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神经元。作者手稿；PMC 2016年5月20日提供。
以最终编辑形式发布为：
神经元。2015年5月20日；86(4): 1029–1040.
2015年4月30日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.neuron.2015.03.063
预防性维修识别码：项目经理443790
NIHMSID公司：NIHMS686415
PMID：25937172

偏置mGlu5正变构调节剂提供体内不增强mGlu的功效5NMDAR电流调制

杰里·鲁克,1,2,7 紫秀巷,1,2,7 吕晓辉,1,2 阿扬·戈沙尔,1,2 乔纳森·迪克森,1,2 托马斯·布里奇斯,1,2 卡里·A·约翰逊,1,2 丹尼尔·福斯特,1,2 凯伦·格雷戈里,1,2,三 佩奇·N·文森,1,2 阿莉莎·汤普森（Analisa D.Thompson）,1,2 内莉·拜恩,1,2 丽贝卡·L·科利尔,1,2 迈克尔·布布瑟,1,2 迈克尔·内德科维奇,1,2 罗伯特·古尔德,1,2 肖恩·斯塔弗（Shaun R.Stauffer）,1,2 J.斯科特·丹尼尔斯,1,2 科琳·M.尼斯温德,1,2 希尔德·拉夫雷森,4 克莱尔·麦基,5 Susana Conde-Ceide公司,6 耶稣·阿尔卡萨,6 JoséM.Bartolomé-内布拉达,6 格雷戈·麦克唐纳,4 托马斯·斯特克勒,4 卡莉·琼斯,1,2 克雷格·林斯利,1,2和P.杰弗里·康涅狄格1,2,*
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补充资料

总结

精神分裂症与N个-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体亚型（NMDAR）介导的兴奋性突触信号。代谢型谷氨酸受体亚型5（mGlu5)与NMDAR密切相关的信号伙伴，调节与精神分裂症病理相关的前脑区域的NMDAR功能。mGlu的功效5精神病和认知动物模型中的阳性变构调节剂（PAM）先前被归因于NMDAR功能的增强。为了直接验证这个假设，我们将VU0409551鉴定为一种新的mGlu5表现出明显的刺激偏倚并选择性增强mGlu的PAM5连接至Gαq–介导的信号传导，但不是mGlu5大鼠海马NMDAR电流或NMDAR依赖性突触可塑性的调节。有趣的是，VU0409551在动物模型中产生了强大的抗精神病类和认知增强活性。这些数据为mGlu的作用提供了令人惊讶的新的机制性见解5PAM并建议NMDAR电流的调制对于体内疗效。

介绍

多项临床和遗传学研究导致了这样的假设：N个-谷氨酸受体甲基-D-天冬氨酸亚型（NMDAR）在精神分裂症的病理生理学中起着重要作用，服用增强NMDAR功能的药物可以改善精神分裂症患者的症状(Coyle等人，2012年;Field等人，2011年;Timms等人，2013年). 基于这些发现，多项工作集中于开发增强NMDAR信号的方法，作为精神分裂症潜在的新型治疗策略。代谢型谷氨酸受体亚型5（mGlu5)是与NMDAR和mGlu激活密切相关的信号合作伙伴5增强与精神分裂症病理相关的前脑区域NMDAR反应和NMDAR介导的突触可塑性(Ayala等人，2009年;Collingridge等人，1983年;Doherty等人，1997年;Homayoun等人，2004年;Mannaioni等人，2001年;马里诺和康涅狄格州，2002年). 与此一致，mGlu的删除或阻断5加重NMDAR拮抗剂的类心理模拟和认知分裂效应(Brody等人，2004年;Campbell等人，2004年;Henry等人，2002年;Kinney等人，2003年)和高选择性mGlu5正变构调节剂（PAM）增强mGlu5-在临床前模型中调节NMDAR电流并具有认知增强和抗精神病样作用(Ayala等人，2009年;Darrah等人，2008年;Gastambide等人，2012年;Gregory等人，2013年a;Kinney等人，2005年;刘，2008;Noetzel，2012年;Parmentier-Battur等人，2013年;罗德里格斯，2010年). 然而，mGlu的激活5在前脑回路中有多种作用，并假设mGlu5-需要NMDAR电流的感应增强体内mGlu的疗效5尚未直接测试PAM。

mGlu的大多数作用5由G的激活介导αqGTP-结合蛋白亚单位(Niswender和Conn，2010年)而mGlu5-mGlu的相互作用介导前脑神经元NMDAR电流的诱导增强5NMDAR通过不依赖于G信号传导的衔接蛋白αq, (Gao等人，2013年;胡等，2012;Park等人，2013年;Shepherd和Huganir，2007年). 我们现在报道了一种新型mGlu的发现和表征5PAM，VU0409551，诱导mGlu的强健增强5连接至Gαq-介导钙动员和其他信号通路，但不增强mGlu5海马神经元NMDAR电流的调制。此外，VU0409551增强了NMDAR依赖性长期抑郁（LTD），但不增强大鼠海马的NMDAR依存性长期增强（LTP）。有趣的是，VU0409551在精神病和认知功能的临床前啮齿动物模型中产生了强大的、剂量依赖性的疗效。这些研究挑战了流行的假设，即体内mGlu的作用5与精神分裂症和认知功能相关的模型中的PAM由mGlu增强介导5NMDAR电流的调制，并为mGlu特定效应的调制提供了重要的新见解5激活。

