IEEE Trans生物医学工程。作者手稿；PMC 2015年5月18日提供。
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美国国立卫生研究院：NIHMS688743标准
用于对比增强、图像引导肿瘤切除的集成宽场成像和光谱系统
,IEEE成员,
,,,,，以及 亚伦·M·莫斯
维克森林——弗吉尼亚生物医学工程与科学技术学院癌症生物学系和维克森林再生医学研究所，维克森林大学健康科学学院，美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆
迈克尔·曼奇尼
埃默里大学和佐治亚理工大学，佐治亚州亚特兰大，美国。他现在就职于Spectropath，Inc.，Atlanta，GA，USA
詹姆斯·普罗旺泽尔
美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心放射科
科里·F·萨巴
美国佐治亚州雅典乔治亚大学小动物医学与外科系
凯伦·康奈尔
美国佐治亚州雅典乔治亚大学小动物医学与外科系
伊丽莎白·W·豪斯
美国佐治亚州雅典乔治亚大学病理学系
聂树明
美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学和佐治亚理工学院生物医学工程与化学系
Aaron M.Mohs，维克森林——弗吉尼亚生物医学工程与科学技术学院癌症生物学系和维克森林再生医学研究所，维克森林大学健康科学学院，美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆；
通讯作者。 A.M.Mohs和M.C.Mancini对这项工作的各个方面都做出了同样的贡献。
- 补充资料
ESI公司。
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ESI-Mov1。
GUID:C0ED962B-C38B-4B84-8CFB-D8115F0BC8A9
ESI-第2版。
GUID:8DCBB719-50A0-440C-B0B4-7969DCEE70B9
摘要
手术后肿瘤复发是一个常见且尚未解决的医学问题，具有重要意义，因为手术是全世界最广泛使用的实体肿瘤治疗方法。肿瘤复发的一个促成因素是术后手术部位或附近残留肿瘤的存在。
目标
本研究的主要目的是开发和评估一种基于近红外、手持式激发源和光谱仪以及宽场视频成像系统的图像引导手术系统。
方法
该系统用于检测近红外对比剂的荧光，特别是吲哚菁绿。对成像系统的光学性能和检测异位小鼠肿瘤模型肿瘤以及犬自发肿瘤中吲哚青绿的能力进行了评估。
结果
在这两种情况下，静脉输注吲哚青绿可提供肿瘤对比度。在小鼠模型和犬手术标本中，与周围正常组织相比，吲哚青绿优先积聚在肿瘤组织中。由此产生的对比度足以区分肿瘤和正常组织；在犬外科标本中，对比度足以识别标本边缘表面的肿瘤。
结论
这些结果通过将局部激发和光谱与宽场成像相结合，证明了图像引导手术中的独特概念。
重要性
在临床环境下，在患有自发性肿瘤的犬只中容易检测ICG的能力证明了进一步临床转化的潜力；检测边缘标本表面肿瘤的良好结果强调了其临床实用性。
索引术语：图像引导手术、ICG、吲哚青绿、光学成像、光学光谱学、外科肿瘤学、肿瘤
一、引言
肿瘤的完全手术切除是肿瘤患者预后良好的最关键预测因素之一[1]. 为了完成完整的肿瘤切除，外科医生必须在手术前和手术中准确确定肿瘤边界[2]. 目前，外科医生主要依靠术前成像和术中独立技术（例如，肿瘤与非肿瘤组织的触觉和视觉区分）来确定肿瘤边界。仅使用术前成像的一个局限性是术中组织形态会发生显著变化。例如，在脑肿瘤手术中，由于肿瘤的肿块效应，切除一部分头盖骨后，肿瘤的形状和位置会发生实质性变化[三]. 在这种情况下，术前成像提供的指导有限。对肿瘤触觉和视觉质量的依赖也是有限的，因为肿瘤组织的小病灶经常未被发现，使残留肿瘤留在手术床上（所谓的“脏边”）[4]. 局部肿瘤复发是复发性疾病和肿瘤相关死亡的主要原因之一[5——8]. 或者，正常组织的触觉和视觉特性可以模拟肿瘤组织的触觉和视觉特性，导致不必要的正常组织切除。改进对手术腔中肿瘤边缘的识别，使这些病变可以在手术时切除，这可能会通过降低复发率来改善患者的预后。
