《维罗尔杂志》。2015年4月15日；89(8): 4494–4503.
MicroRNA miR-24-3p通过抑制血红素氧化酶-1的表达促进猪繁殖与呼吸综合征病毒复制
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a、，b条 舒淇笑
一西北农林大学兽医学院，中国陕西
b条中国农业部兽医药理学和兽医生物技术实验站，中国陕西
王雪
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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怀抱倪
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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李娜（Na Li）
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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张昂科（Angke Zhang）
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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刘洪亮
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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丰兴铺
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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徐乐乐
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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Jiming Gao公司
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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秦昭
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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杨木
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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王成宝
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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孙亚妮
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
b条中国农业部兽医药理学和兽医生物技术实验站，中国陕西
陶凤都
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
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Xingang Xu（许新刚）
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
b条中国农业部兽医药理学和兽医生物技术实验站，中国陕西
张盖平
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
c（c）河南农业大学动物科学与兽医学院，河南郑州
朱利安·A·希斯考克斯
d日英国利物浦大学感染与全球健康研究所感染生物学系
伊恩·古德费罗
e（电子）英国剑桥大学阿登布鲁克医院病理学系病毒学科
周恩民
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
b条中国农业部兽医药理学和兽医生物技术实验站，中国陕西
S.Perlman，编辑器
一西北农林科技大学兽医学院，陕西
b条中国农业部兽医药理学和兽医生物技术实验站，中国陕西
c（c）河南农业大学动物科学与兽医学院，河南郑州
d日英国利物浦大学感染与全球卫生研究所感染生物学系
e（电子）英国剑桥大学阿登布鲁克医院病理学系病毒学科
通讯作者。 S.X.和X.W.对这篇文章的贡献是一样的。
引用肖S、王X、倪H、李N、张A、刘H、蒲F、徐L、高J、赵Q、穆Y、王C、孙Y、杜T、徐X、张G、Hiscox JA、Goodfellow IG、周E-M.2015。MicroRNA miR-24-3p通过抑制血红素氧化酶-1的表达促进猪繁殖和呼吸综合征病毒的复制。《维罗尔杂志》89:4494–4503。数字对象标识：10.1128/JVI.02810-14. 2014年12月1日收到；2015年2月1日验收。
摘要