结果

VU0409551是一种高效、高选择性的mGlu电位器5

我们已经鉴定出多个mGlu受体PAM，包括显示显著刺激偏倚和选择性增强mGlu接收器与特定信号通路耦合的PAM(Hammond等人，2010年;Noetzel等人，2013年;Sheffler和Conn，2008年;Zhang等人，2005年). 基于这些研究，我们启动了一项优化新型mGlu的工作5增强mGlu的PAM5-介导Gαq信号传导和钙动员，但不增强mGlu的偶联5调节NMDAR电流，并具有适用于全身给药的物理化学和药代动力学特性，这是以前偏置mGlu无法实现的特性5PAM。最终发现VU0409551是一种有效的mGlu5PAM公司(图S1). VU0409551表现为典型的mGlu5PAM公司(Conn等人，2014年)大鼠体内mGlu5-表达HEK293A细胞且不具有内在激动剂活性(图1A)但加强了对EC的响应20含EC的谷氨酸浓度50235 nM(图1B). 随着VU0409551浓度的增加，谷氨酸浓度响应曲线逐渐向左移动，在VU040.9551浓度为30μM时，最大折叠位移为11(图1C). VU0409551（10μM）对mGlu具有高度选择性5对其他mGlu受体亚型没有影响(图1D). 此外，放射性配体竞争结合分析显示，VU0409551（10μM）对α2安培肾上腺素能受体508.9μM），但在66个其他受体和离子通道中没有活性(表S1). 这些研究表明，VU0409551是一种有效且高选择性的mGlu纯PAM5-介导的钙动员。

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VU0409551是一种强效mGlu5HEK293A-mGlu中的PAM5大鼠细胞和自然系统

（A） 添加30μM VU0409551和随后添加EC后的代表性生钙微量20和EC80谷氨酸浓度。（B） VU0409551增强EC20在mGlu中浓度为235 nM的谷氨酸5-表达R10A的大鼠细胞（C）VU0409551在30μM时使谷氨酸浓度-反应曲线发生位移，最大位移为11倍（D）VU0409551没有使mGlu中的激动剂浓度-反应曲线发生位移1,2,3,4,6,7,8-表达细胞，显示其对mGlu的高选择性5（E）VU0409551可增强谷氨酸刺激的ERK1/2磷酸化，并在本试验中表现出强大的激动剂活性。（F） VU0409551可增强谷氨酸诱导的大鼠皮层星形胶质细胞钙动员，其效价为317nM，最大谷氨酸反应为79.5%，这可通过添加10μM的mGlu来阻断5拮抗剂MPEP。数据表示重复或三次进行的2-4个独立实验的平均值±S.E.M。

VU0409551诱导的ERK磷酸化

VU0409551还增强了谷氨酸诱导的mGlu细胞外信号调节激酶1/2（pERK1/2）磷酸化5-表达细胞(图1E). 此外，在没有添加谷氨酸的情况下，VU0409551增加了pERK1/2。这与其他mGlu的作用类似5PAMs，在本试验中也能显示激动剂活性，比谷氨酸更有效(Gregory等人，2013年b;Gregory等人，2012年). 用变构作用操作模型分析这些数据(Gregory等人，2012年)允许量化VU0409551激动剂疗效（τB：1.04），亲和力（KB：89 nM）和与谷氨酸的协同性（β：1.43）。

VU0409551诱导的mGlu调制5在本机系统中

接下来我们评估了VU0409551增强mGlu的能力5中枢神经系统制剂中的信号传递。与在HEK293A-mGlu中的作用类似5在培养的大鼠皮层星形胶质细胞中，VU0409551细胞没有内在的激动剂活性(Peavy等人，2002年)但在这些细胞中加强了谷氨酸诱导的钙动员（EC50=317±1 nM，图1F). 这种效应被mGlu阻断5负变构调节剂（NAM）MPEP（10μM，图1F). mGlu的激活5在海马Schaffer侧支CA1（SC-CA1）突触诱导NMDAR依赖型长期抑郁（LTD）中也起着重要作用(Huber等人，2001年;Rammes等人，2003年). 为了评估VU0409551对I组mGlu受体激动剂DHPG诱导的LTD的影响，在刺激Schaffer侧支后从CA1树突状层记录了场兴奋性突触后电位（fEPSPs）(图2). 与我们之前的研究一致(Noetzel等人，2013年;Noetzel，2012年)，DHPG（75μM）在海马SC-CA1突触处诱导的强大LTD在DHPG冲洗后55分钟测量(图2B，基线fEPSP斜率的54.9%±5.3%），而较低浓度的DHPG（25μM）只引起fEPSP的轻微抑制(图2B，基线fEPSP斜率的78.9%±5.7%）。如先前在其他mGlu中观察到的那样5PAM（私人助理经理）(Ayala等人，2009年;Noetzel等人，2013年;Noetzel，2012年)，VU0409551增强了对25μM DHPG的响应，诱导robust LTD(图2B（基线43.7%±4.6%）。尽管VU0409551单独导致fEPSP斜率轻微下降，但这种影响是暂时的，并在冲刷后10分钟内恢复到基线水平(图S2). 综上所述，这些数据表明VU0409551增强了对mGlu的多重反应5在重组和天然系统中激活。