术中肿瘤与非肿瘤组织鉴别的改进是许多研究者感兴趣的一个活跃领域。术中超声成像[9]或磁共振成像（MRI）[10]已用于术中指导。超声成像有许多优点：成本相对较低，设备紧凑，成像设备便携，视频成像，不需要外源性对比剂，并且能够在手术腔内放置成像探针。此外，肿瘤形状的变形几乎没有影响，因为超声探头很容易重定向。最终限制术中超声检查应用的一个显著缺点是肿瘤和正常组织之间的对比度低。另一方面，术中MRI使用放置在手术台附近的扫描仪，患者间歇地被移动到MR扫描仪中。这种技术可以识别肿瘤形态和位置的变化。不幸的是，这种扫描仪的使用很麻烦，因为患者需要连接各种监测和生命支持设备，这些设备必须与患者一起移动。此外，由于手术过程必须中断以进行成像，手术时间和患者全身麻醉的时间都会延长，这会增加患者的风险和额外的经济成本[11]. 术中磁共振设备也有大量的资本成本，例如设备的购买和维护成本，以及维持安全成像环境的专用房间设计和建筑材料成本。
术中指导在不延长手术时间的情况下更好地确定肿瘤部位是一项尚未满足的临床需求。理想的术中指导系统将：（1）以高灵敏度找到肿瘤边界，（2）对手术时间和手术技术的影响最小，（3）以直观的方式呈现结果，以及（4）避免使用电离辐射或专用成像环境（如MR成像）。术中成像系统设计中的其他考虑因素最好包括紧凑、低成本、耐用的便携式系统。无论是术中超声检查还是术中MRI都不能完全满足这些设计要求。
基于光学方法的设备可以满足上述所有设计要求。近红外（NIR）光范围在700至1000 nm之间，对该应用最为有用：NIR光在生物组织中的散射比可见光小，生物背景自荧光最小[12]. 硅CCD和CMOS传感器具有适当的近红外检测灵敏度。同样，针对近红外范围进行优化的光纤组件和光学元件也很容易以低成本获得。结合可定位于肿瘤的NIR荧光成像剂，可以满足这些术中成像系统的设计要求。在这里，我们报告了一种术中成像系统的设计和初步临床前测试，该系统使用手持式探头对NIR荧光对比剂进行同步激发和光谱检测，并结合宽视场摄像机系统进行直观可视化。基于检测对比度增强荧光发射的光学成像系统已经开发出来，包括点成像和宽场成像系统[13——18]; 我们通过结合这两种系统的各个方面来优化术中肿瘤检测，对当前技术水平进行了改进。
二、。方法
A.集成光学成像系统
1） 手持式光谱仪探头
我们在本研究中使用的带有远程手持式探针的近红外光谱仪已经过描述和表征[13]. 简而言之，同轴光纤耦合拉曼光谱仪远程头（RamanProbe，InPhotonics，Norwood，MA）与台式光谱仪（Advantage 785，DeltaNu，Laramie，WY）耦合。远程探针的激发光纤直接耦合到光谱仪的激光二极管模块（785 nm，100 mW）。远程探针的收集光纤（直径200μm）放置在光谱仪的入口处。光谱仪配有控制激发和数据采集的软件。
2） 宽视野摄像机
宽视场相机的设计目标如下：从目标到镜头的工作距离为45厘米，物体高度为5厘米，成像平面上的1/2英寸对角线相机传感器，以及用于滤波的准直光路。总体系统设计将NIR光敏感度放在最高优先级，以检测医学相关浓度和视频速率（30帧/秒）采集速度下的NIR荧光对比剂。
我们使用的相机（Guppy F-038B系列，Allied Vision Technologies，Exton，PA）使用1/2英寸非制冷和交错硅CCD传感器，在近红外范围内量子效率为47%（制造商报告）。摄像头通过Firewire 400接口连接到计算机，该接口提供摄像头电源和控制。传感器分辨率为768×492，像素大小为8.4μm×9.8μm。用于每个通道的传感器是相同的；然而，解剖相机包括一个拜耳马赛克滤光片以提供彩色成像，NIR和激光通道相机删除了一个NIR滤光片（导致更高的NIR光灵敏度）。
