骨骼肌作为内源性硝酸盐库

摘要

介绍

在哺乳动物中，一氧化氮（NO）是一种具有广泛作用的信号分子——NO参与了血管内稳态、凝血、免疫反应和神经信号传递等多种过程[1-4]. 当组织中的氧气供应充足时，NO主要由一氧化氮合酶（NOS）家族的酶将精氨酸酶转化为瓜氨酸而产生。在氧气供应减少的情况下，通过脱氧血红蛋白中的5-配位亚铁血红素或其他亚铁血色素和几种组织中含钼蝶呤的酶减少亚硝酸盐提供额外的NO[5-9]. 亚硝酸盐是通过血液中过量NO的氧化或通过含钼蝶呤的哺乳动物硝酸还原酶（如黄嘌呤氧化还原酶或醛氧化酶）还原硝酸盐来提供的[10-16]或各种唾液细菌硝酸还原酶[17;18]. 硝酸盐是一氧化氮或亚硝酸盐被血红素蛋白质（如氧合血红蛋白或氧合肌红蛋白）氧化的最终产物，也从各种饮食来源进入人体。有关NO循环当前知识的详细信息，请参见van Faassen等人的广泛审查[三].

一般来说，只有血液和内脏器官，尤其是心脏和肝脏被认为是一氧化氮代谢产物循环的活性部位[7;9;12;19;20]. 平滑肌很早就被认为是NO作用的靶器官，但关于骨骼肌在NO循环或其功能中发挥重要作用的可能性，却鲜有报道。然而，Murad等人在1993年发现，骨骼肌组织中大量表达神经元NOS（nNOS或NOS1）[21]. 事实上，后来的研究表明，骨骼肌含有两种不同的活性nNOS剪接变异体，nNOSμ是肌膜中肌营养不良蛋白相关蛋白复合体的重要成员，而nNOSβ位于高尔基复合体中[22]. 这两种NOS蛋白在心肌细胞中的确切作用仍存在争议。有趣的是，某些类型的肌营养不良症（尤其是Duchenne和Becker）中肌营养不良蛋白丢失的进展与肌营养不良素相关蛋白复合物的破坏增加以及nNOSμ解离进入细胞质有关[23]. 值得注意的是，肌肉减少症（随着年龄增长肌肉质量减少的过程）最近与小鼠NOS缺乏有关[24].

近年来，人们也认识到NO在骨骼肌功能中起着重要作用。即使在休息时，它也会在肌肉组织中生成，在收缩时，它的生成量会大幅增加[25]. 当测量从隔离的大鼠肌肉释放到沐浴液中的NO时，在休息状态下NO/mg约为60pmol，而在电刺激期间，NO/mg的值几乎是原来的三倍，达到约150pmol[25]. 当添加L-NMMA（一种通用的一氧化氮合酶抑制剂）时，NO释放被抑制到静息值的一半左右，与静息状态相比，添加精氨酸或SNP（NO供体）使释放的NO加倍。上述数值表明，骨骼肌的NOS活性很重要，即使在休息状态下，这可能会使骨骼肌作为哺乳动物体内最大的器官，成为NO及其代谢物的主要产生场所。NO参与调节静息和运动诱导的血流，可能导致活动性功能性充血，还通过增加细胞葡萄糖摄取参与骨骼肌代谢。关于骨骼肌中NO作用的综述，请参阅[26]. 据推测，由于NO对线粒体呼吸链复合体IV的作用，它还可以提高肌肉的耐力和肌肉修复能力——有关肌肉细胞中已知NO功能种类的更多详细信息，请参阅[27-29].

随着对NO代谢途径的了解越来越多，人们越来越关注NO的来源，如亚硝酸盐，尤其是最近的硝酸盐。这两种离子在大多数内脏器官中都用化学发光法进行了定量[7;9;12;19;20]，但我们还没有发现在骨骼肌中进行过类似的测量。