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VU0409551增强海马NMDAR依赖性突触可塑性

（A-B）VU0409551增强DHPG诱导的长期抑郁（LTD）。（A） 75μM DHPG浴敷10分钟（开环，实线）导致fEPSP斜率LTD。相反，25μM DHPG浴敷10分钟（灰色圆圈，实线）在复合冲洗后55分钟，fEPSP斜率略有下降。应用10μM VU0409551 10分钟（虚线），首先单独使用，然后结合25μM DHPG（实线）使用10分钟（黑色圆圈），导致fEPSP斜率出现显著的LTD（p=0.005，n个= 6 - 7). 插图显示了基线（黑色迹线）和复合冲刷后55分钟（灰色迹线）的每个条件的代表性fEPSP迹线。（B） 复合冲刷后55分钟测得的fEPSP斜率变化的量化。与25μM DHPG相比，数据代表平均值±S.E.M.**p<0.01，***p<0.001。

VU0409551不会增强mGlu5CA1锥体细胞NMDAR电流的调制

mGlu的激活5增强多种细胞类型的NMDAR电流，包括海马CA1锥体细胞(Awad等人，2000年;Doherty等人，1997年;Fitzjohn等人，1996年;Mannaioni等人，2001年;O'Brien等人，2004年). 与之前的研究一致，CA1锥体细胞的全细胞膜片钳记录显示，DHPG通过位于记录细胞附近的膜片钳吸管，通过NMDA的应用，诱导了内向电流的浓度依赖性增加(图3A-C、F). 最近报道的mGlu的应用5帕姆5点523(Parmentier-Battur等人，2013年)单独添加时对NMDA诱发电流没有影响，但增强了3μM DHPG对NMDAR电流的影响(图3D和F). 同样，结构不同的mGlu5私人助理，VU0422465(Rook等人，2012年),ADX47273型(刘等人，2008)和VU0092273(Noetzel等人，2012年)导致DHPG诱导的NMDAR电流调制的类似增强(图3F). 相反，VU0409551单独或在3μM DHPG存在下对NMDAR电流没有影响(图3E和F). 与这些结果一致，电流钳研究表明VU0409551单独应用时对NMDA诱发的反应没有影响(图S3B、C和D)并且没有增强3μM DHPG诱导的去极化或NMDAR反应的增加(图S3A-D). 我们还评估了VU0409551对SC-CA1突触NMDAR介导的fEPSP的影响，发现VU040.9551对NMDAR-fEPSP斜率没有影响(图S3F-G). 最后，电压钳记录显示VU0409551（10μM）对EPSC没有影响NMDA公司/EPSC公司AMPA公司单独应用时的比率(图3G-J)对3μM DHPG诱导的EPSCampa抑制或DHPG导致的EPSC轻度增加均无影响NMDA公司/EPSC公司AMPA公司比率(图3G-J). 综上所述，这些结果表明，VU0409551代表一种独特的分子探针，其行为类似于mGlu5PAM，增强对mGlu的多重反应5在HEK293A-mGlu中激活5细胞、星形胶质细胞和海马脑片，但不增强mGlu5-介导NMDAR电流增加。

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mGlu的差异效应5PAM增强海马CA1锥体细胞NMDAR电流

（A-C）DHPG诱导NMDAR电流的浓度依赖性增加。顶部：海马CA1锥体细胞和底部：不同浓度DHPG应用前后归一化NMDAR电流振幅的时间历程。（D-E）顶部：NMDA激发电流和底部：mGlu应用期间，标准化NMDAR电流振幅在控制中的时间进程5单独使用PAM和mGlu的组合5PAM和DHPG（3μM），以及清洗化合物后。（D） mGlu5PAM 5PAM523（20μM）增强了DHPG对NMDAR电流的影响。（E） VU0409551（10μM），一种高选择性mGlu5PAM不会显著增强NMDAR电流。（F） DHPG和mGlu概述5单独使用PAM（p<0.05 n=5-8），在NMDAR电流上存在3μM DHPG。（G-J）VU0409551对EPSC没有显著影响NMDA公司/EPSC公司AMPA公司SC-CA1突触的比率。（G-H）EPSC的代表性痕迹AMPA公司和EPSCNMDA公司在分别施用3μM DHPG、10μM VU0409551或同时施用VU040.9551和DHPG期间，对照组的保持电位分别为-60 mV和+40 mV。G和H中右侧面板中的痕迹被缩放到AMPAR-EPCS的峰值并叠加，表明VU0409551没有增强EPSCNMDA公司/EPSC公司AMPA公司单独使用或与DHPG共同使用时的比率。（I-J）3μM DHPG、10μM VU0409551、10μM VU040.9551和3μM DHPG对EPSC的影响总结AMPA公司振幅和EPSCNMDA公司/EPSC公司AMPA公司比率分别为（n=4-6）。数据代表平均值±S.E.M.，*p<0.05，**p<0.005。

VU0409551不增强SC-CA1突触的LTP

先前的研究表明mGlu5PAM增强SC-CA1突触的θ突发刺激（TBS）诱导的LTP，这种效应被认为是通过mGlu的增强介导的5-NMDAR电流的感应调制(Ayala等人，2009年;Noetzel等人，2013年). 为了确定VU0409551对LTP诱导的影响，使用标准TBS方案（饱和TBS；四列10 Hz TBS）启动最大LTP，刺激后35分钟测量时，与基线相比，fEPSP斜率增加141.1%±8.4%(图4A-B). 相反，一系列低频脉冲导致fEPSP斜率轻微增强(图4A-B; 116.2%±3.3%），并用作诱导TBS LTP的阈值方案。与以前的报告一致(Ayala等人，2009年;Noetzel等人，2013年)，用mGlu预处理切片5PAM VU0092273导致fEPSP斜率显著增强，以响应阈值TBS(图4B). 相反，与单纯阈值TBS相比，用VU0409551和阈值TBS治疗海马脑片对fEPSP斜率没有影响(图4B; 基线的110.4%±4.0%）。与LTD研究类似，使用VU0409551后观察到的fEPSP斜率略有下降，在使用后25分钟内解决，即LTP量化之前(图S2). VU0409551增强NMDAR-independent mGlu-LTD而非NMDAR-dependent LTP的能力与该mGlu缺乏作用一致5调制NMDAR电流的PAM。

