌症治疗。作者手稿；PMC 2016年3月1日提供。
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Hsp70-Bag3蛋白-蛋白相互作用作为癌症潜在治疗靶点的验证
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李晓凯
1加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经退行性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158
特瑞莎·科尔维
2波士顿大学医学院生物化学系，马萨诸塞州波士顿02118
詹妮弗·劳赫
1加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经退行性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158
迭戈·阿科斯塔·阿尔瓦尔
三加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学研究所，生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山，94158
马丁·坎普曼
4加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学院分子和细胞药理学系，加利福尼亚州旧金山，邮编94158
布莱恩·邓亚克
1加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经退行性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158
拜伦·汉恩
5加利福尼亚大学旧金山分校医学系，Helen Diller家庭综合癌症中心，加利福尼亚州旧金山，94158
布莱克·阿夫塔布
5加利福尼亚大学旧金山分校医学系，Helen Diller家庭综合癌症中心，加利福尼亚州旧金山，94158
梅根·穆尔纳
5加利福尼亚大学旧金山分校医学系，Helen Diller家庭综合癌症中心，加利福尼亚州旧金山，94158
Min Cho先生
4加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学院分子和细胞药理学系，加利福尼亚州旧金山，邮编94158
彼得·沃尔特
三加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学研究所，生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山，94158
乔纳森·魏斯曼
4加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学院分子和细胞药理学系，加利福尼亚州旧金山，邮编94158
迈克尔·谢尔曼
2波士顿大学医学院生物化学系，马萨诸塞州波士顿02118
杰森·盖斯特威基（Jason E.Gestwicki）
1加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经退行性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158
1加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和神经退行性疾病研究所，加利福尼亚州旧金山，94158
2波士顿大学医学院生物化学系，马萨诸塞州波士顿02118
三加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学研究所，生物化学和生物物理系，加利福尼亚州旧金山，94158
4加利福尼亚大学旧金山分校霍华德·休斯医学院分子和细胞药理学系，加利福尼亚州旧金山，邮编94158
5加利福尼亚大学旧金山分校医学系，Helen Diller家庭综合癌症中心，加利福尼亚州旧金山，94158
通讯员：Jason E.Gestwicki，加利福尼亚大学旧金山分校，675 Nelson Rising Lane，San Francisco，CA 94158，电话：（415）502 7121，ude.fscu@ikciwtseG.nosaJ - 补充资料
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摘要
热休克蛋白70（Hsp70）是一种应激诱导型分子伴侣，是癌症发展的几个步骤所必需的。事实证明，针对Hsp70活性位点的研究相对具有挑战性，这也激发了人们对替代方法的兴趣。Hsp70与Bcl2-associated athanogene 3（Bag3）合作，通过多种途径促进细胞存活，包括FoxM1。因此，Hsp70-Bag3蛋白-蛋白相互作用（PPI）的抑制剂可能提供一种靶向该伴侣的非经典方法。我们报告JG-98，一种PPI的变构抑制剂，确实具有抗增殖活性（EC50值介于0.3和4μM之间）。JG-98破坏了FoxM1的稳定性，减轻了下游效应器的抑制，包括p21和p27。基于这些发现，在两种异种移植模型中对JG-98在小鼠体内的药代动力学、耐受性和活性进行了评估。结果表明，Hsp70-Bag3相互作用可能是一个有希望的新的抗癌治疗靶点。
介绍
热休克蛋白70（Hsp70/HSPA1A）是一种分子伴侣，在蛋白质稳态和细胞生存中起着重要作用(1). 基于表达数据、敲除研究和第一代抑制剂有希望的抗增殖活性，它已成为一个有吸引力的抗癌靶点(2——8). 然而，通往安全有效的Hsp70抑制剂的道路仍然不确定。一个挑战是Hsp70的活性位点位于其核苷酸结合结构域的深沟中。事实证明，开发该位点的竞争性抑制剂具有挑战性，部分原因是Hsp70对ATP的紧密亲和力(4). 这一观察推动了对非规范解决方案的搜索(5,9).