我们假设，骨骼肌是NO稳态的一个重要因素，因为功能性nNOS亚型和氧化肌红蛋白在同一腔室中共同定位。活动nNOS的存在表明就地大量NO的形成，而肌红蛋白（主要以含氧肌红蛋白形式）与之密切相关，将导致过量NO的快速失活和硝酸盐的形成。黄嘌呤氧化还原酶的存在及其已知的硝酸还原酶活性，可能进一步增强骨骼肌作为NO稳态中可能的主要参与者之一的重要性。在这项研究中，我们发现啮齿动物腿部骨骼肌中含有异常高浓度的硝酸盐。我们还测量了大鼠肌肉黄嘌呤氧化还原酶的硝酸还原酶活性，发现即使在pH值为7.4的情况下，硝酸盐也会降低，尽管降低的水平很低。综上所述，这些发现支持了骨骼肌是NO循环中一个活跃且重要的隔间的假设。

材料和方法

成年Wistar雄性大鼠（n=6，体重250±50g，Charles River Laboratories，Wilmington，MA），成年nNOS^−/−小鼠（n=5，背景C57BL/6，美国杰克逊实验室）和成年野生型小鼠（n=10，C57BL/6J，美国NCI Frederick）被封闭在麻醉箱中，并使用5%异氟醚与空气的混合物进行麻醉。麻醉后的动物以仰卧姿势放置在垫子上，通过鼻锥继续麻醉。打开胸腔，通过心脏穿刺收集约9-10ml的血液；对于这种大小的动物来说，大约占总血容量的三分之二。从小鼠身上采集了大约1ml的血液。肝素用作亚硝酸盐和硝酸盐测定中的抗凝剂。抽血后，立即将血液与含有铁氰化钾、NEM和洗涤剂的“停止”溶液混合，最终比例为2:1，如[30]为了防止亚硝酸盐被血红蛋白降解。抽血后不久，从后腿的肝脏和骨骼肌中采集样本，放入250μl的停止溶液中进行化学发光分析，或在干冰上速冻进行Western blot和硝酸盐或亚硝酸盐还原酶分析。在分析之前，所有样品均保存在−80°C的温度下。动物被安置在12小时的光/暗循环环境中，可以随意获得食物和饮用水。所有动物程序均按照NIDDK动物护理和使用委员会批准的协议下NIH实验动物护理和应用指南中的建议进行。

根据先前发布的程序，对小鼠和大鼠组织中的亚硝酸盐和硝酸盐进行标准化学发光分析[30;31]. 对组织样品进行称重，与额外的停止溶液混合，并使用GentleMacs（Miltenyi Biotec Inc，Auburn，CA）均质。使用甲醇沉淀蛋白质（稀释1:3样品：甲醇），并在4°C下以11000g离心5分钟以分离大部分蛋白质。收集上清液并使用化学发光法测定亚硝酸盐/硝酸盐含量（Sievers 280i一氧化氮分析仪，GE Analytical Instruments，美国）。

根据最近公布的程序，对大鼠肝脏和骨骼肌组织进行硝酸还原酶测定[14]. 由于小鼠组织样本数量不足，我们在这些实验中仅限于大鼠组织。简单地说，使用GentleMacs组织解离器（Miltenyi Biotech，Auburn，CA，USA）使组织匀浆化，使用双茚二酸（BCA）检测试剂盒（Pierce Rockford，IL）测定匀浆中的总蛋白，并根据需要调整至7 mg/ml。然后，添加300μM或500μM硝酸盐以及硝酸还原酶辅因子混合物（AO/XOR），在0 min、30 min、1h、2h、3h、4h和24h取等分试样，用化学发光法分析亚硝酸盐含量。辅因子混合物由1 mM NADPH（Fluka）、2 mM UDP葡萄糖醛酸（UDPGA）、0.5 mM谷胱甘肽（GSH）、0.5 m M NAD+和NADH（均来自Sigma）组成，100 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4[14]. 实验在37°C下进行，样品保持在2%氧气下。骨骼肌功能性充血发生在剧烈运动时，肌肉组织中的氧可用性降低。氧浓度降低的结果取决于运动强度和持续时间。我们选择2%的氧气进行体外实验，因为我们假设它可能接近肌肉在运动期间可能受到的氧气张力降低。在XOR和AO的可比条件下，在相同氧气水平下进行肝匀浆实验。

为了研究大鼠肝脏中观察到的硝酸盐减少是否是两种已知的硝酸盐还原酶黄嘌呤氧化还原酶（XOR）和醛氧化酶（AO）作用的结果，我们分别使用了XOR和AO抑制剂氧嘌呤醇和雷洛昔芬。在时间0将抑制剂与浓度为300μM的硝酸盐一起添加到组织匀浆中，硝酸盐还原试验如上所述进行。我们使用了100μM氧嘌呤醇和50nM雷洛昔芬。