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是影响全球养猪业最重要的经济病毒之一。我们之前的研究表明，PRRSV在感染后下调血红素氧化酶-1（HO-1）的表达，HO-1是一种关键的细胞保护酶，并且HO-1的过度表达抑制PRRSV的复制。微RNA在转录后水平调节基因表达，最近被证明在病原-宿主相互作用中发挥重要作用。本研究旨在确定微RNA是否调节HO-1表达，并通过调节PRRSV复制。利用生物信息学预测和实验验证，我们证明HO-1表达受miR-24-3p调控。使用多种方法证实miR-24-3p和HO-1 mRNA之间存在直接相互作用。miR-24-3p的过度表达显著降低HO-1 mRNA和蛋白水平。PRRSV感染诱导miR-24-3p表达以促进病毒复制。原卟啉IX氯化钴（CoPP；HO-1表达的经典诱导剂）诱导HO-1对MARC-145细胞和原代猪肺泡巨噬细胞中PRRSV复制的抑制作用也可以通过miR-24-3p的过度表达来逆转。总之，这些结果表明，miR-24-3p通过抑制HO-1表达促进PRRSV复制，这不仅为PRRSV感染期间的病毒-宿主相互作用提供了新的见解，也为对抗PRRSV的感染提供了潜在的新抗病毒策略。
重要性微RNA（miRNAs）通过在转录后水平调节病毒或宿主基因的表达，在病毒感染中发挥重要作用。血红素加氧酶-1（HO-1）是一种关键的细胞保护酶，对埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等多种病毒具有抗病毒活性，而PRRSV是我们关注的焦点，每年在全球养猪业中都会造成巨大的经济损失。在这里，我们发现PRRSV感染诱导宿主miRNA miR-24-3p的表达，并且miR-24-3p通过mRNA降解和翻译抑制来调节HO-1的表达。miR-24-3p抑制HO-1表达有助于PRRSV复制。这项工作为以下假设提供了可信度：一种动脉病毒可以通过调节病毒感染后的抗病毒反应来操纵细胞miRNAs以增强病毒复制。因此，我们的发现为PRRSV的发病机制提供了新的见解。
简介
猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是影响全球养猪业最重要的经济病毒之一，每年都会造成重大经济损失(1,–三). PRRSV是一种小型、包膜、线状、单一阳性标记RNA病毒，属于病毒目，家庭动脉病毒科(4). 由于抗原高度异质性，目前的疫苗接种策略无法有效控制PRRSV感染(5,6)肺泡巨噬细胞的复制和破坏(7,–9)以及观察到的PRRSV抗体依赖性增强(10,11). 因此，有必要研究PRRSV的发病机制，以便制定更有效的控制措施。
血红素加氧酶-1（HO-1）是血红素降解的速率限制酶，其功能是将游离血红素分解为胆绿素、一氧化碳和铁。HO-1及其最终产物具有抗氧化、抗炎和抗病毒特性，是一种关键的细胞保护酶(12). HO-1表达的上调抑制了许多病毒的复制，包括丙型肝炎病毒（HCV）、HIV-1、乙型肝炎病毒（HBV）和流感病毒(13,–17). 我们之前的研究表明，PRRSV显著下调HO-1的表达体内和在体外(1,18). 此外，HO-1的过度表达或诱导表达抑制PRRSV的复制(19)，表明HO-1表达的增加可能为对抗PRRSV感染提供一种潜在的新的抗病毒策略。
MicroRNAs（miRNAs）是进化上保守的、小的、内源性的、非编码的RNA，调节基因表达(20). 越来越多的证据表明，miRNAs可以直接调节病毒复制以及宿主细胞对病毒感染的前病毒或抗病毒反应(21,22). 已经证明HCV复制依赖于肝脏特异性miRNA miR-122(23,24). 卡波西肉瘤相关疱疹病毒上调miR-132的表达，进而抑制转录辅激活因子p300的表达，以促进病毒复制(25). miR-125b通过负向调节NF-κB途径减少PRRSV复制(26)miR-181通过靶向病毒基因组RNA和受体CD163抑制PRRSV复制(27,28).
最近的报道表明，HO-1的表达可以由某些细胞类型中的miRNAs调节。例如，miR-377和miR-217可以通过与HO-1 mRNA的3′非翻译区（UTR）直接相互作用降低内皮细胞中HO-1的表达(29)而miR-378降低肺癌细胞中HO-1的表达(30). 我们假设在PRRSV许可细胞中也可能存在靶向HO-1的miRNAs，这可能随后影响PRRSV复制的调节。在本研究中，我们证明miR-24-3p通过靶向MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞（PAM）中的HO-1促进PRRSV复制。这些数据不仅为研究PRRSV感染过程中的病毒-宿主相互作用提供了新的见解，而且也为未来针对PRRSV的感染提供了潜在的新抗病毒策略。
材料和方法
细胞、病毒和试剂。
来自非洲绿色猴肾细胞的MARC-145细胞在37°C和5%CO的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM；美国纽约州格兰德岛生命科技公司）中保存，补充有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素-抗真菌溶液（美国纽约州格林德岛生命技术公司）2用上述肺灌洗技术从6周龄健康的PRRSV阴性杂交断奶猪（长白×约克郡）中分离出猪肺泡巨噬细胞（PAM）(31)稍作修改(19). 所有动物工作都严格遵守动物保护和使用委员会的指导方针，并得到西北农林大学动物保护和利用委员会的批准。本研究中使用的病毒为高致病性PRRSV株SD16（GenBank登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“JX087437”，“term_id”：“399145992”，“term_text”：“JX087437}}JX087437型)重组PRRSV基于SD16的遗传背景，SD16表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为额外的开放阅读框（ORF）（rHP-PRRSV/SD16/EGFP(32).