整个光学系统的设计是一个中继透镜系统，作为普通物镜和相机传感器之间的连接。我们在物镜和相机传感器之间设计了一条准直光路，用于放置平板分色滤光片。系统的每个通道（例如解剖、激光、探针）都成像出不同的、波长越来越长的光范围。因此，每个通道的净轨道长度并不相同。理想的光学设计首先是在光学布局包（OSLO第6版，辛克莱光学公司，纽约州匹兹福德）的帮助下构建的。然后使用光学布局包替换、评估和优化接近理想设计组件的现成商用部件。设计过程反复进行，直到达到最终设计，我们按照从对象到图像平面遇到的元素的顺序进行报告。
C安装透镜，设计用于400–1000 nm之间的宽带成像，35 mm焦距和（f）/1.9最大光圈（Xenoplan（f）1.9/35mm，Schneider Optics，Hauppauge，NY），用作普通物镜。这个商业目标在系统设计期间被建模为一个完美的透镜，因为没有透镜处方。用于延长物镜焦距的场透镜由焦距为60 mm的凸透镜、焦距为100 mm的正弯月面透镜和焦距为−50 mm的双凹面透镜组成；然后用焦距为45mm的消色差倍增器对该场透镜组进行准直。在双凹面透镜和消色差倍增器之间放置一个可调节的虹膜，通过抑制远超出近轴区域的光线来提高图像质量。场透镜组和准直透镜涂有氟化镁（MgF2)抗反射层优化为700-1000nm。普通物镜、物镜和准直镜安装在一个透镜管中，并按顺序用旋入式扣环固定。使用动镜支架将两个二向色镜依次安装在准直光路中。第一个反射镜是一个短程二向色反射镜，中心波长为800 nm，设计用于将检测到的对比剂的光引导到探针通道相机，并允许激光激发光或可见光通过。第二个短程双向色反射镜接在第一个反射镜后，中心波长700 nm；第二个二向色反射镜将剩余的准直光分向激光通道相机或解剖（即可见光）通道相机。在二向色滤光片系统之外，准直光通过一系列特定于通道的滤光片，然后用焦距为45 mm的消色差倍增管聚焦到相机传感器上。
对于探针通道，然后通过以785 nm为中心的rugate陷波器过滤准直光，以抑制瑞利散射激光，使用至少6的光密度抑制。使用中心波长为820 nm、带宽为25 nm的带通滤波器来抑制除对比剂以外的所有光线，并对Rayleigh散射激光进行补充阻挡。对于激光通道，反射光通过光学密度为2且涂有MgF的吸收中性密度滤光片进行过滤2抗反射层优化为700-1000nm。最后一个组件是允许可见光的解剖参考通道，除了二向色反射镜系统提供的滤光外，不需要额外的滤光。
所有组件，即相机、调焦透镜和补充滤光片，都安装在透镜管中，每个透镜管都使用透镜管滑环和标准光机硬件固定在实验板上。滑环安装使得每个通道的聚焦更加简单。该系统通过在物镜管和分色镜之间加入一个银镜而变得紧凑。所有透镜和光机部件的来源均为Thorlabs（新泽西州纽瓦克），但分色镜底座除外，分色镜支架从New Focus（加利福尼亚州纽波特市圣克拉拉）获得，分色镜架从CVI-Melles Griot（纽约州罗切斯特）获得。两个消费级“白色”40W LED灯用于照亮手术场。
3） 广域成像软件
广域成像软件是为微软编写的。NET平台，使用C#编程语言和Visual Studio Express开发环境（2008版，Microsoft，Redmond，WA）。摄像机供应商（ActiveFirePackage，Allied Vision Technology）提供的应用程序编程接口（API）用于摄像机控制和数据采集。该程序使用事件驱动架构，通过该架构，每个摄像头在分离的执行线程中获取帧，并在获取每个帧后应用图像过滤器。造影剂通道滤波器将图像阈值设置在用户指定的水平，以创建造影剂信号的二进制掩码。激光跟踪通道滤波器将图像阈值设置在用户指定的水平，以创建激光位置的二进制掩模。解剖图像通道滤波器结合对比剂和激光跟踪通道滤波器的结果，生成呈现给用户的复合视图。该复合视图以青色显示对比剂信号的位置（与手术腔的颜色正交），并以红色圆圈轮廓显示激光光斑的大致位置和大小。该软件能够记录静止帧图像或实时视频（使用MPEG-4压缩），以便记录文档以及有关实验的元数据(例如。，使用的小鼠肿瘤模型、造影剂剂量和类型）。列出了成像系统的参数和规格.