众所周知，Hsp70与广泛的伴侣合作(9)包括一个包含保守Bag结构域的蛋白质家族，如Bag1、Bag2和Bag3。这些Bag结构域与Hsp70结合，并帮助指导其伴侣功能。在这些共同伴侣中，Bag3作为一个抗癌靶点特别令人感兴趣，因为它在压力下选择性上调(10)在许多肿瘤类型中，其表达与Hsp70共同升高(5,11). 更重要的是，Bag3已被证明与Hsp70合作，通过多种途径调节癌症的发展，包括细胞周期和抑制癌基因诱导的衰老（OIS）(12). 与这些观察结果一致，使用突变、敲除或第一代小分子阻断Hsp70-Bag3相互作用对癌细胞具有选择性抗增殖活性(12)这表明抑制Hsp70-Bag3蛋白-蛋白质相互作用（PPI）可能是中断Hsp70功能的一种非规范方式。
尽管最初令人畏惧，但许多PPI已成为抗癌项目中有希望的药物靶点，其中含有MDM2-p53抑制剂(13,14)，Mcl1-Bax(15)和其他(16——18)正在积极探索。PPI有许多种类，它们是由蛋白质伴侣的相对亲和力和复合体中埋藏的表面积来定义的(17,19——21). Hsp70-Bag3相互作用在相对较大的表面积上以相对紧密的亲和力（约30 nM）发生(22,23)–将其置于可能难以中断的PPI类别。然而，利用与变构位点结合的分子成功地抑制了具有类似特征的PPI(19,20)，这表明使用正确的工具，PPI可能是“可用药的”。
基于这些观察结果，我们试图使用一种新发现的变构抑制剂JG-98来探讨Hsp70-Bag3相互作用是否是一个合适的抗癌靶点(24). 在这里，我们报道了该分子与Hsp70上的保守位点紧密结合，并削弱了Hsp70-Bag3相互作用在体外和细胞内。该化合物对多种癌细胞（EC）具有不同的抗增殖活性50约0.3至4μM），但对健康小鼠成纤维细胞（EC）毒性相对较小50~4.5微米）。JG-98还破坏了FoxM1细胞周期途径，与已知的Hsp70-Bag3复合物的作用一致。尽管JG-98不能口服生物利用，但当腹膜内给药时，它在小鼠中具有良好的耐受性，并且它在两种异种移植物模型中抑制了肿瘤生长。总之，这些验证概念的研究表明，Hsp70-Bag3相互作用可能是一个有希望的进一步探索目标。
材料和方法
化学
YM-01、JG-98和YM01-生物素是根据先前公布的方法合成的(24). JG98生物素的合成和表征以及分子的化学结构可以在补充图1.
细胞
MCF-7、MDA-MB-231、A375、MeWo、HeLa、HT-29、SKOV3、Jurkat和MEF购自ATCC。Constantine Mitsiades博士提供了用萤火虫荧光素酶表达载体稳定转导的人类多发性骨髓瘤细胞系（MM1.R、INA6、RPMI-8226、JJN-3、U266、NCI-H929、L363、MM1.S、KMS11、LP-1、AMO-1、OPM1、OPM2）。所有细胞均按照既定方案进行培养。细胞系未经进一步鉴定。
细胞活性测定
MCF-7、MDA-MB-231、A375、MeWo、HeLa、HT-29、SKOV3、Jurkat和MEF活性由ATCC的MTT细胞增殖分析试剂盒（ATCC编号：30–1010K）测定。简单地说，将细胞（MEF为2000个/孔，其他为5000个/孔）置于0.1 mL培养基中的96个经TC处理的平板中，并允许隔夜附着。然后在0.2 mL培养基中用不同浓度的化合物处理细胞。最终DMSO浓度为1%。在5%CO中孵育72小时后2，用0.1 mL PBS将细胞洗涤3次，然后添加0.1 mL新鲜培养基和10μL MTT试剂。将平板在暗处和37°C下培养4小时，向每个孔中添加0.1 mL洗涤剂缓冲液，并在570 nm的吸光度下对所得溶液进行定量。如前所述，在用萤火虫荧光素酶稳定转导的骨髓瘤细胞系中进行活性测定(25,26). 简单地说，多发性骨髓瘤细胞被镀上，并用JG-98以11种浓度（30 nM至30 uM）处理72小时。培养后，添加荧光素底物，并使用Biotek HT光度计测量生物发光信号。使用模拟治疗和无细胞对照分别作为100%和0%的存活率参考，对发光信号进行标准化。集成电路50数值来自使用Prism v.6.0c（GraphPad）绘制和拟合的剂量-反应曲线（参见补充信息).