GenePharma（中国上海）合成了模拟内源性miRNA的合成双链RNA（miRNA mimics），以及含有特定位点突变的合成miRNAs（miRNA突变体mimis）和靶向HO-1（siHO-1）的小干扰RNA（siRNA）。原卟啉IX氯化钴（CoPP）是HO-1基因表达的经典诱导剂，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
生物信息学miRNA结合位点的鉴定。
两者HO-1 3′UTR中的miRNA结合位点猕猴和苏斯克罗法使用RNA杂交进行预测(33)，目标扫描(34)和microRNA数据库(35). 该预测基于一种确定miRNAs和给定mRNA之间最佳互补性的算法。当混合自由能小于−30 kcal/mol且至少在两个数据库中识别时，选择预测的靶位点。
荧光素酶报告分析。
如前所述处理荧光素酶报告分析(36)进行了以下修改。使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂，用50 ng psiCheck2-HO-1-WT或psiCheck 2-HO-1-Mut质粒和100 mM浓度的miR-24-3p模拟物或miR-24-3 p-Mut模拟物或阴性对照（NC）模拟物共同转染HEK293FT细胞（德国曼海姆罗氏）。转染后36 h，根据制造商的说明，对细胞进行裂解，并使用双荧光素酶报告分析系统（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）在Synergy HT多模式微板阅读器（BioTek，Winooski，VT）上测量荧光素素酶的表达。
与Ago2共免疫沉淀。
如前所述，进行RNA诱导沉默复合物（RISC）免疫沉淀分析(27,37)进行了以下修改。MARC-145细胞接种在6孔板中，密度为2×105细胞/孔。24小时后，根据制造商的说明，使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（德国曼海姆罗氏）将150 nM浓度（最终）的miR-24-3p模拟物、miR-24-3 p-Mut模拟物或NC模拟物转染细胞36小时。使用小鼠抗Ago2单克隆抗体（克隆2E12-1C9；Abnova）测量输入细胞裂解液中的Ago2蛋白。IgG用作同型对照。
流式细胞术分析。
MARC-145细胞接种在密度为0.5×10的24孔室载玻片中5细胞/孔。24小时后，使用X-tremeGENE siRNA转染试剂（德国曼海姆罗氏）将150 nM浓度的miR-24-3p模拟物、NC模拟物或siHO-1（作为阳性对照）转染细胞12小时，然后以0.01的感染倍数（MOI）感染rHP-PRRSV/SD16/EGFP，然后在37°C下用5%CO处理48小时2从感染后1小时（hpi）开始，在CoPP（20μM）的存在下。流式细胞术检测EGFP-PRRSV阳性细胞。
定量逆转录酶PCR（qRT-PCR）。
根据制造商的说明，使用TRIzol试剂分离MARC-145细胞、PAM或上清液PRRSV RNA的总RNA，并使用Primescript RT试剂盒（中国大连TaKaRa）进行逆转录。定量PCR（qPCR）使用Step One Plus实时PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）和FastStart Universal SYBR绿色硕士（瑞士巴塞尔罗氏）进行，PRRSV定量PCR（q PCR）的HO-1和ORF7正向和反向引物如前所述(19). β-肌动蛋白mRNA作为内部参照物。
为了检测miR-24-3p，用特异性引物5′-CTCAACTGGTGTGGAGTCGGTCGGCAATTGAGCTGCCT-3′逆转录总RNA。qPCR使用FastStart Universal SYBR绿色母体混合物（瑞士巴塞尔罗氏）与miR-24-3p特异正向引物5′-ACCTCAGCTTGGGTTCAGTTCAGCAG-3′和通用反向引物5’-CTCACTGTCGTGGAGTGCAGCAGTCAG-3′进行。U6 RNA的丰度可作为内部参考。
为了检测上清液PRRSV RNA，使用携带PRRSV ORF7序列372 bp片段的质粒生成标准曲线。标准曲线是根据标准DNA系列稀释液的平行PCR结果绘制的。通过标准曲线归一化计算RNA绝对量。
蛋白质印迹分析。