表一
| 参数 | 规范 |
|---|
| 宽场检测 | 成像通道数量 | 三 |
| 成像波长 | 400–700、700–800、800–900纳米 |
| 摄像头分辨率 | 768–492 |
| 相机最大帧速率 | 60场/秒（隔行） |
| 摄像头传感器尺寸 | ½英寸 |
| 摄像头单元传感器尺寸 | 8.4微米×9.8微米 |
| 摄像机近红外QE | 700纳米：80%，800纳米：47%，900纳米：23% |
| 系统分辨率限制 | 4 lp/mm（水平），2.8 lp/mm |
| 预期工作距离 | 60厘米 |
| 视野（工作距离 | 11厘米×7厘米 |
| 像素空间分辨率（工作距离） | 145微米 |
| 系统孔径 | （f）/4 |
| ICG检测限 | 150–500 pM |
|
| 光谱仪系统 | 激励源波长 | 785纳米 |
| 激励源最大辐照度 | 1.3千瓦/厘米2 |
| 激励源最小斑点尺寸 | 100微米 |
| 光谱仪分辨率 | 8厘米−1（0.6纳米） |
| 光谱仪范围 | 200–2000厘米−1 |
| ICG检测限 | 50微微 |
| 动态范围 | 40–50倍 |
B.小鼠体内肿瘤模型成像
全部体内小鼠研究是根据埃默里大学动物护理和使用委员会批准的方案进行的。小鼠为年龄匹配的裸体裸鼠（印第安纳波利斯哈兰实验室）。用4T1小鼠乳腺癌细胞系（ATCC，Manassas，VA）建立肿瘤模型；细胞按照ATCC建议进行维护。注射到小鼠受试者体内之前(N=6)，收集4T1肿瘤细胞并稀释至最终浓度2×10之前，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗（2x）7细胞/mL。将细胞注射到侧面，使用约2×106每只动物的细胞数，并允许皮下生长28天。在成像程序前18–24小时的某个时间点，将NIR荧光团吲哚青绿（ICG，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）以357μg/kg（约10 nmol/只小鼠）的浓度在10秒内注入4T1肿瘤小鼠的尾静脉。在成像之前，立即用一氧化碳对动物实施安乐死2窒息后颈部脱位。然后用光谱笔定期对动物进行扫描，光谱笔与组织保持恒定距离，距离为1cm，方法是将探针夹在固定支架上，并调整探针的位置，直到达到卡尺测量的1cm距离。使用梯形法收集并整合NIR荧光光谱。同时，使用宽场系统记录对比剂、激光跟踪和解剖通道的视频。宽视野成像系统的阈值是从给药ICG的小鼠中选择的。在24小时对小鼠实施安乐死，并将正常肌肉，例如对侧侧翼或肢体肌肉置于图像引导手术系统下。将宽视野的近红外通道调整到在激光激发下正常肌肉中无法观察到近红外信号的点，然后将阈值设置为该单位的4倍。从小鼠研究中获得的阈值设置用于下文所述的犬类研究。正常肌肉的近红外信号的变异系数相对较小（26.8%，见补充图1). 然后使用标准技术进行手术切除，仅用肉眼和触诊去除肿瘤块。切除的组织，包括肿瘤、肿瘤邻近组织和其他感兴趣的区域，固定在PBS中新鲜的3.7%甲醛中，并提交给Winship癌症研究所病理核心实验室，用H&E染色或免疫组织化学方法进行石蜡包埋和处理。
C.犬自发性肿瘤成像
佐治亚大学兽医学院的临床研究委员会批准了一项方案，将患有临床诊断肿瘤的宠物狗纳入其中。一名兽医肿瘤学家招募了这些狗，并获得了狗主人的知情同意，并为参与试验提供了少量的经济激励。为了参与试验，犬受试者必须接受细胞学或组织学证实的可手术切除的恶性实体瘤。患有严重潜在疾病或已知对造影剂过敏的犬只被排除在研究范围之外。犬类患者在手术前18-24小时接受标准护理治疗，并加用静脉ICG输注，随后监测输注后过敏反应。
D.伴发犬肿瘤的体外ICG蓄积及其病理相关性
