从体素到知识：复杂电子显微镜三维数据分割实用指南

摘要

介绍

传统上，电子显微镜（EM）领域被分为1）使用高分辨率和超高分辨率TEM的结构生物学分支，通常结合隐式或显式数据平均来研究三维（3D）具有特定组成且通常尺寸相对较小的大分子络合物的结构^1-4和2）细胞成像分支，在该分支中可以可视化整个细胞场景^1,5,6虽然结构生物学分支在过去四十年里取得了令人瞩目的发展，但细胞生物学分支大多局限于二维，通常是在保存得不太理想的样品上。只有在过去十年里，随着电子断层扫描技术的出现，细胞生物超微结构成像才扩展到三维^5,7，其中通常无法进行平均，因为蜂窝场景，因此感兴趣的特征通常是唯一的。

尽管可视化的细胞场景通常令人目不暇接，但高效提取感兴趣的特征以及随后对如此复杂的细胞体积进行定量分析的工作却落后了，部分原因是精确的蛋白质组成通常未知，因此，解释这些细胞3D体积具有挑战性。到目前为止，为了解释复杂的断层图像，甚至识别3D体积中的重要区域和基本成分，通常需要广泛的生物学专业知识。更复杂的是，三维体的可视化非常简单。3D体积可以被认为是2D图像的堆叠，因此可以可视化。序列2D图像的逐层检测降低了复杂性，但也限制了特征提取，从而限制了对二维图像的定量分析。然而，对于大多数3D对象来说，将3D体积描述为连续平面的堆叠，会导致对特定系统的3D本质的透视不完整和倾斜。视觉检查的替代模式需要体绘制或表面绘制，由于细胞体通常具有稠密的特性，因此很容易导致嵌套对象的视图受阻或用户完全被淹没，因此很难进行交互式手动分割。

为了弥补这些障碍，已经开发了多种自动特征提取（分割）方法，这些方法通常基于密度或梯度^8-10然而，这些方法倾向于分割整个体积，而不管专家对哪个区域或特征感兴趣，尽管一些最近的方法可以针对特定的感兴趣特征，例如肌动蛋白丝¹¹此外，执行自动分段的程序有时会产生大量子卷(例如应用分水岭浸没分割时），通常需要手动合并回包含感兴趣的整个特征或进行进一步分割。这一点尤其适用于复杂和拥挤的数据集，因此大多数渲染计算机算法无法准确地提取感兴趣的特征，并且通常需要专家的大量管理工作才能生成所需的分段体积。

此外，针对高度特定问题的定制解决方案通常以科学会议论文的形式发布，很少或根本没有强调让那些对数学、计算机科学和/或计算机图形学领域缺乏深入了解的研究人员能够使用这些广泛而全面的工具。一个包含一系列图像分析库的可定制编程软件环境是一个强大的工具集，它允许用户高效地编写自己的模块以实现准确的分割。然而，这种方法需要广泛的培训和计算机科学背景，才能利用其许多特征或能力进行图像分析。对于特征更稀疏的某些数据集，可以在这样的通用软件环境中工作，例如通过使用强大的基于形状的方法，这种方法依赖于“模板”的独特几何形状来将感兴趣的对象与其周围环境分离^12,13.

有多种计算机图形可视化软件包可用于交互式手动分割和模型构建。一些软件包是商业化的，而其他软件包是学术性的，并且是免费分发的，例如：加利福尼亚大学旧金山分校奇梅拉（University of California San Francisco Chimera）¹⁴科罗拉多大学IMOD¹⁵和德克萨斯大学奥斯汀分校VolumeOver¹⁶然而，这些程序所具有的特性和功能的广泛性和复杂性使每个程序的学习曲线变陡。某些可视化程序提供简单的几何模型，例如各种尺寸的球和棒，可以将其放置在密度图中，以创建复杂3D体积的简化模型。这些模型可以进行简单的几何和体积测量，因此超越了“美丽的画面”。这种手动跟踪对象的方法适用于只需要跟踪和提取少量对象的卷。然而，最近使用聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）进行大体积三维超微结构成像的发展^17-20或连续块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）²¹3D数据集的大小可能从千兆字节到数十千兆字节甚至数百千兆字节，这带来了额外的复杂性。因此，手动特征提取几乎无法实现如此大的三维体，因此在可预见的未来，高效的用户引导的半自动特征提取将成为高效分析三维体的瓶颈之一。