如前所述进行蛋白质印迹(38)稍作修改。裂解MARC-145细胞或PAM，用SDS-PAGE分离细胞蛋白并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用以下一种初级抗体探测PVDF膜：小鼠抗HO-1多克隆抗体，稀释度为1:1000(19)，单克隆抗体（6D10）(32)PRRSV N蛋白1:2000稀释，或抗α-微管蛋白抗体1:5000稀释（美国马萨诸塞州坎布里奇Abcam）。使用1:2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗小鼠IgG（Jackson，West Grove，PA，USA）标记一级抗体结合。使用增强化学发光（ECL）试剂（皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国）对免疫标记蛋白进行可视化。
病毒滴定。
如前所述，通过滴定法测定病毒子代产量(38)稍作修改。病毒感染前24小时，将MARC-145细胞胰蛋白酶化并接种在96周板中。通过连续稀释制备病毒上清液，并将100μl溶液添加到每个孔中，每个孔重复8次。感染6天后，50%组织培养感染剂量（TCID50)采用Reed-Muench方法计算。
统计分析。
所有实验都是通过至少三个独立实验进行的。统计显著性由Student’st吨仅比较两组时进行测试，或比较两组以上时进行单因素方差分析（ANOVA）。A类对<0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
HO-1 miRNA调控因子的预测和选择。
为了鉴定与猴和猪HO-1 3′UTR互补的miRNAs，我们进行了生物信息学使用许多生物信息学工具进行分析。我们在猴和猪HO-1的3′UTR中分别发现了5个猴miRNA和2个猪miRNA，它们具有潜在的结合位点。确定为潜在靶向猴HO-1的miRNAs为miR-24-3p、miR-217b、miR-377、miR-760和miR-762，而潜在靶向猪HO-1的为miR-24-3p和miR-92b-5p。miR-24-3p的成熟序列预计会通过种子配对相互作用与HO-1 3′UTR从269位到272位（猴子）和323位到326位（猪）相互作用（参见和). 猴HO-1 3′UTR中至少有两个推测的miR-217位点和一个推测的miR-377种子匹配位点。在猴HO-1 3′UTR中发现了一个miR-760和五个预测的miR-762结合位点。在猪的HO-1 3′UTR中发现了四个预测的miR-92-5p结合位点（数据未显示）。
miR-24-3p靶向猴HO-1的3′UTR。（A） 猴HO-1的3′UTR包含一个miR-24-3p的结合位点（突出显示）。（B） 猴HO-1 3′UTR种子结合位点的四个核苷酸被替换。（C） 与psiCheck2-mHO-1-WT或psiCheck 2-mHO-1-Mut和100 nM浓度的NC模拟物或miR-24-3p模拟物共同转染的HEK293FT细胞裂解液中的荧光素酶活性。（D） 将四个核苷酸突变引入miR-24-3p的种子靶位点，显示突变miR-24-3 p与猴HO-1 mRNA突变3′UTR之间的种子结合恢复。（E） 与psiCheck2-mHO-1-WT或psiCheck 2-mHO-1-Mut和100 nM浓度的NC模拟物或miR-24-3p-Mut模拟物共同转染的HEK293FT细胞裂解液中的荧光素酶活性。面板C和E中的数据表示为四个独立实验的平均值±标准偏差；对使用Student的t吨测试。***，对<0.001（相对于模拟控件）。
miR-24-3p靶向猪HO-1的3′UTR。（A） 猪HO-1的3′UTR含有一个miR-24-3p的结合位点（突出显示）。（B） 替换了猪HO-1 3′UTR种子结合位点的四个核苷酸。（C） 与psiCheck2-pHO-1-WT或psiCheck 2-pHO-1-Mut和100 nM浓度的NC模拟物或miR-24-3p模拟物共同转染的HEK293FT细胞裂解液中的荧光素酶活性。（D） 将四个核苷酸突变引入miR-24-3p的种子靶位点，显示突变miR-24-3 p与猪HO-1 mRNA突变3′UTR之间的种子结合恢复。（E） 与psiCheck2-pHO-1-WT或psiCheck 2-pHO-1-Mut和100 nM浓度的NC模拟物或miR-24-3p-Mut模拟物共同转染的HEK293FT细胞裂解液中的荧光素酶活性。面板C和E中的数据表示为四个独立实验的平均值±标准偏差；对使用Student的t吨测试。***，对<0.001（相对于模拟控件）。