之后整体切除肿瘤后，参与手术的外科医生（KKC）使用放置在无菌套筒中的分光镜笔测量手术腔。手术后，在主治病理学家（EWH）在场的情况下，用光谱系统探测从患者身上切下的组织标本，包括肿瘤床的活组织切片，探针和组织之间保持1厘米的距离，如小鼠研究所述。光谱读数的位置记录在组织样本的照片上，以便稍后与组织学制剂相关联，或者在可用时，由集成成像系统记录。病理学家对光谱读数的结果一无所知。
三、 结果
A.术中成像平台的概念概述
术中成像平台在概念上介绍于由两台能够检测近红外荧光对比剂的仪器组成。第一种仪器是一个点激励源，外科医生通过交互方式将激励光照射到任何感兴趣的区域。该光源可以是宽带光源，例如氙气灯或LED灯提供的光源，也可以是单色光源，例如激光器。在LED或激光器的情况下，光源可以是独立的手持装置（如激光指针）或远程光纤耦合到手持装置。当光纤耦合时，设备可以包含光谱仪，以便提供被询问点的详细光谱信息，如下所述。第二种仪器是位于手术场的宽场成像系统。宽场成像仪具有通过公共透镜连接的多区域成像传感器。每个相机都会拍摄由光学元件系统提供的不同光谱窗口。在我们描述的系统中，我们包括一个用于手术腔彩色成像的摄像机（即解剖视图）、一个用于跟踪点激励源的摄像机和一个用于描绘对比剂荧光的摄像机。
具有定向点激发和光谱的宽场成像操作方案。宽视野成像头（中-右）位于手术区域上方。在这种情况下，手持式探头（S）提供定向点激励。宽视野成像系统使用3个摄像头对解剖视图（A）、解剖视图内的激光位置（L）以及解剖视图内发出的任何近红外（NIR）光（N）进行成像。该区域由一个普通物镜（O）成像，收集的光线由镜子（M）折叠，并由二向色镜（D）过滤。未描述宽场成像头内的复杂光学元件（例如准直透镜、带通滤波器等）。摄像机记录的三个视频通道（右上角）和手持式探头收集的光谱信息（中心下角）由计算机系统进行处理，以合成一个复合显示器（左下角），用激光位置和任何检测到的NIR信号显示解剖地标。
B.成像原型的当前实现
成像平台技术的当前实现如图所示点光谱和激励源由一根商用拉曼光谱仪光纤与商用同轴远程探头耦合组成，在别处有详细介绍[13]. 光谱单元的ICG检测下限约为50 pM[13]. 宽视野成像系统使用具有高NIR灵敏度的CCD摄像机来描绘解剖视图、激发源位置，并检测对比剂发出的NIR光。宽场成像系统目前安装在灵活的铰接支架上。摄像头通过FireWire连接到一台运行内部开发的软件的计算机上，用于图像处理和向系统操作员显示。类似地，光谱仪连接到同一台计算机，使用商业或内部软件进行处理和显示，以获取光谱仪。显示软件将造影剂在设定阈值以上的所有区域覆盖在解剖图像上，即点激发的质心上，并将该位置显示为解剖图像上的空圆圈，并描绘从手持探针记录的感兴趣点的光谱读数。使用ISO 12233测试目标对准相机系统通道。
当前设备实施的照片。（A）所示为宽场成像头。物镜和准直光学元件（橙色盒子）安装在一个透镜管中，该透镜管与其余部件成90º角安装：一个45º保护的单反镜将光线折叠到系统的其余部分。二向色（品红盒）用于将收集的光按顺序分为NIR（蓝盒）、激光（红盒）和解剖（绿盒）通道。每个通道都有附加的滤光片和聚焦光学元件，安装在透镜管中，然后直接连接到相机。如（B）所示，手持探头以典型的使用模式沿着几种常见手术器械放置。面板（C）显示了手持式和宽场装置之间的空间关系。手术室里，手术组的一名成员拿着笔。
C.小鼠模型手术指导成像系统的工作流程
在典型受试者的癌症手术中，集成成像系统的设计工作流程如所示为了进行初步的概念验证研究，我们将4T1小鼠乳腺癌细胞系注射到裸鼠侧腹，以产生异位肿瘤。如前所述，小鼠在几天内形成一个可见的纤维包膜肿瘤。在本例等典型实验中，18h后通过尾静脉将357μg/kg ICG注入小鼠进行成像。手术开始时，用手持探头扫描肿瘤区域，以确定肿瘤边界。肿瘤的ICG信号是肌肉的6.8倍（p=0.0118），参见补充图1然后用标准手术技术切除肿瘤。