这里介绍了四种常用于多种生物图像类型的不同分割方法。然后比较这些方法对不同类型数据集的有效性，将其汇编成指南，以帮助生物学家确定对自己的数据进行有效特征提取的最佳分割方法。由于所描述的大多数程序都有详细的用户手册，其目的不是让潜在用户熟悉这些特定软件包中的任何一个。相反，我们的目标是通过将这些不同的细分策略应用于六个具有不同特征的示例数据集，来展示这些不同细分策略的各自优势和局限性。通过这种比较，已经制定了一套标准，这些标准要么基于3D数据集的客观图像特征，例如数据对比度、清晰度、拥挤度和复杂性，要么源于主观考虑，例如分割的理想目标、待分割特征的形态，感兴趣特征的人口密度，即感兴趣特征所占体积的比例，以及如何利用有限的资源（如时间和人员可用性）进行优化。这些不同的示例数据集说明了如何在各种组合中顺序应用这些客观和主观标准，以产生特定特征提取方法与特定类型数据集的配对。所给出的建议有望帮助面临各种分割选项的新手为自己的3D体积选择最有效的分割方法。

虽然本文的重点是特征提取，但关注数据收集和预处理数据对有效分割至关重要。通常情况下，样本的染色可能不均匀，因此，在分割过程中应考虑潜在的染色伪影。然而，染色通常会产生较高的信噪比，因此需要较少的滤波和对细胞体积的其他数学处理，这也可能导致伪影。需要以正确的对比度和相机像素设置获取相应的原始图像数据集，对齐并重建为3D体积。对于层析图像，通常使用加权反向投影重建对齐图像，然后数据集通常采用非线性各向异性扩散等去噪算法²²，双向过滤²³，或递归中值滤波²⁴FIB-SEM和SBF-SEM成像数据通过利用诸如ImageJ之类的程序在XY中交叉相关连续切片来对准²⁵对比度增强和过滤可用于增强感兴趣的特征，从而对图像堆栈进行去噪。可以在选择子卷之前在整个卷上执行过滤，也可以在选定的子卷上执行，因为过滤方法的计算成本可能很高。只有当数据与预期分辨率相比明显过采样时，才建议对数据进行下采样（装箱），这有时用于减少噪音和/或文件大小。

降噪后，处理后的图像可以通过各种方法进行分割，本研究的重点是以下四个方面：（1）通过创建球棒模型手动生成抽象模型，（2）手动跟踪感兴趣的特征，（3）自动基于阈值的密度，（4）通过用于特定项目分段的脚本进行自定义的自动分段。边界分割⁸和沉浸式流域分割¹⁰是简单阈值的更好替代方案，但它们属于同一类别，并且没有明确包括在本讨论中。

手动追踪密度需要勾勒出感兴趣的特征，即切片-切片，这允许保留相应亚细胞区域的原始密度。这种方法允许对分割过程进行最大程度的控制，但这是一个繁琐且劳动密集的过程。

基于阈值的（和相关的）自动密度分割方法是半自动的，其中算法基于一组用户定义的参数选择像素。几个学术（免费）可视化软件包，如UCSF Chimera、IMOD、斐济²⁶、和VolumeOver以及商业（需要付费许可证）软件包都可用，这两种类型通常都包含一种或多种细分方法。本工作中用于说明这些不同方法的软件包包括用于手动生成抽象模型的商业程序和学术开源程序，以及手动和自动密度分割。然而，开源软件有时可以通过定制的可能性提供更高级的选项。

通过使用不同类型的数据集对这些技术进行比较，得出了以下关于如何分割不同生物数据三维体的规则和指南，据我们所知，这些规则和指南尚未发表。因此，这是首次对不同方法及其在具有不同特征的数据集上对具有不同目的的用户的有用性进行系统比较。

协议

具有代表性的结果

图1显示了3D电子显微镜细胞成像的典型工作流程，包括电子断层扫描、FIB-SEM和SBF-SEM。该工作流程包括原始数据收集、数据对齐和重建为3D体积、通过过滤降低噪音，以及在必要时，裁剪到感兴趣的区域，以便最大限度地提高所选分割软件的效率。这样的预处理数据然后准备用于特征提取/分割。