大鼠肝脏和骨骼肌匀浆由GentleMacs组织解离器与含有蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，Cat.#S8830）的RIPA缓冲液（Sigma#R0278）制备，然后通过BCA分析测定蛋白质浓度。变性样品（50μg）在SDS-PAGE上运行，然后转移到硝化纤维素膜上。将膜与一级抗体（Anti-XOR：Santa Cruz Biotechnology，sc-20991；Anti-AO：Santa Cruz Bietechnologies，sc-98500；Anti-GAPDH：Sigma-Aldrich，G9545）在4℃孵育过夜，然后在4℃用抗兔荧光抗体（Licor Biosciences，926-32211）免疫印迹1小时。使用奥德赛成像系统（Licor Biosciences）对斑点进行成像。

使用单向方差分析检验结果的统计显著性。

结果

为了研究肌肉中高硝酸盐水平的可能机制，我们测量了野生型（C57BL/6）和nNOS中的硝酸盐水平^−/−野生型和nNOS的硝酸盐浓度^−/−骨骼肌中的小鼠为113±5.8和13.2±5，血液中为48.9±17.3和9.7±2.3，肝脏中为16.9±5nmol/g。nNOS骨骼肌和血液中的硝酸盐浓度^−/−小鼠显著低于对照小鼠（两种情况下均p<0.05），如图1A野生型和nNOS中所有小鼠组织中的亚硝酸盐水平相似^−/−小鼠（数据未显示）。

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图1

（A） 野生型（灰条）和nNOS骨骼肌、血液和肝脏中的硝酸盐分布^−/−（黑条）小鼠、（B）硝酸盐和（C）亚硝酸盐在Wistar大鼠肝脏、血液和骨骼肌中的分布

用化学发光法测定组织匀浆和血液中的一氧化氮代谢产物，分别用三碘或氯化钒还原亚硝酸盐和硝酸盐溶液。10种野生型和5种nNOS的组织和血液^−/−实验中使用了小鼠和9只大鼠，最终结果以每克原始组织中亚硝酸盐和硝酸盐含量计算。

大鼠肝脏、血液和骨骼肌中的硝酸盐浓度分别为12.7±4.6、76.6±2.6和212.4±52.1 nmol/g。因此，肌肉中的硝酸盐浓度显著高于肝脏和血液中的硝酸盐浓度（p<0.05），但肝脏中的硝酸盐水平显著低于血液中的硝酸盐水平（p<0.05）(图1B).

我们发现，大鼠肝脏、血液和骨骼肌中的亚硝酸盐浓度分别为0.8±0.5、0.5±0.2和0.6±0.2 nmol/g组织。如中所示图1C骨骼肌和肝脏中的亚硝酸盐水平具有可比性，并且这两个值都有略高于血液中的趋势（但无统计学意义）。

显示了在2%氧气条件下测定的大鼠骨骼肌和肝匀浆中硝酸还原酶的测定结果，并与图2A和B在将硝酸盐添加到最终浓度100、300或500μM后，我们在接下来的4小时内测量了匀浆中的亚硝酸盐浓度，最后一点在24小时测得(图2C和D). 在肝脏中，添加不同浓度的硝酸盐后，我们观察到匀浆中亚硝酸盐在接下来的4小时内呈线性增加(图2A)分别为1.5、4.8和10.9nmol/（h x g组织）。添加硝酸盐4小时后，在不同起始硝酸盐水平的肝匀浆中发现亚硝酸盐的含量存在显著差异（p<0.05）。图2B显示了骨骼肌匀浆的结果。硝酸盐还原为亚硝酸盐的计算速率为0.4、0.5和0.9 nmol/（h x g组织），这一数值明显低于肝脏的观察值。在不同的启动条件下，亚硝酸盐的累积量没有显著差异。为了更清楚地比较这两个器官，在添加100、300和500μM硝酸盐后4小时和24小时测量肝脏和肌肉匀浆中的亚硝酸盐总量，见图2C和D在肝脏中，首次添加100、300和500μM硝酸盐后，硝酸盐还原反应导致亚硝酸盐在24小时内进一步累积，100和300μM硝酸酯达到统计显著性（p<0.05）。