交互式术中指导肿瘤切除的一般工作流程。每个面板左右两侧的图像显示，在肿瘤切除的每个阶段，同一只鼠标在两个位置上使用手持探针。最初，扫描可疑肿瘤区域以找到肿瘤的边界（a）。然后用标准手术技术切除肿瘤。切除后，重新扫描手术床以发现残余ICG信号（b）。手术床（c）中未检测到ICG信号之前，对手术进行修正。最后，对切除的手术标本进行扫描，以确认ICG积聚和组织学分析的病理相关区域（d）。ICG聚集区域为假蓝色，点激励源指向的区域用红色虚线圆圈表示。补充图2显示了这些图像代表区域的光谱信号。
切除后，用手持式探头重新扫描手术床，以评估残余疾病。如果发现残留疾病，成像系统检测到的病变将通过放置针进行视觉标记，然后进行切除。重复该过程，直到不再检测到残留疾病。然后使用该系统在手术中对手术标本进行探测，以确定对术后病理特别感兴趣的区域。成像系统提供的指导是不引人注目的：当外科医生需要定位肿瘤边界和残留疾病时，以及在切除组织或执行其他手术任务时，可以使用该系统。
在一个例子中，4T1肿瘤在小鼠皮肤上异位生长。因此，当皮瓣从手术腔中缩回时，原发肿瘤仍与皮肤植入，如所示。与中显示的主题一致，如图所示，ICG优先积聚到原发肿瘤中根据手术流程，对手术区域的重新检查表明，在远离纤维瘤包膜的区域出现了一个意外的ICG高聚集“热点”。在视觉和触觉检查中，该组织似乎是结缔组织。标本被取出并进行病理学检查：组织学检查证实，根据CK-18染色，这个“热点”实际上是一个带有转移性肿瘤细胞的淋巴结。补充图3结果表明，当手持式笔在这些区域移动时，宽场成像系统可以检测到高对比度增强区域和低对比度增强区。
系统注射ICG优先沉积在肿瘤中，但不沉积在正常组织中。在解剖和成像前24小时，通过尾静脉注射357μg/kg ICG，对裸鼠皮下移植4T1异种乳腺肿瘤进行解剖和成像。（A） 当手持式探头远离肿瘤时，宽场成像系统或光谱仪未检测到ICG发射，并且（A）组织学与骨骼肌一致。（B） 当手持式探头指向肿瘤时，宽场成像系统能够检测ICG发射（青色假彩色），光谱仪能够分辨ICG发射，而（B）增强区域的H&E组织学是肿瘤的特征。（C） 当手持式探头对准异常淋巴结时，宽场成像系统还可以检测ICG发射，这一点已被光谱学证实。（c） 淋巴结组织学CK-18免疫组化显示转移性肿瘤细胞阳性（黄色箭头）。比例尺=200μ。补充图3显示了手持笔系统在肿瘤和淋巴结上下移动时的宽视野通道。
D.自发性犬肿瘤的图像引导
小鼠肿瘤模型有明显的纤维包膜，并且经常有漏出的血管；因此，它们在形态学或生理学上不能完全复制人类肿瘤微环境。为了在更真实的生物学和临床环境下，利用当前的术中成像原型，证明ICG在肿瘤对比增强成像中的实用性，我们通过对伴犬自发发生的实体肿瘤进行成像来测试该系统。犬患者在手术前24小时全身注射220μg/kg ICG。在手术室附近的一个房间里，通过术中成像系统对患者取出的组织进行分析。犬科手术的结果示例如所示肿瘤与肌肉的对比度增强为7.3，这比预期的要大，可能是由于单个肿瘤的大小。此外，在一个看似正常肌肉但经病理证实为炎症相关水肿的区域检测到ICG。在肿瘤组织（通过视觉和触觉检查确定）和与标本相邻的正常组织之间可以观察到ICG积聚的明显边界。
自发性纤维肉瘤犬手术标本的术后分析。一只13岁的混血犬在手术前24小时注射220μg/kg ICG，以截除直径为8.5cm的左后腿。（A）术后解剖腿部，通过视觉和触觉检查分析正常组织和肿瘤组织。ICG在肿瘤（C，青色假彩色区域）积聚和沉积，但不在脂肪结缔组织（E）或正常肌肉（B）中。（F） 富含ICG沉积物（肿瘤）的区域显示出独特的光谱特征，这与正常组织（肌肉、脂肪）的广谱、无特征光谱不同。（D） 在与肿瘤相关的炎症组织中观察到ICG信号轻微增加，与炎症相关水肿中ICG存在的报道一致。补充图4显示了手持式笔系统在野外移动时的宽场通道。
四、 讨论