图2说明了中的工作流程图1使用四个不同的数据集（将在下文中进一步介绍），其中两个是电子断层扫描记录的树脂嵌入样本(图2A,2B型)，其他两个分别来自FIB-SEM和SBF-SEM(图2C,二维). 中的图像图2第1列是投影视图(图2A1,2B1型)和块表面图像(图2C1,二维图1)分别在对齐和重建后组装成3D体积。第2列显示了通过这种三维体的切片，过滤后（第3列）显示出噪音显著减少，因此通常看起来更清晰。在选择并将大型三维体裁剪到感兴趣的区域（第4列）后，可以获得感兴趣的分段特征（第5列）的三维渲染，并进行进一步检查、颜色编码和定量分析。

共有六个3D数据集，每个数据集包含通过电子断层扫描（3个数据集）、FIB-SEM（2个数据集(图3). 这些数据集来自实验室中的各种不同研究项目，因此提供了一组合理多样的典型实验数据集。所有数据集都由四名独立研究人员进行了检查，他们每个人都最熟悉一种特定的方法，并负责为六个数据集中的每一个提供最佳的可能结果。

数据集来自以下样本：1。图3A1-3A5：高压冷冻、冷冻替代和树脂包埋鸡内耳毛细胞静纤毛³¹, 2.图3B1-3B5：高压冷冻、冷冻替代和树脂嵌入植物细胞壁（未出版），3。图3C1-3C5：高压冷冻、冷冻替代和树脂包埋内耳毛细胞激肽（未出版），4。图3D1-3D5：位于人类乳腺上皮细胞HMT-3522 S1腺泡中的线粒体高压冷冻、冷冻替代和树脂包埋块，这些细胞在富含层粘连蛋白的细胞外基质中培养^32,33, 5.图3E1-3E5：硫酸盐还原剂细菌生物膜（手稿正在准备中）的未经染色的台面处理的树脂嵌入块，以及6。图3F1-3F5HMT-3522 S1腺泡相邻细胞的膜边界。

从中可以看出图3不同的分割方法可能会导致某些数据集类型的结果大致相同，但对于其他数据类型的结果完全不同。例如，毛细胞静纤毛数据集(图3A)使用所有四种方法产生合理的分割量，由专家用户生成的手动抽象模型最容易解释和测量。在这种情况下，这种模型可以快速测量丝状纤维的距离，计算细长丝状纤维之间的连接数，以及确定与样品制备过程中损坏的位置相对应的密度图中缺失的部分³⁴。使用其他三种分割方法获取此类信息要困难得多，尽管定制的自动分割比纯粹的基于密度的阈值分割提供更好的结果。

对于植物细胞壁(图3B)，手动模型生成似乎是在细胞壁中传递秩序感的最有效方法，而其他方法都无法实现这一点。然而，抽象模型并没有捕捉到数据集中对象的拥挤程度。手动跟踪感兴趣的特征似乎比基于密度或形状监督的方法效果更好。另一方面，手动跟踪非常费力，识别特征边界有点主观。因此，自动化方法可能是分割大型卷的首选方法，可能需要在精度和手动分割所花费的资源之间进行权衡。

对于kinocilium数据集(图3C)人工抽象模型生成产生了最清晰的结果，并揭示了激肽菌中心三个微管的意外结构，这一细节在裁剪数据中很容易看到，但在所有其他方法中都丢失了，可能是由于染色异质性。然而，在手动生成抽象模型时，密度图的其他潜在关键特征被忽略了。这是由于人工模型形成的主观性质导致实际观测密度的理想化和抽象化，从而导致模型形成期间的主观解释。因此，这个例子很好地展示了手工抽象模型生成如何让人们集中精力于3D体积的特定方面。然而，选择性感知和简化未能充分说明数据集中存在的所有蛋白质复合物。因此，如果目标是显示数据的复杂性，那么使用其他三种方法中的任何一种都会更好。

以3D基质培养乳腺腺泡为例(图3D)高对比度线粒体可通过所有四种方法轻松分割，手动追踪特征也不足为奇，以最低的污染量获得最佳结果(图3D3). 然而，手动跟踪非常劳动密集型，因此对大容量的使用有限。基于密度阈值的分割和形状监督的自动分割都能很好地提取线粒体，如果采用进一步的清理技巧，则可以实现近乎完美的分割(例如，消除低于特定体素密度阈值的所有对象）。在这种情况下，人工抽象模型构建并没有产生有希望的结果，部分原因是线粒体不容易用球棒模型来近似。