分子对接
为了便于对接研究，在GROMACS（v4.6.5）中对Hsc70 NBD（PDB:3C7N）进行了分子动力学模拟。使用AMBER03力场和TIP3P水模型编制了NBD的坐标和拓扑文件。生成一个矩形框，从蛋白质表面膨胀1.2纳米，填充水分子并随机填充Na+/氯离子-离子强度为100 mM。该系统受到主链约束，能量最小化，然后进行两步平衡过程，以达到310K和1 bar的目标温度和压力。解除主干约束，在恒定压力和温度下以2 fs的时间步长运行5 ns的完整MD模拟。进行聚类分析以分离出最具代表性的构象。然后，我们使用UCSF Dock（v6.6）进行对接研究。用DMS制备受体分子表面，使用Sphgen分析潜在结合位点，并根据NMR滴定研究中报告的化学位移扰动选择NBD的一个区域(27). 围绕结合位点在各个方向上生成一个6°的方框，并使用grid生成划线网格。用Szybki制备JG98和YM-01的低能构象，并使用AM1-BCC力场计算UCSF Chimera中的部分电荷。配体通过弯曲锚定和旋转方法对接。在结合位点的初始姿势生成和定位后，使用柔性配体对接的默认评分参数用琥珀色重新取芯配体。
酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA是根据先前公布的方法进行的(24). 简单地说，Hsc70被固定在ELISA微孔板中，并用生物素化化合物处理（参见补充信息). 洗涤后，使用链霉亲和素辣根过氧化物酶测量结合材料。阴性对照包括缺乏Hsc70和缺乏生物素的JG98的水井。
流式细胞术蛋白质相互作用分析（FCPIA）
将生物素化的Hsp72固定在聚对苯二甲酸链霉亲和素包被的珠粒（Spherotech）上，与Alexa Fluor®488标记的Bag1、Bag2或Bag3（50 nM）和缓冲液A中增加量的JG-98或YM-01（25 mM HEPES，5 mM MgCl2，10 mM KCl，0.3%吐温-20 pH 7.5）。培养平板15分钟，然后使用Hypercyt液体取样装置和Accuri®C6流式细胞仪进行分析。通过测量中值珠相关荧光检测蛋白复合物抑制。DMSO用作阴性对照，过量的未标记Hsp70（1μM）用作阳性对照。
共免疫沉淀
在M-PER裂解缓冲液（Thermo Scientific）中制备HeLa细胞提取物，并将其调节为1 mL提取物中的5 mg总蛋白。用兔多克隆Hsp70（Santa Cruz H-300）或山羊IgG（Santa Cruz sc-2028）培养等量500μL样品。样品接受5μL二甲基亚砜（1%）或5μL JG-98或YM-01（5 mM），使最终JG-98/YM-01浓度达到50μM。样品在4°C下轻轻旋转过夜，然后与蛋白a/G-Sepharose Beads（Santa Cruz）孵育4小时。免疫复合物以1000×g离心，用pH 7.4的PBS洗涤3次，并用SDS负载染料洗脱。样品在4–15%Tris-Tricine凝胶（Bio-rad）上分离，并转移到硝化纤维素膜上。将膜在脱脂牛奶（TBS中5%的牛奶，0.1%吐温）中封闭1小时，在4°C下与Hsp70（圣克鲁斯sc-137239）和Bag3（圣克鲁兹sc-136467）的一级抗体孵育过夜，清洗，然后与辣根过氧化物酶结合二级抗体（Anaspec）孵育1小时。最后，使用化学发光（Thermo Scientific，Supersignal®West Pico）开发膜。
动物毒性研究
经常用于多发性骨髓瘤研究的NSG小鼠每周（周一和周四）两次腹腔注射JG-98或PBS:DMSO 1:1载体（100μL），持续2周。每2天测量一次体重，并密切监测小鼠是否有任何毒性或不适症状。最后一次给药24小时后，通过心脏穿刺采集血样（300μL）用于血浆，并送去进行综合化学分析。
药物动力学
NSG小鼠（每组三只）腹腔内注射100μL JG-98或PBS:DMSO 1:1溶媒溶液。在第1、3、8和24小时的时间点通过尾静脉采集血样以获取血浆。使用已发布的方案，通过LC-MS测定血浆中的JG-98浓度(24).