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图2

大鼠肝脏（A）和骨骼肌（B）匀浆中硝酸还原酶的测定

根据公布的方案进行分析[14]. 新鲜肝匀浆与NADPH、UDP葡萄糖醛酸、NAD混合⁺NADH和谷胱甘肽，为XOR/AO提供所有必要的辅因子和还原环境。添加100、300和500μM硝酸盐后，将匀浆混合物在37℃含2%氧气的大气中培养，并在30 min、1、2、3、，4小时和24小时后，通过化学发光分析测定亚硝酸盐生成量/克肝组织。A组和B组总结了前4小时亚硝酸盐水平随时间的变化。C组和D组比较了添加100、300和500μM硝酸盐后4和24小时肝脏（C）和骨骼肌（D）中总硝酸盐转化为亚硝酸盐的情况。本实验使用了四只大鼠的肌肉和肝脏组织。

图3A显示了XOR抑制剂氧嘌呤醇和AO抑制剂雷洛昔芬在pH 7.4下添加300μM硝酸盐后4小时内对肝匀浆中硝酸盐还原大鼠的影响。虽然氧嘌呤醇显著抑制硝酸盐还原（p<0.05），但雷洛昔芬几乎没有作用，这表明大部分还原是由于XOR。

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图3

XOR抑制剂氧嘌呤醇和AO抑制剂雷洛昔芬对肝脏硝酸盐还原的影响

我们使用100μM氧嘌呤醇和50nM雷洛昔芬，在0h时与300μM硝酸盐一起添加，硝酸还原酶试验遵循与未添加抑制剂的情况下收集数据相同的方案。本实验使用了三只不同大鼠的肝匀浆。

使用蛋白质印迹检查大鼠骨骼肌组织和肝脏中XOR和AO的存在，如图4XOR在肌肉和肝组织中有显著表达，而AO在骨骼肌组织中表达水平很低，但可以检测到。

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图4

骨骼肌和肝组织中XOR和AO的典型Western印迹

骨骼肌和肝脏匀浆样品（50μg）在SDS-PAGE上运行，并转移到硝酸纤维素膜上进行免疫印迹。主要抗体（抗XOR、-AO和-GAPDH）在4°C下培养过夜，然后使用抗兔荧光抗体通过Odyssey成像系统成像。四只大鼠的组织用于独立实验。

讨论

有许多关于不同动物物种和人类器官和血液中亚硝酸盐和/或硝酸盐浓度测量的报告。我们在对照野生动物（小鼠和大鼠）的肝脏和血液中的数据与这些报告一致[32-34]. 据我们所知，到目前为止，骨骼肌中亚硝酸盐和/或硝酸盐的含量还没有报道。这些关于啮齿动物骨骼肌组织中硝酸盐浓度的新结果表明，该组织是哺乳动物体内最大的器官之一，可能在哺乳动物的氮代谢中发挥重要作用。

啮齿动物骨骼肌组织中意外高的硝酸盐含量可能是由于该组织的nNOSμ和nNOSβ活性所致。当比较野生型和nNOS骨骼肌组织中的硝酸盐水平时^−/−与野生型动物相比，缺乏nNOS酶的小鼠骨骼肌和血液中的硝酸盐含量显著降低，如图1AnNOS中的硝酸盐水平^−/−小鼠可能源于其他一氧化氮合酶亚型（eNOS（NOS3）和iNOS2）产生的一氧化氮的饮食贡献和氧化。我们假设，高水平的硝酸盐是由局部NO的产生及其氧化引起的，因为骨骼肌中含有高浓度的氧化肌红蛋白，它与NO强烈反应，形成硝酸盐和高铁肌红蛋白。事实上，肌红蛋白作为骨骼肌中NO清除剂的作用被提出，以防止其毒性[35;36]. 肌肉细胞还含有强健的高铁肌红蛋白还原酶系统，可将高铁肌红蛋白还原为肌红蛋白，以保持其作为心肌细胞内的氧转运蛋白的功能[37;38]，并可与NO进一步反应。