关于细菌土壤群落/生物膜(图3E)四种方法中有三种产生了合理的结果，由于难以通过几何形状来表示生物对象（如细菌），手动模型生成的表现不佳。源于细菌的胞外附属物可以在自动分割方法中检测到，但在手动特征跟踪中检测不到。尽管细菌密度相似（数据未显示），但形状管理的定制定制自动分割可以进一步分离细菌的细胞外特征，即使是超大数据集也可以轻松量化。由于这最初是一个非常大的数据集，定制的自动分割明显优于所有其他方法，但可能得益于感兴趣对象的低复杂性和相对稀疏的分布（低拥挤度）。

在组织样环境中检查两个真核细胞之间的界面时(图3F)，只有手动跟踪感兴趣的特征才能产生良好的效果。基于密度的自动分割方法无法完全检测到相邻细胞之间的膜边界，甚至定制的方法也无法检测到，部分原因是细胞的形状不容易近似或等同于形状，尽管它对生物膜中的细菌有明显的帮助(图3E5).

观察结果来自图3分割方法在某些数据集上表现良好，但在其他数据集上却表现不佳，这导致了一个问题，即每个数据集的特征是什么，以及是否可能对数据特征的类型或与各自方法匹配良好的个人目标进行分类。以前还没有对这个主题进行过系统的研究，因此作为第一步，建立图像特征和个人目标的经验列表可以指导新手尝试找到对各自数据集进行特征提取的最佳方法。

确定了八项重要标准，如图4它们可以分为两大类：（1）数据集中固有的特征，以及（2）研究人员的个人目标和其他考虑因素，这些考虑因素虽然同样重要，但更具主观性。所示示例主要取自图3，引入了三个附加数据集：一个(图4A1)是一个冷冻切片的冷冻图谱拟南芥植物细胞壁，第二(图4A2,4B1类,4D1型)是内耳血管纹的FIB/SEM数据集图3F1-3F5但更为复杂，第三个(图4B2,4D2型)是内耳毛细胞静纤毛横切面上的树脂切片层析图，与纵切面上显示的样品含量类似图2A1-2A5和3A1-3A5型.

对于像图像特征这样的客观标准类别，提出了数据集中固有的四个重要特征：

1. 数据对比度可能（1）低(图4A1)这是典型的低温电子显微镜断层扫描，（2）中间(图4A2)例如在没有明显细胞器或其他显著特征的细胞中，或（3）高(图4A3)与动纤毛断层图或横切面上的静纤毛一样，这是由于在z方向上排列着明显分离的丝状元素。
2. 数据可能是模糊的(图4B1)在两个位置相近的物体之间没有明显的清晰边界，例如组织中的细胞或脆的(图4B2)边界清晰。这在一定程度上是数据集分辨率的函数，与FIB-SEM相比，电子层析图的分辨率本质上要高出约2-4倍。自然，更清晰的边界对于手动和自动分割方法都是可取的，但对于后一种方法至关重要。
3. 密度图可以是拥挤的(图4C1)如紧密间隔的植物细胞壁组件所反映的，或人口稀少(图4C2)就像菌落中的细菌一样，这种分离方式使得自动图像分割变得更加容易。
4. 密度图可能非常复杂，具有截然不同的特征，通常具有不规则的形状，例如血管周围的血管纹组织(图4D1)或具有类似组织的定义明确的细胞器样物体，如横截面上的静纤毛(图4D2).