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与其他mGlu相比5PAM，VU0409551不增强NMDAR介导的海马突触可塑性

（A） VU0409551不增强NMDAR介导的θ突发刺激诱导的长时程增强（LTP）。刺激后35分钟，饱和TBS导致fEPSP斜率显著增加。阈值TBS导致刺激后35分钟测得的fEPSP斜率略有增加。浴敷10μM VU0409551 20分钟，然后进行阈值TBS，与阈值TBS相比，fEPSP斜率没有变化。相比之下，1μM VU0092273浴敷20分钟，然后阈值TBS，刺激35分钟后测得的fEPSP斜率显著增强。插图显示了基线（黑色记录道）和TBS后35分钟（灰色记录道）每个条件的代表性fEPSP记录道。（B） TBS刺激35分钟后测量的fEPSP斜率变化的量化。与VU0092273相比，在刺激后35分钟，浴敷VU0409551 20分钟，然后进行阈值TBS，没有导致显著的LTP（p=0.0002，n=6-11）。数据表示与阈值TBS相比的平均值±S.E.M.**p<0.01。

VU0409551的大鼠药代动力学（PK）和脑分布

在使用此化合物之前体内研究中，我们评估了全身给药后VU0409551的药代动力学（PK）谱和脑分布。VU0409551显示出与血浆的中度清除（CL对; 33 mL/min/kg），在稳态下有大量分布（V不锈钢; 9.6 L/kg）和中等半衰期（t1/2; 3.9小时），图S4). 在大鼠肝细胞中进行的VU0409551生物转化实验表明，通过多个氧化途径，苯环（对位）的单羟基化可以产生主要代谢物，而在mGlu中是不活跃的5在里面在体外化验（数据未显示）。单次口服（p.o.）VU0409551（3 mg/kg）显示出较高的口服生物利用度（%F=63），血浆中的最大浓度（C最大值，p)270 nM，血浆中达到最大浓度的时间（T最大值，p)1.3小时，以及0-last（AUC）曲线下的面积0-最后)2.9μM*hr(图S5). 这个在体外大鼠血浆中未结合VU0409551的分数（fu对)0.07和大鼠大脑（fubr个)0.04表示脑-血浆分配系数(K（K）对)无限制平衡（[fu对]/【fu】br个])第页，共1.8页(表S2). VU0409551在大脑中的分布体内单次p.o.给药（3、10、30、100 mg/kg）后1.5小时，发现脑对血浆K（K）对2.3和相应的未结合脑与血浆K（K）对(K（K）p、 你)1.3，表明该化合物自由渗透血脑屏障（BBB），脑和血浆中的未结合浓度达到无限制平衡(表S2). 因此，VU0409551具有良好的PK和脑暴露，可用于体内研究。

VU0409551诱导大鼠觉醒

先前的研究表明，mGlu5PAM提高啮齿动物的清醒度(Gilmour等人，2012年;Parmentier-Battur等人，2012年)这为他们的体内中枢神经系统活动。急性口服VU0409551在给药后立即产生明显的中枢活动，表现为睡眠的剂量依赖性减少。具体而言，VU0409551剂量依赖性地减少了总睡眠时间，导致非快速眼动（NREM）和REM睡眠显著减少(图5). 10 mg/kg剂量对警戒状态有适度影响，减少给药后2小时的睡眠时间。服用60 mg/kg VU0409551可显著缩短NREM和REM睡眠长达7小时的总时间(图5).

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VU0409551显示防尾迹效果体内

睡眠-觉醒脑电图（EEG）研究表明，在2第光周期的小时数随剂量增加而减少睡眠时间百分比（p<0.0001，n=8）。从光周期开始，对大鼠的睡眠测谎变量进行24小时的测量。数据表示平均值±标准误差平均值。*p<0.05。

VU0409551的抗精神病样和认知前效应

VU0409551作为mGlu的发现和优化5PAM具有良好的PK曲线，不会增强mGlu的偶联5NMDAR电流提供了一个前所未有的机会，可以直接评估NMDAR信号增强在mGlu的抗精神病类和认知增强效应中的重要性5啮齿动物模型中的PAM。用于评估mGlu抗精神病活性的两个主要模型5PAM包括逆转NMDAR拮抗剂或苯丙胺诱导的超运动（AHL）和逆转药物诱导的声惊厥反射包皮抑制（PPI）中断。有趣的是，用VU0409551（10-100 mg/kg）对大鼠进行预处理（30分钟）可以逆转NMDAR拮抗剂MK-801（0.2 mg/kg，皮下注射。，图6A). VU0409551的最小有效剂量（MED）为10 mg/kg，最高剂量时最大逆转率为49.7%(图6A). 此外，VU0409551（3-100 mg/kg）预处理（30分钟）剂量依赖性逆转了服用苯丙胺（1 mg/kg，皮下注射）引起的运动活性增加，MED为3 mg/kg，ED为505.9 mg/kg，最大逆转率为78.1%(图S6A-B). 使用大鼠AHL研究的VU0409551末端（1.5小时）未结合脑浓度数据来确定体内欧盟委员会50使用来自所有剂量组的个体动物浓度效率数据。该分析提供了一个EC5097 nM，E最大值82%用于AHL逆转。此外，mGlu阻断了VU0409551逆转AHL5拮抗剂，MTEP，支持mGlu5-介导的抗精神病类疗效（数据未显示）。最后，VU0409551（56.6和100 mg/kg）预处理（30分钟）逆转了苯丙胺诱导的大鼠PPI中断(图S6C).