为了研究候选miRNAs是否可以通过与3′UTR结合来降低HO-1的表达，采用基于质粒的荧光素酶报告基因分析来检测miRNAss过度表达对细胞报告基因表达的影响。“mml-”前缀用于表示来自猕猴（monkey），“ssc-”前缀用于表示来自苏斯克罗法（清管器）。通过与miRNA模拟物和含有猴HO-1 3′UTR（psiCheck2-mHO-1-WT）或猪HO-1 3’UTR（psiCheck2-pHO-1-WT）的荧光素酶报告子共转染细胞，监测各种miRNA对报告基因表达的影响。如所示mml-miR-24-3p和mml-miR-217b的过度表达导致psiCheck2-mHO-1-WT中荧光素酶表达分别减少49%和45%。相反，与其他三种miRNA或阴性对照（NC）共转染没有效果。只有ssc-miR-24-3p显著降低了psiCheck2-pHO-1-WT中荧光素酶的表达42%(). 由于miR-24-3p在不同寄主物种之间具有很好的保守性()并显著抑制psiCheck2-mHO-1-WT中荧光素酶的表达()和psiCheck2-pHO-1-WT()，选择它进行进一步的验证研究。
荧光素酶报告活性测定确定miR-24-3p是HO-1的调节因子。（A） 将HEK293FT细胞与指示的模拟物和psiCheck2-mHO-1-WT（包含猴HO-1 3′UTR的荧光素酶报告子）共同转染。（B） 将HEK293FT细胞与指示的模拟物和psiCheck2-pHO-1-WT（包含猪HO-1 3′UTR的荧光素酶报告子）共同转染。36 h后，对细胞进行裂解，并测量荧光素酶活性。面板A和B中的数据表示为四个独立实验的平均值±标准差；对使用Student的t吨测试。***，对<0.001（相对于模拟对照）。（C） miR-24-3p在人、猴和猪中的序列同源性。NC用于表示阴性对照。“hsa-”前缀用于表示来自智人（人类），“mml-”前缀用于表示来自猕猴（monkey），“ssc-”前缀用于表示来自苏斯克罗法（清管器）。
miR-24-3p直接与HO-1 mRNA的3′UTR相互作用。
研究miR-24-3p是否直接靶向HO-1 mRNA的3′UTR，其中包含miR-24-3 p的预测种子匹配位点(和)，两种猴HO-1 3′UTR种子序列突变的影响()和猪()已检查。正如预期的那样，miR-24-3p模拟物显著抑制psiCheck2-mHO-1-WT的荧光素酶活性约62至75%(). 使用含有猪HO-1 3′UTR、psiCheck2-pHO-1-WT的构建物也观察到类似的效果。miR-24-3p模拟物显著降低了psiCheck 2-pHO-1WT的荧光素酶表达约62至75%(). 含有猴HO-1 3′UTR（psiCheck2-mHO-1-Mut）或猪HO-1 3’UTR（psi Check2-pHO-1-Mut）质粒的种子序列被破坏，miR-24-3p模拟物抑制荧光素酶表达的能力被破坏(和）。
为了证实上述结果，突变miR-24-3p（miR-24-3p-Mut）恢复了与突变HO-1 3′UTR序列的碱基互补性(和)并检测其对WT和突变HO-1 3′UTR报告活性的影响。如所示miR-24-3p-Mut模拟物不影响psiCheck2-mHO-1-WT的荧光素酶表达(). 相反，miR-24-3p-Mut模拟物显著降低psiCheck2-mHO-1-Mut的荧光素酶活性()和psiCheck2-pHO-1-Mut(). 这些结果表明，miR-24-3p可以直接靶向HO-1 mRNA的3′UTR。
为了进一步证明miR-24-3p和HO-1 mRNA的3′UTR之间的直接相互作用，进行了Ago2共免疫沉淀分析，以检测当miR-24-3 p过度表达时，RNA诱导沉默复合物（RISC）是否可以保留HO-1 mRNA。用miR-24-3p模拟物、miR-24-30p-Mut模拟物或NC模拟物转染MARC-145细胞，并用于免疫沉淀Ago2。如所示与IgG同型对照相比，与Ago2蛋白相关的miR-24-3p水平增加了4000倍。在输入细胞裂解物中，转染miR-24-3p模拟物的细胞中HO-1 mRNA的水平比转染NC模拟物或miR-24-3 p-Mut模拟物细胞中HO-1mRNA的含量低60%左右(). 然而，与NC模拟物或miR-24-3p-Mut模拟物水平相比，miR-24-3模拟物存在时Ago2共免疫沉淀mRNA中HO-1 mRNA的丰度增加了约2倍(). 这些结果表明，miR-24-3p在RISC中与猴HO-1 mRNA直接相互作用。
miR-24-3p与RISC中HO-1 mRNA物理结合。从输入细胞、Ago2共免疫沉淀或MARC-145细胞裂解物免疫沉淀中提取的RNA中miR-24-3p（A）和HO-1 mRNA（B）的qPCR分析。miR-24-3p水平归一化为U6水平。HO-1 mRNA水平归一化为β-肌动蛋白水平。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。对使用Student的t吨测试。***，对< 0.001.