然而，肌肉组织内硝酸盐形成的另一种更直接的途径也是可能的。NO不是nNOS酶反应循环中唯一可能的最终产物。事实上，根据铁血红素释放NO并返回初始亚铁氧化状态的途径，可能会产生两种最终产物——NO和硝酸根离子。这种被称为“徒劳”循环的替代过程的细节在其他地方有所描述[39-41]. 由于硝酸盐长期以来仅被视为一种“废物”最终产品，没有太大的生理重要性，因此这一途径直到现在才引起人们的太多兴趣。然而，鉴于最近的发展表明硝酸盐实际上是NO循环的活性成员，我们认为应该更多地关注NOS酶，特别是nNOS酶，可能是骨骼肌组织（或其他组织，如大脑）中硝酸盐的重要来源的可能性，由于NOS亚型相对丰富。事实上，根据mRNA水平的测量，nNOS酶在几乎所有组织中的含量都一样丰富[42]. 因此，根据其普遍分布和潜在功能，最好将其指定为NOS1，而不是nNOS。

分析中的数据时图1B就硝酸盐和亚硝酸盐离子在骨骼肌、血液和肝脏中的分布而言，骨骼肌中的硝酸盐浓度大约是血液中的3倍，大约是肝脏中的17倍。亚硝酸盐离子并没有反映出这种分布，肌肉和肝脏中亚硝酸盐的水平略高于血液中的水平，尽管差异在统计上并不显著。因此，从骨骼肌到血液再到其他组织（如肝脏）的硝酸盐梯度很明显，从这些器官（肝脏和骨骼肌）到血液的亚硝酸盐梯度很小。这种分布使我们得出这样的假设：骨骼肌质量是硝酸盐离子的内源性储存库，硝酸盐离子随后通过血流分布到其他内部器官，特别是肝脏，在肝脏中，它们可以通过XOR或AO的作用转化为亚硝酸盐，并进一步还原为NO。

骨骼肌中硝酸盐“储备”的来源是通过氧化肌红蛋白从nNOS中氧化NO或在nNOS“无效”循环期间直接合成硝酸盐。为了支持这一假设，我们测量了骨骼肌中XOR和AO的硝酸盐减少量，并将其与肝脏中的硝酸盐降低量进行了比较，肝脏是哺乳动物中多次被显示为硝酸盐减少位点的器官[9;12;14]. 结果绘制于图2中所示数据的比较图2A（肝脏）和​和2B2B型（骨骼肌）得出结论，肝脏在减少硝酸盐方面比骨骼肌更有效，这可能是因为肝脏组织中XOR的表达水平要高得多(图4). 用氧嘌呤醇（XOR抑制剂）进行的抑制剂研究证实，XOR是负责肝脏硝酸盐减少的活性蛋白，如图3。AO抑制剂雷洛昔芬的结果也显示在图3表明该蛋白在这些条件下不会促进硝酸盐的减少。然而，值得注意的是，尽管骨骼肌组织的硝酸还原酶活性较低，但当其与身体中的大量总质量和高硝酸盐水平相结合时，即使在休息条件下，肌肉仍可能促进总亚硝酸盐和NO的形成。此外，当骨骼肌处于活动状态时，由于乳酸的形成，组织内的pH值会显著下降。研究表明，XOR硝酸还原酶的活性高度依赖于pH，在较低的pH下会产生较高的活性[12]. 我们认为这一途径很重要，值得进一步研究。

关于本研究的主要发现，骨骼肌中异常高的硝酸盐水平，这些结果影响了关于硝酸盐来源及其在体内循环的普遍接受的范式。目前，饮食中的硝酸盐通常被认为是体内硝酸盐和亚硝酸盐的主要来源[43]. 根据目前的知识，消化道吸收到血液中的膳食硝酸盐通过全身运输，并能缓慢扩散到组织中–血液中硝酸盐的半衰期约为6-8小时–在被肾脏排泄之前。此外，血液中最丰富的蛋白质，即红细胞中的氧合血红蛋白，是一种众所周知的高效亚硝酸盐和NO氧化酶，因此，血液除了在饮食中的硝酸盐运输中发挥作用外，还可能是亚硝酸盐与NO氧化生成硝酸盐的重要来源。

除此之外，正如我们在这里报告的那样，还有一个更大但以前未知的来源于骨骼肌代谢过程的硝酸盐库，其浓度和总储存硝酸盐量都超过了血硝酸盐库。相比之下，成年人大约有5升血液，但大约有10-15公斤骨骼肌。如果我们使用我们对大鼠肝脏和骨骼肌的测量值，这将转化为血液中的亚硝酸盐总量2.5μmol和硝酸盐总量382μM，以及在任何给定时间骨骼肌中可用的7-10.5μM亚硝酸盐和2.12–3.18mmol硝酸盐。这一粗略估计表明，骨骼肌组织很可能是哺乳动物体内最重要的硝酸盐储存库之一。