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VU0409551在啮齿类动物行为模型中显示抗精神病活性和认知增强

（A） VU0409551（10–100 mg/kg）通过最小有效剂量10 mg/kg和最大逆转率49.7%（100 mg/kg时）逆转MK-801诱导的大鼠过度运动。数据表示为每5分钟间隔的平均束流断裂总数±S.E.M.。对每个治疗组从时间间隔t=60到120分钟的曲线下面积进行量化，并表示为总行走次数。在车辆+MK-801治疗组正常化后计算逆转百分比。（p<0.0001，n=10-12）。（B） VU0409551剂量依赖性增强大鼠情境恐惧条件反射的获得。在条件反射前预处理1、3、5.6和10 mg/kg VU0409551显著增强了24小时后评估的恐惧条件反射的获得（p=0.005，n=10-13）。数据表示为平均值±S.E.M.***p<0.001、**p<0.01和*p<0.05。（C） VU0409551剂量依赖性增强大鼠的识别记忆。暴露于相同物体前，用3 mg/kg和10 mg/kg VU0409551进行预处理，24小时后评估的识别记忆显著增强（p=0.0014，n=19）。数据表示为平均值±S.E.M.***p<0.001和*p<0.05。（D） VU0409551在大鼠延迟不匹配位置任务中证明了促认知作用。试验前用VU0409551（10–60 mg/kg）进行预处理，分别显著增加了延迟10秒和20秒时的正确反应比例（p=0.0236，n=15–35）。数据表示为平均值±S.E.M.*p<0.05。

除了抗精神病药样活性外，VU0409551还表现出强大的认知增强作用。VU0409551诱导大鼠情境恐惧条件反射获得的剂量依赖性增强。预处理前用VU0409551（0.3-10 mg/kg）预处理（30分钟），24小时后评估显著增强了恐惧记忆的获得(图6B)，证明了这种新型mGlu的功效5PAM增强海马依赖性认知功能的既定形式。此外，在暴露于两个相同物体前30分钟给予VU0409551（1-10 mg/kg）可导致新物体识别任务中的识别记忆呈剂量依赖性增加，这是另一种常用的啮齿动物学习记忆范式，依赖于海马功能(图6C). 为了评估VU0409551对工作记忆和执行功能的影响，采用操作性延迟非匹配位置（DNMTP）任务。在测试之前用VU0409551（10-60 mg/kg）进行预处理（60分钟），在10秒和20秒的延迟（60 mg/kg；图6D)启动的试验总数没有变化(图S6D). 根据PK分析，激发抗精神病药样和认知增强效应所需的VU0409551剂量提供的大脑浓度与增强mGlu所需的浓度非常吻合5-细胞系和脑片（100 nM–30μM）中的介导反应。这些数据表明，VU0409551在用于预测抗精神病药样和认知增强效应的啮齿类动物模型中具有强大的功效，类似于先前mGlu的描述5增强mGlu的PAM5NMDAR电流的调制。

重复服用VU0409551不会引起荧光翡翠C染色的可检测变化

先前的研究表明，一些mGlu5PAM可诱发严重的癫痫样活动、行为性惊厥(Parmentier-Battur等人，2013年;Rook等人，2012年)和神经元死亡(Parmentier-Battur等人，2013年)通过测量氟玉C（FJC）染色的增加来评估啮齿类动物，氟玉C选择性染色退化神经元(Schmued等人，1997年). 与以前的5PAM523报告类似(Parmentier-Battur等人，2013年)，我们发现VU0424465诱导了细胞死亡，这是通过在单次相对低剂量（3 mg/kg，腹腔注射（i.p），图7A-B). 相反，连续四天每天服用高剂量VU0409551（120 mg/kg，p.o.）不会在最后一次给药24小时后从大鼠身上获取的切片中诱导FJC染色(图7A-B).

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重复给药VU0409551不会导致大鼠脑内荧光翡翠C染色阳性

（A-B）mGlu5急性给药24小时后，ago-PAM VU0424465（3 mg/kg）在听觉皮层诱导荧光翡翠C（FJC）染色阳性。与VU0424465不同，VU0409551在大鼠体内的神经毒性剂量不超过强健所需剂量体内在连续四天每天一次重复给药120 mg/kg后，FJC染色阴性证明了行为测定的有效性（p＜0.0001，n＝3）。与VU0409551相比，数据表示平均值±S.E.M.***p<0.0001。（C） mGlu蛋白5PAM VU0424465（3 mg/kg）和PAM 5PAM523（56.6 mg/kg）可诱发强健的行为性惊厥，如改良的Racine量表（0-5）所测。VU0409551在急性或重复给药（120 mg/kg）后连续四天每天一次，无癫痫发作活动。数据代表平均值±S.E.M。