miR-24-3p下调MARC-145细胞HO-1的表达。
为了确定miR-24-3p的过度表达是否会降低HO-1的表达，用miR-24-3模拟物、miR-24-30p-Mut模拟物、NC模拟物或siHO-1（作为阳性对照）转染MARC-145细胞，并检测HO-1的表现。如所示miR-24-3p模拟物和siHO-1转染导致HO-1 mRNA表达显著降低(). 当用miR-24-3p模拟物转染MARC-145细胞时，HO-1 mRNA的表达水平降低了80%(). NC模拟物或miR-24-3p-Mut模拟物对HO-1表达没有影响。Western blot分析用于确认HO-1 siRNAs和miR-24-3p对HO-1蛋白水平的影响().
miR-24-3p的过度表达降低了MARC-145细胞中HO-1 mRNA和蛋白水平。通过qRT-PCR（A）或Western blotting（B）测定转染200 nM浓度miR-24-3p拟态、miR-24-3 p-Mut拟态、NC拟态或siHO-1（阳性对照）的MARC-145细胞中HO-1和miR-24-30p的相对表达水平。α-微管蛋白作为负载对照。面板A中的数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差；对使用Student的t吨测试。***，对<0.001（相对于模拟控件）。
PRRSV感染诱导miR-24-3p表达。
为了确定PRRSV感染是否影响miR-24-3p的表达水平，在PRRSV侵染期间用qPCR定量MARC-145细胞中的miR-24-3 p水平。如所示感染PRRSV后2 h，MARC-145细胞miR-24-3p表达上调；它在12hpi（600%）时达到峰值表达，然后随着感染的进展其表达逐渐下降，但仍显著高于模拟对照的水平。此外，用流式细胞术检测重组EGFP-PRRSV感染阳性细胞的比例。结果表明，36 hpi时EGFP阳性MARC-145细胞感染PRRSV的百分比为34%（数据未显示）。然而，重要的是，紫外线照射灭活的PRRSV并没有改变miR-24-3p的表达().