异种移植物
如前所述，在裸鼠中测试JG-98的抗肿瘤效果(12). 简单地说，将Matrigel中的100万MCF7或HeLa细胞双侧皮下注射到6周龄NCR小鼠（Taconic）中。建立肿瘤后，在第2天、第4天和第6天腹腔注射JG-98（3 mg/kg；n=5）或溶媒对照（1:1 PBS:DMSO；n=6）。每隔一天用卡尺测量肿瘤生长（10个肿瘤/5只小鼠）。中的图显示平均肿瘤体积，误差条代表SEM。
JG-98在MCF7和HeLa异种移植模型中具有活性。JG-98用（A）MCF7细胞或（B）HeLa细胞异种移植治疗小鼠。实验细节见材料和方法。箭头表示使用JG-98进行治疗。（C） 分离来自A组的处理过的样品，并通过Western印迹法测量三只单独动物的选择信号蛋白水平。
结果
Hsp70-Bag3复合物的分析和JG-98作为可能的化学探针的选择
Bag3与Hsp70的核苷酸结合域结合，从伴侣中释放客户蛋白并对抗蛋白酶体介导的降解(28) (29) (). 基于与其他Bag域蛋白的同源性(30)，Bag3被预测与Hsp70的IB和IIB亚结构域相互作用(; 青色）。然而，在ADP的存在下，Hsp70-Bag3相互作用的亲和力显著减弱（13倍）(29)这表明稳定Hsp70的ADP结合状态可能是变构阻断Hsp70-Bag3接触的一种方式。巧合的是，我们最近确定了一个化学系列，以YM-01和JG-98为例()，与Hsp70结合并以ADP结合形式稳定它(31). 因此，该系列分子可能会破坏Hsp70-Bag3相互作用的稳定性().
JG-98是一种改良的Hsp70变构抑制剂。（A） Bag3如何通过将客户端从Hsp70复合体中释放出来来保护客户端免受降级影响的模型。在此模型中，预计JG-98通过阻断Bag3与Hsp70的结合来增强癌症信号蛋白的周转。详见正文。（B） JG-98在Hsp70的核苷酸结合域的变构口袋中结合。该位点（绿色）与核苷酸结合间隙（紫色）、Bag3相互作用基序（青色）或其他蛋白质相互作用区域（黄色）不重叠。标记了子域（IA、IIA、IB、IIB），并显示了JG-98装订袋的特写，以及化合物的对接姿势。（C） 通过ELISA测定，JG-98与纯化的Hsp70结合。为了清楚起见，显示了该方法的示意图。结果是至少三个独立重复的平均值，每个重复三次。误差条代表平均值的标准误差（SEM）。
JG-98与Hsp70紧密结合，并利用了之前未开发的口袋
为了了解JG-98如何影响Hsp70-Bag3相互作用，我们首先将JG-98对接到高度保守的亚型Hsc70（HSPA8）（pdb:3C7N）的开放构象中（参见材料和方法）。该对接基于JG-98的已知结合位点，该结合位点先前由TROSY-HSQC NMR测定(24,27). 在最具预测力的模型中，JG-98被固定在一个深口袋中()由Hsc70的核苷酸结合域（NBD）中的残基G11、Y14、L199、G200、G201和V336形成。这些残基似乎与苯并噻唑具有良好的疏水相互作用。附近的残基富含带负电荷的氨基酸，包括D9、D68、D85、E174、D198、D205、D224和D365，这些氨基酸似乎与离域阳离子有良好的静电相互作用。最后，中心环中的羰基似乎与F204和D205中的主链酰胺形成氢键。JG-98中的苄基（YM-01中不存在）伸入由V81、P146、Y148和F149形成的相邻口袋。重要的是，该结合位点与Hsp70中的核苷酸结合盒、Bag相互作用基序或其他PPI位点没有重叠()，支持JG-98的变构活性。
发现JG-98与V81、P146、Y148和F149有额外接触，表明JG-98可能比YM-01与Hsp70结合更紧密。为了验证这个想法，我们合成了生物素化版本的YM-01和JG-98（参见补充图1)并使用ELISA检测其与固定化Hsp70的直接结合。结果表明，JG98生物素（KD类86 nM）比YM01生物素（KD类5800±700纳米）().