还请注意所有不同示例中的刻度差异很大，这使得比较有些困难。

除了图像特征等更客观的标准外，还提出了四个高度主观的标准，用于指导选择合适的路径：

1. 期望的目标：目的可能是可视化发束立体纤毛的复杂性，并确定和检查物体的形状(图4E1)，或创建一个简化和抽象的球杆模型，该模型内置于密度图中，允许快速计数和测量几何对象（细丝长度、距离和连接数量）(图4E2).
2. 特征形态可以是高度不规则和复杂的细胞，如细胞间相互作用区(图4F1)形状有些相似，但也有一些变化，如线粒体(图4F2)，或形状大致相同，例如肌动蛋白丝和纵向发束中的交叉链接(图4F3).
3. 感兴趣特征（种群密度）的比例很重要，因为人们可能希望在3D数据集中分割所有特征，就像植物细胞壁的情况一样(图4G1)或者只是细胞体积的一小部分，就像异质细胞中的线粒体一样(图4G2). 根据数据集的大小和需要分段的卷的百分比，使用手动方法可能是最有效的。在其他情况下，例如当人们对各种特征感兴趣时，除了使用半自动分割方法之外，别无选择。
4. 另一个关键的主观标准是人们愿意投入到分割过程中的资源数量，以及回答生物问题所需的保真度。人们可能需要量化特征的体积参数（例如尺寸、体积、表面积、长度、与其他特征的距离，等。)在这种情况下，可能需要更加小心才能获得准确的定量信息(图4H1)，或者目的可能仅仅是捕捉其3D形状的图片(图4H2). 在一个资源无限的理想世界中，人们显然不想做出任何妥协，而是选择用户辅助的手动特征提取的最准确路径。虽然这对许多数据集都有效，但在不久的将来，3D体积将达到10k×10k×1k或更高的数量，手动分割将不再能够在分割如此巨大的空间方面发挥重要作用。根据数据和其他数据特征的复杂性，半自动分割可能成为必要。

在图5简要列出了这四种分割方法的优点和局限性。个人目标和形象特征图4还概述了可以与每种方法配对的方法。在图6六个数据集的个人目标和图像特征举例说明了如何对数据进行分类并确定最佳方法。两者都有图5和6在讨论中进行了扩展。

图1.生物成像重建和分析的工作流程。此图表概述了为收集和处理通过断层扫描、聚焦离子束SEM和串行块面SEM收集的图像而采取的各种步骤。原始数据收集结果为2D倾斜系列或串行截面。这些二维图像集必须对齐并重建为三维图像，然后进行滤波，以减少噪声并增强感兴趣特征的对比度。最后，可以对数据进行分割和分析，最终生成3D模型。请单击此处查看此图的放大版本。

图2.层析成像和FIB-SEM不同数据类型的工作流示例。数据收集后的工作流程的每一步都通过四个数据集（A-D行）显示：垂直切片静纤毛的树脂包埋染色层析成像、植物细胞壁纤维素的树脂包藏染色层析成像，乳腺上皮细胞线粒体的FIB-SEM和大肠杆菌细菌。原始数据的二维切片如第1列所示，对齐和三维重建后的数据图像包括第2列。第3列中应用的滤波技术如下：中值滤波器（A3）、非各向异性扩散滤波器（B3）、高斯模糊（C3）和MATLAB的imadjust滤波器（D3）。从感兴趣的裁剪区域（列4）中的每个数据集的最佳分割的示例在列5中显示为3D渲染。比例尺：A1-A3=200 nm，A4=150 nm，A5=50 nm，B1-B3=200纳米，B4-B5=100 nm，C1-C3=1 mm，C4-C5=500 nm，D1-D3=2 mm，D4-D5=200 nm。请单击此处查看此图的放大版本。

图3.四种分割方法在示例数据集中的应用。六个示例数据集被所有四种方法分割：手动抽象模型生成、手动跟踪、基于密度的自动分割和自定义自动分割。人工抽象模型生成对于树脂嵌入的静纤毛染色层析成像（A）是有效的，因为其目的是为了创建用于定量目的的模型，而不是提取密度。对于植物细胞壁的树脂包埋染色层析成像（B），基于密度的自动分割是通过多个切片快速提取纤维素的最有效方法，因为手动方法只需要花费更多的精力在几片数据上。人工抽象模型生成在激肽菌（C）的染色层析成像中生成微管三联体，而其他分割方法没有生成，但这两种自动方法提取密度更快，因此是首选方法。由于乳腺上皮细胞（D）FIB-SEM中线粒体的形状，手工追踪提供了最清晰的结果，低密度的种群结合使用插值方法可以快速分割。鉴于需要分割的体积很大，定制的自动分割被证明是分割SBF-SEM细菌数据（E）的最有效方法，但这两种自动方法具有可比性。虽然耗时，但提取乳腺上皮细胞膜（F）FIB-SEM的唯一方法是手工追踪。比例尺：A1-A5=100 nm，B1-B5=100纳米，C1-C5=50 nm，D1-D5=500 nm，E1-E5=200 nm，F1-F5，棒材=500 nm。请单击此处查看此图的放大版本。