PRRSV感染诱导miR-24-3p的表达。用PRRSV SD16株（MOI为1.0）感染MARC-145细胞，然后用qPCR测定指定时间点的miR-24-3p水平。数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。对使用Student的t吨测试**，对< 0.01; ***,对<0.001（相对于模拟控件）。
miR-24-3p逆转HO-1诱导对PRRSV感染的抑制作用。
原卟啉IX氯化钴（CoPP）是HO-1基因表达的经典诱导剂。我们之前的研究表明，CoPP诱导HO-1可以有效抑制PRRSV感染，而之前的siRNA敲除可以逆转这种情况(19). 为了检测miR-24-3p的过度表达是否逆转HO-1对PRRSV感染的抑制作用，MARC-145细胞先用miR-24-3模拟物进行预处理，然后用CoPP进行处理，然后再用表达EGFP的PRRSV进行感染。如所示在CoPP处理的MARC-145细胞中，用miR-24-3p模拟物或siHO-1预处理分别使EGFP-PRRSV阳性细胞增加110%或150%，而miR-24-3 p-Mut模拟物没有显著作用。
miR-24-3p逆转HO-1诱导对PRRSV感染的抑制作用。将200 nM浓度的miR-24-3p拟态、miR-24-3 p-Mut拟态、NC拟态或siHO-1（作为阳性对照）转染MARC-145细胞12 h，然后感染rHP-PRRSV/SD16/EGFP（MOI为0.01）48 h或PRRSV SD16株（MOI值为0.01）24 h，然后从1 hpi开始用CoPP（20μM）治疗。用流式细胞术（A）检测感染PRRSV 48 hpi的EGFP阳性细胞百分比。通过qRT-PCR对细胞外PRRSV ORF7 RNA和上清液中病毒滴度（B）以及细胞内PRRSV OR F7 RNA（C）进行PRRSV复制评估。（D） 对细胞内PRRSV N蛋白进行蛋白质印迹。α-微管蛋白作为负载对照。面板A至C中的结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。对使用Student的t吨测试*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对<0.001；ns，不显著。
为了确认miR-24-3p是否逆转HO-1诱导对野生型（WT）PRRSV复制的影响，在转染miR-24-3模拟物、NC模拟物或HO-1 siRNA作为阳性对照后，通过HO-1诱导MARC-145细胞中的病毒复制进行评估。用miR-24-3p模拟物或siHO-1对CoPP处理的MARC-145细胞进行预处理，可显著提高病毒滴度(（左）和上清液中PRRSV RNA的水平(，右），细胞内PRRSV RNA()和细胞内PRRSV蛋白()与用NC模拟物处理的细胞水平相比，而用miR-24-3p-Mut模拟物处理没有影响。上清液中的病毒滴度增加了0.71 log10经miR-24-3p模拟物预处理的CoPP处理的MARC-145细胞中细胞外PRRSV ORF7 RNA的表达水平上调了93%(). CoPP处理的MARC-145细胞经miR-24-3p模拟物预处理后，细胞内PRRSV ORF7 RNA的表达水平增加了200%(). 在用miR-24-3p模拟物预处理的CoPP处理的MARC-145细胞中，细胞内PRRSV N蛋白的表达水平增加了38%().
在PAM中使用WT PRRSV进行了类似的实验，并观察到类似的结果(). 在用miR-24-3p模拟物预处理的CoPP处理的PAM中，胞外PRRSV ORF7 RNA的表达水平增加了55%(). 经miR-24-3p模拟物预处理的CoPP处理的PAM中细胞内PRRSV ORF7 RNA水平增加了约55%(). 用miR-24-3p模拟物预处理的CoPP处理的PAM中细胞内PRRSV N蛋白的表达水平也增加了44%().
miR-24-3p逆转HO-1诱导对PAM中PRRSV复制的抑制作用。将200 nM浓度的miR-24-3p拟态、miR-24-3 p-Mut拟态、NC拟态或siHO-1（作为阳性对照）转染PAM 12 h，然后感染PRRSV SD16株（MOI为0.01）24 h，然后从1 hpi开始用CoPP（5μM）治疗。通过qRT-PCR评估上清液（A）中细胞外PRRSV ORF7 RNA和细胞内PRRSV OR F7 RNA（B）中的PRRSV复制。以α-微管蛋白为对照（C），对细胞内PRRSV N蛋白进行Western blotting。结果表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。对使用Student的t吨测试*，对< 0.05; **,对< 0.01; ***,对<0.001；ns，不显著。
讨论
HO-1表达的调节主要发生在转录水平(39)；然而，最近的报道表明，HO-1的表达也可以通过miRNAs在某些细胞类型中的转录后调节(40). miRNAs通过识别互补序列靶元件降低基因表达。本研究表明，靶向HO-1的miRNAs可能调节PRRSV的复制。同时使用生物信息学和在体外方法，我们证明miR-24-3p是HO-1表达的关键调节因子。mml-miR-24-3p和mml-miR217b通过靶向猴HO-1 3′UTR调节荧光素酶表达，ssc-miR-24-3 p通过靶向猪HO-1 3’UTR调节表达(). 先前的研究表明，miR-377单独或与miR-217联合靶向人HO-1 3′UTR(29). 我们的结果表明，mml-miR-217b的过度表达，而不是mml-miR-377，显著降低了包含猴HO-1 3′UTR的荧光素酶报告子的荧光素酶表达()尽管在猴HO-1的3′UTR中存在预测的结合位点。重要的是，猴和猪HO-1基因都预测了其3′UTR中miR-24-3p的结合位点，并且通过荧光素酶活性测定验证了它们调节HO-1表达的能力(到)和Ago2共免疫沉淀分析(). 此外，miR-24-3p在不同寄主物种之间具有很好的保守性().