为了在FJC研究中重复给药（120 mg/kg，p.o.，水中75%PEG 400）后测定VU0409551的PK（每天一次，连续4天），使用相同的设计进行了一项卫星PK研究；在第1天和第4天给药后3、7和24小时获得血浆浓度(图S7). 在这项研究中，VU0409551表现出类似的高C最大值，p并在第1天暴露（C最大值，p7.0微米；AUC公司0-最后，96μM*小时）和第4天（C最大值，p7.5微米；AUC公司0-最后，95μM*小时）。因此，在这4天的给药期间，暴露水平保持在远远超过达到最大疗效所需的水平。

最后，与以前的报告一致(Parmentier-Battur等人，2013年;Rook等人，2012年)、VU0424465和5PAM523诱导的大鼠行为惊厥，可使用拉辛行为惊厥量表进行评估(图7C). 相比之下，VU0409551的剂量是行为模型中可测量有效性所需剂量的100倍（120 mg/kg），不会诱发大鼠行为惊厥(图7C). 此外，长期服用先前的mGlu5PAMs，如5PAM523，导致癫痫活动逐渐恶化(Parmentier-Battur等人，2013年)，VU0409551在14天内每天重复服用一次高剂量（450 mg/kg）后未诱发行为性惊厥（数据未显示）。因此，VU0409551在远远高于这些行为研究所用剂量的剂量下没有可检测到的毒性作用。

讨论

汇集的证据表明NMDAR功能减退是精神分裂症的主要危险因素(Coyle等人，2012年;Field等人，2011年;Matosin和Newell，2013年;Timms等人，2013年). NMDAR和mGlu5共定位于与精神分裂症病理相关的突触后位点，其胞内结构域通过支架蛋白物理连接(Gao等人，2013年;胡等，2012;Matosin和Newell，2013年;Park等人，2013年;Shepherd和Huganir，2007年)促进mGlu增强NMDAR活性5激活(Ayala等人，2009年;Homayoun等人，2004年;Mannaioni等人，2001年;马里诺和康涅狄格州，2002年). 大量报告表明选择性mGlu5PAM在精神病和认知动物模型中有疗效(Darrah等人，2008年;Gastambide等人，2012年;Gregory等人，2013年a;Kinney等人，2003年;刘，2008;Noetzel，2012年;罗德里格斯，2010年)这些效应被假设为NMDAR电流直接增强的结果。为了支持这一假设，以前的研究表明mGlu5PAM增强mGlu5海马锥体细胞NMDAR电流的调节(O'Brien等人，2004年)，我们现在使用多个结构无关的mGlu证实了这些先前的发现5PAM。然而，mGlu的增强作用5连接至Gαq突触后神经元也通过独立于NMDAR激活的效应器系统促进这些前脑回路的活动。发现VU0409551是一种有效的mGlu5显示信号偏倚且不增强mGlu的PAM5与NMDAR电流耦合，同时表现出鲁棒性体内啮齿动物模型的功效为我们对mGlu的理解提供了一个令人兴奋的进展5药理学和mGlu5与NMDAR协同行动，以调节这些模型中受影响的大脑回路，而不是实施完全依赖于mGlu的行动5NMDAR信号的调制。

虽然这些数据与明显的刺激偏差一致，并且VU0409551对mGlu没有影响5调节NMDAR电流，需要注意的是，VU0409551可以通过去极化神经元，降低电压依赖性Mg，间接增强某些神经元群中的NMDAR功能2+阻断NMDAR通道，从而间接增加NMDAR电流。然而，DHPG诱导的大鼠海马CA1区锥体细胞的去极化是由mGlu介导的1而不是mGlu5(Mannaioni等人，2001年). 因此，mGlu的选择性增强5不太可能通过使这个特殊突触的锥体细胞去极化来增强NMDAR功能。然而，mGlu5激活抑制缓慢的AHP电流（I层次分析法)从而增加CA1锥体细胞的兴奋性(Mannaioni等人，2001年). 因此，mGlu的整体生理效应5前脑回路中的激活包括多个独立于NMDAR电流直接调制的动作，但与NMDAR信号一致，以增强精神分裂症和相关动物模型中受影响的回路的传递。mGlu的这一机制和其他机制5激活可以增强突触的传递，NMDAR在突触中发挥重要作用，可能会增强通过这些电路的传递，并可能与mGlu的功效有关5PAM。

与之前报道的mGlu类似5PAM，VU0409551表现出mGlu的选择性强增强作用5-介导的钙动员。重要的是，VU0409551在基于细胞的分析或天然系统中诱导钙动员时不具有内在的变构激动剂活性，但可增强谷氨酸诱导的细胞内钙增加，因此在mGlu处显示纯PAM活性5在本试验中。先前的研究表明，诱导钙动员的变构激动剂或“ago-PAM”活性是导致mGlu不良反应的主要因素5PAM（私人助理经理）(Conn等人，2014年;Rook等人，2012年). 因此，本试验中VU0409551缺乏ago-PAM活性是避免不良反应的关键特性。然而，mGlu5缺乏变构激动剂活性的PAM在长期服用高剂量后仍可能导致癫痫发作和细胞死亡(Parmentier-Battur等人，2013年). 这与NMDAR激活在整个中枢神经系统兴奋性毒性中的既定作用有关(斯通和伯顿，1988年)增加了不增强mGlu的药物的可能性5调节NMDAR电流可以提供理想的疗效，同时降低神经毒性效应的风险。因此，VU0409551提供的刺激偏差允许mGlu增强5通过G发送信号αq无mGlu增强5与NMDAR电流调制的耦合可能是一个重要因素，导致我们观察到这种新型mGlu的安全性能得到改善5在大鼠临床前有效的剂量范围内未观察到毒性的PAM。然而，重要的是要注意，PAM诱导的特定信号级联的激活可能存在物种差异(Conn等人，2014年;Croy等人，2014年)或物种间的药代动力学差异，所有这些都可能影响它们的净体内影响。因此，这种类型的刺激偏倚可能是物种依赖性的，我们不能超越目前的研究来预测VU0409551对NMDAR电流的影响以及这种化合物在其他物种中的可能安全性。事实上，当以非常高的剂量（360 mg/kg，每天一次，持续一个月）长期给药时，我们发现有证据表明VU0409551可以诱导FJC染色（未发表的研究结果）。