外科手术仍然是一种广泛使用且有效的实体肿瘤治疗方法。尽管在诊断成像方面取得了许多进步，但很少有技术创新是针对手术中指导肿瘤切除。CT、MRI和PET/SPECT等诊断成像技术提供术前关于实体瘤肿块的位置和分布的信息，但一旦手术开始，手术领域的变化（如器官位置的变化和部分切除组织后肿瘤形态的变化）限制了术前成像在指导手术过程中的作用。特别是，术前成像无法告知手术边缘的状态（即肿瘤块是否已完全切除）。将MRI发展为术中模式的尝试受到了许多使用限制的阻碍：铁工具的限制、移动患者以允许成像、笨重的MR成像扫描仪以及术中MR成像设备的高昂费用。病理学技术，如触摸屏和冰冻切片组织学，在处理量上受到很大限制，只能在切除后检查手术标本，而不能检查手术床[19,20]. 冷冻切片过程大约需要20分钟，从而导致手术完成延迟和术中时间延长。此外，获得最终组织学诊断的延迟时间要长得多，即在手术完成后48小时左右。提供明确的术中诊断的能力不仅会减少决策时间。最重要的是，它将提供信息，使外科医生能够在手术室中整合结果，从而决定是否切除其他组织。
我们开发了一种光学术中成像系统，该系统依靠全身注射的造影剂在手术期间提供术中指导。光学对比剂成像没有电离辐射问题（与CT/PET/SPECT一样），对手术室使用的工具没有限制（与MRI一样），仪器可以以比CT、MRI或PET/SPECT更低的成本制造紧凑、便携和耐用。最近，光学术中成像系统已经开发出来，它使用区域激发和宽场成像[15], [21], [22]. 相比之下，我们在宽场成像中使用点激发。该方案允许实时获取光谱，并提供直观的广域成像显示，以提供手术指导。荧光对比剂的光谱功能有助于区分对比剂的荧光发射与内源性荧光团或外部杂散光。未来，术中光谱可以与基于表面增强拉曼散射（SERS）的对比剂一起使用，以提供更高的灵敏度和多路成像[13], [23].
由于缺乏合适的商业仪器，我们开发了一个原型来执行我们的研究，目的是临床翻译仪器和使用的协议。整个系统由三部分组成：外源性造影剂、点激发源和宽场成像系统。术中成像平台要求在成像之前向患者注入造影剂。该对比剂可以是有机荧光团（例如，吲哚菁绿）、荧光纳米粒子（例如，半导体量子点）或Raman活性剂（例如，表面增强拉曼散射（SERS）金纳米粒子）。在初步研究中，我们选择吲哚青绿（ICG）作为对比剂。ICG非常适合这些临床前研究，原因如下：它是FDA批准用于血池监测的，具有良好的安全性和明确的反适应症[24]它在“近红外窗口”中有吸收和发射，其中内源生色团吸收低，自荧光低。最近的出版物介绍了ICG用于术中成像仪器的前哨淋巴结（SLN）定位[25], [26]然而，很少有报道使用ICG作为术中确定肿瘤边界的对比剂[14], [27——29]. 众所周知，ICG与血池密切相关，肿瘤的血管系统也有“渗漏”现象[30——32]可以合理地预期ICG会在肿瘤内积聚，并可用于描绘肿瘤边界。
在小鼠肿瘤模型中的实验表明，相对于周围组织，ICG在肿瘤中的沉积量较高，这可以通过图像引导手术系统描述为和在异位小鼠肿瘤模型中，ICG显示出足够的肿瘤对比度，以便在外系统和一例中识别，从而能够识别淋巴结转移性疾病，如果没有这种术中成像系统，这些转移性疾病是不会被注意到的。虽然小动物模型表明ICG作为肿瘤对比剂的概念有其优点，但在对ICG在肿瘤中的蓄积进行全面相关研究以确定ICG是否真的可以用作肿瘤方面存在许多困难边界造影剂。困难主要在于规模，但使用肿瘤模型测试依赖增强通透性和滞留（EPR）效应进行“靶向”的显像剂时，也存在其他问题因为众所周知，小鼠肿瘤模型的血管漏出并不代表自然发生的人类肿瘤。为了克服这些困难，我们开始了对自发性肿瘤伴犬的临床试验。众所周知，犬类肿瘤在结构上与人类肿瘤相似，犬类与人类肿瘤类型相同（尽管发生率不同）[33]. 使用犬类患者的另一个优点是，ICG有在犬类中使用的历史，并且已知其安全性和在人类中的行为类似[34], [35]. 令人惊讶的是，我们发现犬静脉输注ICG在自发性肿瘤中的积累与在小鼠肿瘤模型中的积累相同。一个重要的暗示是，这表明ICG也可能为人类肿瘤提供对比。