JG-98在体外和细胞内阻断Hsp70-Bag3 PPI
接下来，我们测试了JG-98是否可以阻断Hsp70-Bag3相互作用在体外使用流式细胞术蛋白相互作用分析（FCPIA）。在这种方法中，将Hsp70固定在珠子上，并测量其与荧光标记的Bag3的结合。结果表明，JG-98对Hsp70和Bag3的相互作用有较强的抑制作用，且具有IC501.6±0.3μM，明显优于YM-01（IC50值>100）(). 由于Bag结构域在相关家族成员Bag1和Bag2中是保守的，我们还测试了JG-98和YM-01是否可以抑制这些PPI。与Bag3结果一致，JG-98是Hsp70-Bag1和Hsp70-Bag2复合物的良好抑制剂，具有IC50值分别为0.6±0.1和1.2±0.1μM(); 而YM-01抑制了这些与IC的相互作用50值分别为8.4±0.8和39±4μM。
JG-98是Hsp70和Bag3之间蛋白质相互作用的改良抑制剂。（A） 通过流式细胞术测定，JG-98阻断了固定化热休克蛋白70与标记的Bag3的相互作用。结果是一式三份的三个独立实验的平均值。误差条代表SEM，一些条小于符号。阳性对照是未标记Hsp70的过量，阴性对照是DMSO。（B） JG-98通过联合免疫沉淀抑制Bag3-Hsp70相互作用。对Hsp70进行免疫沉淀，并对结合Bag3进行印迹。印迹是三次实验的代表，定量是这些实验的平均值。误差条代表SEM。
为了测试JG-98是否能破坏细胞内的Hsp70-Bag3相互作用，在JG-98（50μM）、YM-01（50μM）或DMSO载体对照物存在下，从HeLa细胞中免疫沉淀Hsp70，并对Bag蛋白进行免疫印迹。JG-98和YM-01都将Hsp70-Bag3相互作用降低了约60%(和补充图2).
JG-98通过破坏Hsp70-Bag3功能抑制癌细胞生长
然后在一组来源于乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、卵巢癌和骨髓癌的细胞中评估JG-98的细胞毒性作用(补充图3). 每个细胞株暴露于JG-98 72小时和EC50使用MTT细胞增殖试验测定值。JG-98对所有测试品系都有效，但EC50值是可变的（在0.3和4μM之间）(). 正常小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）相对不敏感（EC504.5±0.5μM），但也有许多多发性骨髓瘤衍生细胞系，如OPM1和OPM2。目前尚不清楚为什么有些细胞更敏感或更不敏感，但对包括MCF7和HeLa在内的一部分癌细胞株的亚微摩尔活性令人鼓舞。
JG-98具有抗增殖活性。（A） 对一组癌细胞株进行的抗增殖试验结果。结果是至少两个独立实验的平均值，每个实验一式三份。误差条代表SEM。（B）JG-98影响先前与Hsp70-Bag3连接的癌症信号蛋白，它降低了FoxM1和HuR，并增加了p21和p27。结果代表了一式三份的实验。
已知Hsp70-Bag3复合物通过多种途径调节癌细胞转移和生存，包括通过FoxM1和HuR转录因子(12). 与此作用一致，JG-98治疗降低了MCF7乳腺癌细胞中FoxM1和HuR的水平，同时增加了细胞周期抑制剂p27和p21的水平(). 这种效应反映了在这些细胞中Bag3被击倒时所看到的情况(12).