特别有趣的是，VU0409551不能增强TBS诱导的海马LTP。这与之前的mGlu形成对比5诱导TBS-LTP强健增强的PAM(Ayala等人，2009年;Noetzel等人，2013年). 已知在该突触诱导LTP是NMDAR依赖性的(Ben-Ari等人，1992年;Harris等人，1984年;Muller等人，2013年). 因此，这一发现，加上VU0409551缺乏增强mGlu的能力5NMDAR电流的调制与mGlu的假设一致5-海马LTP的诱导增强依赖于mGlu的能力5增强NMDAR电流(Ben-Ari等人，1992年;Collingridge等人，2013年;Mannaioni等人，2001年). 有趣的是，VU0409551确实增强了恐惧条件反射和新物体识别，这是海马依赖性认知功能的模型(Franca等人，2014年;马伦和霍尔特，2000年). VU0409551还提高了DNMTP操作任务的性能，该任务评估皮质依赖性工作记忆和执行功能。这些数据表明，mGlu的认知增强作用5中的PAM不依赖于NMDAR电流或LTP的增强。然而，如上所述，mGlu5激活在海马和皮层回路中有广泛的影响，这些影响与NMDAR电流的调制无关，但会增加通过海马回路的整体传递。未来，进行进一步的研究以更好地了解mGlu的作用机制将非常重要5PAM增强认知功能。

实验程序

体外试验

细胞培养和在体外化验

稳定表达大鼠mGlu的HEK293A细胞5或mGlu1和原代大鼠皮层星形胶质细胞（Lonza）被维持并测量mGlu5-或mGlu1-介导的细胞内钙2+如前所述进行动员(Hammond等人，2010年;罗德里格斯，2010年;Rook等人，2012年). 为了进行选择性筛选，如补充实验程序所述，测量稳定表达大鼠mGlu1的HEK293细胞中的钙通量或通过表达mGlu亚型2、3、4、6、7或8的HEK-293-GIRK细胞中的GIRK通道的铊通量(Hammond等人，2010年;Niswender等人，2008年;罗德里格斯，2010年). mGlu的测量5-在稳定表达大鼠mGlu的HEK293A细胞中进行介导的ERK磷酸化5使用补充实验程序和之前描述的基于ALPHAScreen的ERK Surefire试剂盒（Perkin-Elmer，TGR Biosciences）(Gregory等人，2012年).

在体内研究

动物

所有目前的研究都使用雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（印第安纳波利斯州哈兰市），除了延迟的非匹配位置任务[雄性Lister-houded大鼠（荷兰哈兰市实验动物护理和使用指南所有实验程序均由范德比尔特大学动物护理和使用委员会批准。除非另有说明，否则所有VU0409551剂量均以3 ml/kg的20%β-环糊精口服。以下动物研究的其他详细方法可在补充实验程序中找到。

脑片电生理学

全电池电压和电流钳记录

从大鼠（年龄17-28天）（Charles River，Wilmington，MA）制备横向海马切片。从海马CA1锥体神经元胞体进行全细胞记录。NMDA受体介导的反应是通过使用Picospritzer II（新泽西州费尔菲尔德General Valve）的贴片吸管每隔30秒向记录细胞体附近的树突状场压力喷射0.5-1 mM NMDA而诱导的。本实验在河豚毒素（1μM）存在下进行，在-65至-70 mV电压下对细胞进行电压钳制或在电流钳制下记录静息膜电位。对于突触NMDAR电流的研究，EPSCsAMPA公司和EPSCNMDA公司在20μM荷包牡丹碱存在下，每30秒通过电刺激Schaffer侧枝循环诱发，并分别在-60 mV和+40 mV的保持电位下记录。所有药物均在浴缸中使用。使用Clampfit 10.2、Origin 6（Origin Lab，马萨诸塞州北安普顿）和Prism 5.0（GraphPad Software，加利福尼亚州拉荷亚）分析数据。。

细胞外场电位记录

从年轻成年（年龄29-36天）大鼠（马萨诸塞州威明顿市查尔斯·里弗）制备海马横切片(Ayala等人，2009年;Noetzel等人，2012年). 使用双极刺激电极刺激Schaffer侧支循环，并从CA1获得场电位记录。微克葡萄糖5将化合物应用于浴中10-20分钟，并通过应用DHPG启动化学诱导的mGlu LTD 10分钟。阈值LTP由一系列θ脉冲刺激（TBS；100 Hz、230毫秒间隔的四脉冲九次脉冲）诱导。饱和LTP由四列10Hz的TBS（以100Hz、100毫秒的突发间隔的四个脉冲的九次突发）诱导。使用Clampfit 10.2和GraphPad Prism 5.0分析数据(Noetzel等人，2012年).

大鼠的药物代谢和药代动力学

这个在体外和体内如前所述，基本上测定了VU0409551的大鼠药物代谢和药代动力学特性(Bridges等人，2013年;Gregory等人，2013年a;Jones等人，2012年).