图4.数据集分类的客观图像特征和主观个人目标。使用数据集特征的示例，提出了标准，以告知决定使用哪种分割方法。就客观特征而言，数据可以固有地具有低、中或高对比度（A1-A3）、模糊或清晰对比度（B1-B2）、间隔或拥挤对比度（C1-C2）以及复杂或简单组织特征（D1-D2）。主观个人目标包括以简化模型为目标或提取准确密度（E1-E2）的期望目标，将卷曲的薄片、卷曲的体积或线性形态识别为感兴趣的特征（F1-F3），选择感兴趣特征的高或低人口密度（G1-G2），并决定在高保真度和高资源分配之间进行权衡，以减少投资回报，如时间（H1-H2）。比例尺：A1=50 nm、A2=1500 nm、A3=100 nm、B1=1500 nm，B2=200 nm、C1=100 nm，C2=200 nm，D1=10 mm，D2=200纳米，E1=100纳米，E2=50 nm，F1-F2=500 nm，F3=50纳米，G1=100 nm，G2=1 mm，H1-H2=100 nm。请单击此处查看此图的放大版本。

图5。 适用于不同分割方法的数据特征和主观目标对照表。此表总结了每种细分方法的优点和局限性。标准来自图4可以帮助确定哪些数据集适合于哪种分割方法。选择这些客观图像特征和主观个人目标是为了优化每种方法的使用，但不同的组合可能会妨碍或有助于分割的效率。请单击此处查看此图的放大版本。

图6具有不同特征的数据集的有效分割方法分类的决策流程图。基于中突出显示的特征图4，此图说明了哪四个标准对最终决定每个数据集的最佳分割方法贡献最大图3。每个数据集都进行了颜色编码，以快速跟随代表主要决策过程的粗体线，以及反映可能会或可能不会导致相同方法的替代路径的虚线。用这两种自动化方法对激肽菌、细菌和植物细胞壁数据集进行了最佳分割。相比之下，细胞膜和线粒体路径由于其困难的特性，总是需要人工追踪。请单击此处查看此图的放大版本。

讨论

为了跟上最近袭击生物成像的数据海啸，迫切需要从3D EM体中提取相关特征的有效策略。虽然数据可以在数小时或数天内生成，但深入分析3D体积需要数月时间。因此，很明显，图像分析已经成为科学发现的瓶颈；如果没有足够的解决方案，成像科学家就会成为自己成功的受害者。这在一定程度上是由于数据的高度复杂性，以及生物细胞中通常存在的大分子拥挤，在生物细胞中，蛋白质和蛋白质复合体相互毗邻，基本上表现为灰度密度的连续梯度。样品制备和成像缺陷以及在某些情况下的图像重建伪影使问题变得复杂，导致体积数据不够完美，这可能给全自动方法带来挑战。然而，最重要的是，样本制备、成像和生物解释方面的专家很少精通计算科学，因此需要指导如何有效地进行特征提取和分析。因此，通过使用各种示例，该协议解释了如何为分割准备数据，以及手动抽象模型生成、自动基于密度的分割、手动跟踪感兴趣的特征以及自定义自动分割的步骤。程序中概述的手动和自动方法可以在多种分割软件中找到，其中一些在这里提到，但其他执行类似功能，也同样适用。

结果表明，对于不同类型的数据集，每种3D分割方法的有效性都不同。尽管不同的方法产生了与最终产品质量类似的3D渲染，但在分割过程中，每种方法所花费的时间和精力都有很大差异。针对每种分割方法的适当图像特征和个人目标的建议总结如下图5，这将在以下四个小节中进一步解释。这些标准适用于六个数据集，如决策流程图所示图6.尽管图5和6仅仅是为了为每个数据集提供一个基本原理，以及在决策过程中如何对每个标准进行加权，它们并没有提供一个万无一失的指导，而是一个起点。影响决策过程的标准太多了：一些是客观标准，如数据集特征，而另一些则是更主观的标准，如期望的目标。可以肯定地说，显示高对比度和清晰清晰边界的数据集，具有分离良好和相对均匀（不太多样化）的特征，并且处理的目的是显示大量对象的密度模型，自动化方法将是优越的，如果不是因为手动方法将只是资源（时间）限制。另一方面，如果对比度低，数据模糊，因此需要专家的知识，对象拥挤，特征表现出高度多样性，因此具有异质性，那么除了手动特征提取/分割之外，可能没有其他选择。