JG-98在小鼠体内的药代动力学和毒性评价
接下来，我们想用JG-98作为探针来探索小鼠体内的Hsp70-Bag3复合物。给NSG小鼠腹腔注射JG-98，每周两次，共2周，分3种不同剂量（0.3、1和3 mg/kg）。剂量为1:1 DMSO:PBS，作为载体对照。最后一次给药后，采集血样并评估血浆中的JG-98浓度。通过HPLC，在3 mg/kg剂量下1小时后，血浆中JG-98的水平达到~70 nM(和补充图3A). 在解释这些发现时必须小心，因为已知JG-98的前体在肿瘤细胞中以100倍的高浓度积聚体内(32). 在所有三种剂量下，终端半衰期计算为大约20小时(和补充图4A).
JG-98在小鼠体内的药代动力学和耐受性。如文中所述，JG-98经腹腔注射。（A） 三剂JG-98的药代动力学。使用PKSolver计算关键参数。（B） 在这些条件下，在接受治疗的小鼠中未观察到明显的体重减轻。每个治疗组使用三只小鼠。误差条代表SEM。
本系列中的早期类似物MKT-077因其肾脏蓄积而在一期临床试验中被放弃(33). 因此，我们想特别注意JG-98的潜在毒性。在治疗动物中未观察到明显的体重减轻（<10%）(). 在最后一次给药后，还收集血样并筛选肝和肾功能的生物标记物。我们发现血尿素氮（BUN）和肌酐水平在所有三种剂量下均正常，表明肾功能没有受到影响(补充图4B). 同样，肝功能标志物丙氨酸氨基转移酶和总胆红素也在正常范围内(补充图4B).
JG-98对异种移植模型中的MCF7和HeLa细胞具有活性
测试JG-98的功效体内，在裸鼠中建立MCF7细胞的异种移植物，肿瘤达到100 mm后三，化合物在第0、2和4天腹膜内给药。我们发现，直到第6天，3 mg/kg的剂量限制肿瘤生长()但在药物服用结束后，肿瘤似乎又开始生长。类似地，JG-98（3 mg/kg）在HeLa异种移植物模型中抑制肿瘤生长，尽管效果稍差(). 当对MCF7异种移植物研究中的肿瘤样本进行均质化并测试其对癌症信号标志物的影响时，结果与培养的MCF7细胞中的结果相似；具体来说，p21显著升高，而HuR和FoxM1趋于降低(). 综上所述，这些验证结果表明，Hsp70-Bag3 PPI可能是一个有希望的进一步勘探目标。
讨论
在不断寻找新的癌症靶点的过程中，出现了许多有希望的PPI(17,18). 此外，变构抑制剂通过利用远离蛋白质接触部位的深层结合囊，使得阻断似乎难以靶向的PPI成为可能(20). 在这项工作中，我们使用了一种Hsp70-Bag3相互作用的变构抑制剂JG-98来研究PPI是否可能成为一个新的药物靶点。我们发现JG-98中断了Hsp70-Bag3的相互作用在体外和细胞内。在这项任务中，JG-98比YM-01有效得多，可能是因为它能够接近变构结合囊附近之前未充分开发的接触组。此外，JG-98在动物体内比YM-01更稳定，因此它是研究Hsp70-Bag3复合物重要性的合适化学探针体内.
我们发现，JG-98影响了先前与Hsp70-Bag3复合物相连的多种信号蛋白的稳定性。具体而言，我们注意到JG-98治疗导致FoxM1和HuR的丢失，p21和p27相应增加。这是如何发生的？Bag3可能正常抑制Hsp70介导的FoxM1和HuR降解（如). 因此，抑制Bag3结合有望加快这些蛋白质的周转。然而，值得注意的是，除了此处研究的蛋白质外，其他途径可能有助于JG-98的抗增殖活性。例如，Hsp70和Bag1之间的复合物与Raf1/ERK的调节有关(34)因此，JG-98治疗可能会影响细胞骨架动力学、侵袭和其他途径(35). 要了解Hsp70和Bag家族成员与细胞死亡之间的全部联系机制，还需要进一步研究。我们建议，JG-98的可用性将大大促进这些查询。
致谢
资金：这项工作由Steven and Nancy Grand Multiple Myeloma Translational Initiative（给B.T.Aftab）、Howard Hughes Medical Institute（给J.Gestwicki、P.Walter和J.Weissman）以及NIH CA081244（给M.Y.Sherman）、NS059690（给J.E.Gestwick）和K99CA181494（给M Kampmann）资助。
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