我们的假设是，骨骼肌是人体内最大的内源性硝酸盐库，这并不矛盾或否定外源性膳食硝酸盐作为人体硝酸盐的重要来源的重要性，血液是其从胃肠道各部分进入内脏器官的主要转运器。根据血液和骨骼肌中硝酸盐的大约3倍浓度梯度，硝酸盐可能通过被动扩散从骨骼肌输送到血液中(图1B). 此外，由于存在从血液到肝脏和其他器官组织的次级硝酸盐梯度，因此不需要血液硝酸盐的主动运输系统到达各种内部器官组织。在这些梯度的驱动下，硝酸盐通过内皮被动扩散到组织的细胞间隙中，这可能是硝酸盐在不同身体部位之间分布的主要机制。

然而，不能完全排除另一种假设，即骨骼肌中的高浓度硝酸盐是由于血液中的硝酸盐主动运输而在该组织中积聚的结果。最近在唾液腺中发现了一种活性硝酸盐转运体唾液酸[44]. 即使这种途径存在于肌肉中，也不会改变我们的观点，即肌肉组织是体内硝酸盐的重要储存库。

此外，体力活动期间的酸中毒或缺氧预测肌肉组织中XOR的硝酸盐还原增加，并打开肌肉细胞内局部硝酸盐还原的可能性，可能为NO。事实上，当检测肝脏和肌肉匀浆的硝酸还原酶活性时，与pH值7.4相比，pH值为6时，硝酸盐形成的亚硝酸盐增加（数据未显示）。然而，即使是这种低XOR活性，再加上大量骨骼肌和高浓度硝酸盐，也足以在正常的基础功能水平上显著支持内部器官和组织的稳态。

结论

我们认为，上述假设代表了哺乳动物体内亚硝酸盐/硝酸盐稳态的内在机制，该机制与不同水平的饮食硝酸盐和亚硝酸盐协同作用，以及最近文献中广泛讨论的共生菌群的重要贡献[1]. 然而，细菌对硝酸盐/亚硝酸盐代谢的贡献也依赖于饮食，因此只能被视为一种高度依赖于扩展因子的额外机制。我们的数据表明，哺乳动物有自己独立于共生细菌的硝酸盐合成、储存和分配机制。出乎意料的是，骨骼肌似乎是控制内在硝酸盐稳态的器官，是其主要的生产场所和分配调节器。根据在大鼠身上收集的数据，建议的内源性扩散驱动的硝酸盐流经哺乳动物身体的过程如图所示图5.

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图5

外源硝酸盐流经哺乳动物身体

硝酸盐分布不均匀，如灰色矩形所示。骨骼肌特异性nNOS亚型在肌细胞中丰富，可直接产生硝酸盐[39]或NO，它被肌肉细胞中的氧化肌红蛋白迅速氧化成硝酸盐。这在骨骼肌组织中创造了一个巨大的内源性硝酸盐库。红色箭头显示了硝酸盐从骨骼肌通过血流进入肝脏的扩散驱动流动。然后，硝酸盐在内脏组织中还原为亚硝酸盐。在当前的工作中，我们将重点放在肝脏上，因为肝脏是一个具有良好描述的硝酸还原酶活性的器官，但其他器官中的实际硝酸盐水平也进行了测量，并且都在肝脏中发现的范围内。饮食中有一种重要的硝酸盐输入血液中，但这种影响的大小是高度可变的，因为它取决于所摄入的饮食。

NO是血管内稳态最有力的调节器，已成为心血管疾病拟议治疗的中心分子之一。许多代谢性疾病，如糖尿病或代谢综合征，似乎也由NO代谢失调或功能障碍引起或与之相关。众所周知，骨骼肌中肌营养不良蛋白复合体中缺失的nNOS与大多数形式的肌营养不良相关，也可能与肌肉减少症有关[23;24]. 更好地了解哺乳动物NO循环及其成分可能会为开发更有效的治疗这些疾病的策略开辟新的途径-见[45;46]. 因此，我们确定哺乳动物体内最大的可再生硝酸盐库，即骨骼肌组织，可能非常相关。

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脚注

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