荧光玉石研究中的大鼠慢性剂量卫星PK

为了在对Fluoro-Jade研究中使用的非禁食大鼠进行长期给药（每天一次[QD]，持续4天；120 mg/kg，p.o.，载药：70%PEG 400在水中）后测定VU0409551的PK，获取了连续血样，并在给药后第1天和第4天的3、7和24小时测定了血浆浓度。如上所述，通过LC-MS/MS定量分析样品和数据。

行为研究

睡眠脑电图研究

从光周期开始，记录大鼠（250-275 g）的脑电图（EEG）和肌电图（EMG）数据。然后在2第光照时间。在复方给药后的22小时内，对大鼠的睡眠测谎变量进行测量。使用Dataquest A.R.T.4.3软件（DSI，明尼阿波利斯，明尼苏达州）采用连续采样方法收集EEG和EMG波形数据。遥测数据以500 Hz的频率采样，并通过放置在每只大鼠笼子下方的接收器（RPC-2、DSI、MN）传输。使用Neuroscore 3.0软件（Data Sciences International，St.Paul，MN），由一名盲观察者手动将数据评分为10秒，以根据公认的特征振荡模式确定给药后睡眠-睡眠阶段的变化。在10秒的时间内对睡眠-睡眠阶段进行评分，然后将NREM和REM睡眠时间合并到60分钟的箱子中，以检查在服用复方制剂后的前22小时周期内总睡眠时间的百分比。

MK-801诱发的超运动

测定了VU0409551对MK-801诱导的大鼠超运动的影响(罗德里格斯，2010年). 使用露天室（加利福尼亚州圣地亚哥KinderScientific）。在t=30时，给大鼠注射溶媒或VU0409551（10–100 mg/kg），然后在t=60 min时注射MK-801（0.2 mg/kg，皮下注射，生理盐水，1 ml/kg）。再测量60 min的运动活性。运动活性的变化是根据每5 min箱的光束断裂总数来测量的。

情境恐惧条件作用

在大鼠（275-300 g）中评估了VU0409551对情境恐惧条件反射获得的影响(Lebois等人，2009年). 对大鼠进行30分钟的VU0409551预处理（0.3-10 mg/kg），并将其置于消声调节室（Med Associates，St.Albans，VT）中，加入1 mL 10%香草提取物溶液。在2分钟的习惯化期后，大鼠接受了一次电击对照配对试验（1s，0.5mA），45秒后返回其家庭笼子。20小时后，在相同的条件反射环境中评估恐惧反应2分45秒，测量在没有任何电击刺激或药物的情况下的冻结行为。测试过程被记录下来，冻结时间由失明人员（MED-VFC-RS，MedAssociates）评分。

新型物体识别

在大鼠（275-300 g）中评估VU0409551对识别记忆的影响。大鼠在一个空的新物体识别（NOR）区域内连续2天习惯化10分钟。第3天，在将大鼠放入含有2个相同物体的NOR区域前30分钟，给大鼠服用1、3或10 mg/kg VU0409551载体。暴露10分钟后，将大鼠放回其家中的笼子，24小时后返回竞技场，其中一个先前暴露的（熟悉的）物体被一个新物体取代。大鼠在探索物体时被录像10分钟。探索每一个物体所花费的时间都由一个盲目的观察者打分。

延迟不匹配位置

使用雄性Lister连帽大鼠（350-450 g），在延迟非匹配位置（DNMTP）任务中评估VU0409551对工作记忆和执行功能的影响。训练大鼠以确保获得高水平的稳定和准确的表现。在测试前60分钟给大鼠服用赋形剂或VU0409551（10–60 mg/kg）。本研究使用了四种延迟长度（1、10、20和30秒），每次延迟进行15次试验（共60次试验）。给大鼠最多45分钟的时间来完成这些试验。

荧光翡翠C染色

最后一次给药VU0409551或VU0424465后24小时，对大鼠大脑进行荧光翡翠C染色。在放大20倍的条件下计数听觉皮层内的Fluoro-jade C阳性神经元。对每只动物共五个切片进行了量化，数据以每个切片的平均细胞数表示。

​

亮点

  • VU0409551是一种强效、选择性的mGlu5帕姆
  • VU0409551诱导mGlu刺激偏倚5发送信号。
  • 微克葡萄糖5帕姆体内疗效不需要NMDAR调制增强。

补充材料

补充

单击此处查看。（160万，pdf）

致谢

作者感谢迪娜·麦金尼斯（Dina McGinnis）、基兰·戈吉（Kiran Gogi）、罗科·D·戈格利奥蒂（Rocco D.Gogliotti）、马克·特林顿（Mark Turlington）和汤姆·范·德卡斯蒂尔（Tom Van De Casteele）的技术专长。Fluoro-Jade C数据分析和演示部分通过使用范德比尔特大学医学中心细胞成像共享资源进行。PNV、SRS、CMN、JSD、CKJ、CWL、PJC已获得强生公司的赔偿，并且是保护多种mGlu专利的发明人5PAM。HL、CM、SC、JA、JMB、GJM和TS是杨森研发的员工和股东。JMR、ZX、XL、AG、JWD、TMB、KAJ、DJF、KJG、ADT、NB、RLC、MB、MTN、RWG无需披露的利益冲突。这项工作得到了美国国立卫生研究院（R01 MH062646，R01 MH074953 R01 NS031373（PJC））的支持；U54 MH084659（CWL）和Janssen研发公司。

脚注

补充信息：补充信息包括补充实验程序、八张图和两张表。

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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