miRNAs通过抑制mRNA翻译或诱导mRNA降解下调基因表达(41,42). 先前研究表明，miR-377和miR-217通过翻译抑制而不是mRNA降解下调HEK293细胞和原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中HO-1的表达(29). miR-196和let-7 miRNA直接靶向Bach-1 mRNA的3′UTR，Bach-1是哺乳动物HO-1的一种碱性亮氨酸拉链转录抑制物，翻译性抑制该蛋白的表达，从而上调HO-1基因的表达(43,44). 我们的结果表明，MARC-145细胞中miR-24-3p的过度表达显著下调HO-1 mRNA和蛋白的表达(). 这些结果表明，miR-24-3p可能通过mRNA降解和翻译抑制降低HO-1的表达。此外，CoPP处理显著下调了MARC-145细胞和PAM中miR-24-3p的表达（数据未显示）。总之，这些结果表明miR-24-3p的表达与HO-1水平呈负相关。
miR-24-3p在细胞增殖和分化中的作用已被研究(45,–47)以及在缺氧和微生物感染条件下应激反应中的作用(48,49). 通过microRNA测序分析，miR-24-3p被鉴定为与乳腺癌缺氧基因特征相关(48). 在这项研究中，PRRSV感染MARC-145细胞显著诱导了miR-24-3p(). HO-1在保护宿主免受病毒感染方面起着重要作用(13,15,–17). CoPP治疗上调HO-1，感染前和感染后显著抑制埃博拉病毒（EBOV）转录/复制(50). HO-1的诱导或过度表达也抑制丙型肝炎病毒（HCV）的复制并保护肝细胞免受氧化损伤(14). 此外，HO-1产物胆绿素通过增加抗病毒干扰素反应抑制HCV复制(51,52). 我们之前的工作表明，使用不同浓度的CoPP诱导HO-1，可显著降低重组PRRSV和野生型PRRSV的复制，且呈剂量依赖性。使用特定siRNA敲除HO-1逆转HO-1对PRRSV复制的抑制作用(19). 这些结果表明HO-1的表达与PRRSV复制的抑制有直接关系。在本研究中，我们研究了miR-24-3p能否逆转HO-1对PRRSV复制的抑制作用。正如预期的那样，用miR-24-3p或siHO-1预处理可显著逆转CoPP诱导MARC-145细胞HO-1后PRRSV复制的抑制()和PAM(). 这些结果表明，miR-24-3p通过抑制HO-1表达促进PRRSV复制。
总之，我们首次证明HO-1的表达受miR-24-3p的调节。PRRSV感染PRRSV-permitive细胞可诱导miR-24-3p表达。miR-24-3p随后与HO-1的3′UTR中的功能位点结合，并下调HO-1基因的表达，以促进PRRSV的复制。这些发现不仅为研究PRRSV感染过程中的病毒-宿主相互作用提供了新的见解，也为未来PRRSV的感染提供了潜在的新控制措施。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金的资助(31472173;,31430084;,31101690;,31302060;,31302103)国家高技术研究发展计划(2011AA10A208年)陕西省自然科学基础研究计划(2014年JQ3088)、西北农林科技大学人才专项基金(Z111021201号)和基本研究基金(QN2013028号). I.G.G.是威康高级研究员，由威康信托基金资助(重量097997毫安).
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