宽场成像技术和局部光谱技术各自具有各自的优点。局部激发和光谱检测产生波长分辨信息，使人们能够区分内源性荧光团与注入的荧光团。这里使用的手持式光纤耦合激光器和光谱仪可以在0.1s内获得近红外光谱[13]在外科领域感兴趣的领域。通过宽场成像系统的光谱信息需要可调滤波器（效率低且成本高），这不利于视频速率成像。此外，定向激光允许操作员在大立体角上不引人注目地收集光线。因为外科医生可以将激光指向感兴趣的点，所以可以使用许多计算机视频处理方案来帮助成像，例如，通过跟踪手持式探头位置，在广域成像屏幕上描绘肿瘤边界，或缩放手持式探针位置上的广域成像系统显示。该方案的另一个优点是，检查区域外的任何荧光染料都不会有光漂白的风险。最后，局部激励源是一种实用的方法，可以使用相对高功率（但ANSI标准允许）的激光在手术室照明，以获得高激励通量。使用激光激发源是可取的，既可以实现高注量率（高相对强度和可聚焦到小区域的光源），也可以提供可在带陷波滤波器的宽场成像系统荧光通道中被抑制的单色光源。为了同样的目的使用区域照明需要高功率LED或激光二极管，这将给手术场着色并带来电气和光学安全问题。荧光激发的替代光源，如卤素或氙气，是宽带光源，需要进行广泛的光学滤波，以防止在宽场成像中渗入发射通道。如果光学布局和部件选择偏向于近红外灵敏度，则点激发源中固有的相对高的通量允许宽场成像系统具有直接的设计。在本文介绍的仪器中，我们能够使用非制冷CCD传感器和编目光学部件，这在具有固有低通量率的区域照明方案中是不可能的。为此，广域成像对于直观的外科指导至关重要。它为近红外对比增强区域提供实时空间制导。我们目前正在开发第二代系统，该系统具有更小的宽场成像头单元、更少的侵入性安装和改进的监视器位置。
五、结论
ICG在肿瘤成像中的实用性已得到证实，ICG使用的低成本仪器适合于术中使用。我们的技术解决了将术后残留肿瘤的可能性降至最低的问题，而残留肿瘤是肿瘤复发的主要原因。手术过程中更好地描绘肿瘤边界，从而可以切除肿瘤全部预计将大大提高手术切除的治愈率。未来的研究将需要更严格地建立ICG荧光和组织学定义的肿瘤边界之间的相关性，以支持人类临床试验。此外，还需要开展研究，重点开发高性能荧光染料和SERS纳米粒子，这些荧光染料和纳米粒子可以靶向特定的肿瘤标记物。
致谢
这项工作得到了癌症纳米技术卓越中心（CCNE）计划（U54 CA119338）和美国国立卫生研究院（GO）向S.Nie提供的赠款（RC2 CA148265）以及NCI纳米技术联盟向a.Mohs提供的独立之路奖（R00 CA153916）的部分支持。S.Nie是乔治亚癌症联盟（GCC）的杰出学者。
脚注
A.M.Mohs、M.C.Mancini和S.Nie是与本手稿相关的仪器的发明者，这些仪器已获得Spectropath，Inc.的许可，可能需要支付与该技术相关的版税和股份。S.Nie是Spectropath，Inc.的无偿顾问。
参与者信息
Aaron M.Mohs，维克森林——弗吉尼亚生物医学工程与科学技术学院，癌症生物学系，维克森林再生医学研究所，维克林业大学健康科学学院，美国北卡罗来纳州温斯顿塞勒姆。
迈克尔·曼奇尼，埃默里大学和佐治亚理工大学，佐治亚州亚特兰大，美国。他现在就职于美国佐治亚洲亚特兰大Spectropath公司。
James M.Provenzale，美国北卡罗来纳州达勒姆杜克大学医学中心放射科。
科里·F·萨巴，佐治亚大学小动物医学与外科系，美国佐治亚州雅典市。
卡伦·康奈尔，佐治亚大学小动物医学与外科系，美国佐治亚州雅典市。
伊丽莎白·W·豪斯，美国佐治亚州雅典乔治亚大学病理学系。
聂树明，美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学和佐治亚理工学院生物医学工程与化学系。
工具书类
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