手动抽象模型生成

手动抽象模型跟踪在分割线性元素时特别有效，可以提供自动连接的种子点（球）（棒）。这种球和棒模型可以非常强大地测量这种模型的长度和方向，并为定性检查和定量分析提供充分抽象的模型。当最小化分析所花费的资源比对原始数据形状的绝对保真度更重要时，通常使用手动抽象模型生成。它是最成功的线性和同质感兴趣的特征(例如、灯丝、灯管）。只要人眼能够识别感兴趣的物体，数据对比度、清晰度和拥挤度在决定这种方法的成功与否方面并不起主要作用。有时，此类模型也可以用作骨架，以分割骨架周围区域中的3D地图。虽然模型是抽象的，而不是精确密度的反映，但它代表了3D密度的骨架化版本，因此允许无杂乱的可视化和定性分析。长度等定量测量也可以从近似模型中确定。有关手动抽象模型生成软件的示例，请访问Chimera的详细用户指南，网址为http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html.

手动跟踪感兴趣的功能

手动画笔跟踪可以很好地处理几乎所有的数据特征，但它也是最耗时的方法。有时，它是从包含多种特征的复杂图像集中提取感兴趣特征的唯一技术，例如薄而卷曲的细胞膜。一些程序中的一个有用工具允许在感兴趣的特征平滑变化时，在间歇分割的切片之间进行插值。如果数据清晰且具有中到高对比度，则可以最有效地应用手动跟踪，但也可以用于更具挑战性的数据集，只要用户熟悉感兴趣的对象。数据复杂性的范围从离散对象到复杂而拥挤的数据集，其中对象被紧密地封装在一起。在后一种情况下，手动分割可能是唯一的选择，因为自动方法通常很难分割所需的卷，并且提取太多或太少。该方法还可以提取复杂的特征形态，如卷曲的薄片或体积。然而，用户应该记住，具有几个困难特征的数据集只有在感兴趣特征的种群密度低的情况下才能被分割，因为感兴趣特征的高种群密度的分割在时间上变得令人望而却步。有关手动跟踪软件的示例，请在线访问Amira的详细用户指南，网址为http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

基于密度的自动分段

与手动技术相比，自动方法通常耗时较少，这是分割大量图像时需要考虑的一个重要因素。然而，简单的阈值可能并没有那个么精确，而且可能要花费更多的时间来细化和管理自动分割的体积。基于密度的自动分割最适用于显示大量需要分割的相似感兴趣特征的数据集。如果数据更复杂，这些自动化技术仍然可以作为初始步骤，但可能需要一些手动干预才能指定包含感兴趣的功能的子卷。这种策略通常适用于线性形态或卷曲体积，但很少适用于薄卷曲片（如细胞膜）。使用自动化方法的最小用户干预可以通过大容量或小容量进行分割，同时花费很少的用户资源（如时间）换取高保真度。有关基于密度的自动分割软件的示例，请访问Amira的详细用户指南，网址为http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf.

自定义自动细分

自定义的自动分段允许对特定数据集的算法进行强大的自定义，但它通常特定于数据集或数据类型，适用于有限数量的特征特征，并且不容易推广。这里显示的过程不同于一般的自动分割方法，如分水岭浸没和其他水平集方法，这些方法依赖于编程确定关键种子点，然后从这些种子点进行快速推进的立方体扩展。该主题的一个变体是边界分割，其中梯度向量信息通知特征边界。相反，这里使用的自定义脚本依赖于一个培训阶段，用户可以手动跟踪几个示例。通过机器学习，特定算法将检测并学习独立识别在轨迹中一致发现的属性和数据特征。专家用户可以重新训练算法，通过包含更多的示例轨迹来提供更大的特征标准集，从而提高分割的准确性，甚至定制的方法也可能无法从细胞器或形状复杂多样的图像中提取出感兴趣的单一特征，因为管理可能与手动跟踪一样费力。

分类数据和选择分割方法的策略

根据中提出的主观和客观标准图4和中合适的数据集摘要图5中描述的决策方案图6可以帮助有效评估各种数据集的特征提取策略。数据集分为四个连续的决策，每个决策都可能包括四个各自目标中的任何一个以及图4例如，图6是否合理地对中显示的六个数据集进行分类图3毫无疑问，对于每个数据集，都没有唯一的路径，而是通过该矩阵的不同路径，遵循不同的决策标准，这可能导致相同或不同的数据分段建议。虽然每个数据集都有自己的属性集，这是无法预料的，但我们给出了六个示例，每个示例都解释了首选特征提取/分割方法背后的原理。大多数还包括一个备选决策路线的提议，该路线要么导致使用相同的细分方法，要么导致使用不同的细分方法(图6).

kinocilium是一个清晰的数据集，具有明确的边界，这使得自动化方法更有可能成功。所有感兴趣的功能都被很好地分隔开，再次支持自动化方法。此外，感兴趣的特征彼此相似，这使得它成为一个相对同质的数据集，非常适合于自定义分段。最后，目的是提取整个特征，支持半自动化方法。因此，得出的结论是，自动阈值（实心绿线）以及定制设计(例如形状监督分割）方法（绿色虚线）在该数据集上都可能表现良好。

类似的标准，虽然在决策网络中的顺序不同，但也适用于细菌的情况；因此，有限的资源禁止劳动密集型的人工干预/分割方法。虽然阈值化会产生可接受的结果，但定制设计的方法能够实现研究的关键目标，即将圆形细菌形状与细胞外金属沉积物分离，这些金属沉积物位于细菌之间或细菌旁边，因此首选定制方法。

对于静纤毛数据集，首要考虑的是期望的目标：目标可以是显示整个密度，也可以是创建几何模型。感兴趣的体积是一个拥挤的区域，其目的是将大量物体分割为分离的物体，以便随后执行定量体积分析，包括长度、数量、距离、方向、，等。感兴趣的对象主要是线性的，这是有帮助的，这使得几何模型跟踪成为了选择的方法。然而，如果目标是显示整个密度，那么线性特征形态学以及与清晰定义的边界相对较高的对比度将使自动阈值协议可行。

细胞膜和线粒体数据案例由于其特征形态的类别（分别为卷曲的薄片和体积）而对自动化方法具有挑战性。目标是准确追踪细胞或线粒体轮廓，但这样做的资源有限。此外，感兴趣的特征很复杂，不容易自动检测或进行形状编码，尽管对于线粒体数据集，针对细菌采取的定制脚本方法可能会应用于进一步的定制。幸运的是，膜和线粒体本身只占整个体积的一小部分，因此，手工追踪是一种简单而耗时的方法。当对比度很低且边界很模糊时，手动跟踪也是此类数据集的选择方法。因此，即使它们构成了数据集的重要部分，也必须手动跟踪这些错综复杂的表格，原因很简单，就是缺少更好的替代方案。

植物数据集也提出了自己的挑战，因为其目标是分割所有密集分布的物体，形成拥挤的场景。将密度显示为i可以测量物体的形状和组织，但由于手动分割每个丝状物体的成本太高，因此使用了自动阈值。

此处显示了创建3D模型的各个步骤和相应结果，但更重要的是，还阐明了数据特征和个人标准，这些数据特征和标准对于确定最佳分割路径至关重要。图像数据本身的重要特征包括这里所描述的对比度、拥挤度、清晰度以及不同形状或特征（如细胞器、纤丝、膜）的数量。要考虑的主观标准包括所需的分割目标（测量/计数、数据的骨架表示/三维渲染中的显示体积）、感兴趣特征的形态特征（线性、细长、网络化、复杂、卷曲），感兴趣特征相对于整个体积的密度（重要且需要提取的对象的分数），以及平衡资源消耗与原始数据分段保真度之间的权衡，以及投资回报率的降低，从而实现资源分配的大幅提高。

近年来，图像分割领域已经显著成熟，但还没有什么灵丹妙药，也没有什么算法或程序可以做到这一切。数据集的大小已经从数百兆字节增长到通常的几十兆字节，现在已经开始超过TB，这使得手动分割几乎不可能。因此，需要在模拟人类决策过程的聪明且时效性强的特征提取方法上投入更多资源。这些工作需要与（1）基于地理信息系统（GIS）的语义层次数据库（类似于Google Earth），（2）数据抽象技术相结合(即，从体素转换为几何/体积表示）与计算机辅助设计（CAD）软件兼容，以显著减少数据量，从而实现更大体积的显示³⁵（3）仿真技术，因为它们在工程学科中经常使用，以及（4）先进的动画和电影制作能力，包括飞行动画（类似于为游戏行业开发的动画）。 

显然，高效的特征提取和分割是细胞高分辨率成像领域这场即将到来的革命的核心，虽然始终需要更好的方法，但这里介绍的原理以及不同数据类型所采用方法的示例，将为决定采取哪种方法提供一些有价值的信息。

披露

作者声明，他们没有相互竞争的经济利益。

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