磷脂酰丝氨酸脱羧酶1的自催化和功能不需要线粒体特异性因子^*

摘要

介绍

磷脂酰丝氨酸脱羧酶1是一种线粒体驻留蛋白(1,2)脱羧磷脂酰丝氨酸（PS）²线粒体内生成磷脂酰乙醇胺（PE）(2). PE是真核生物中第二丰富的磷脂，是磷脂酰胆碱的前体(三,–6)，主要是膜磷脂。在酵母中，两种酶调节PS产生PE；Psd1p位于线粒体(7,–9)和Psd2p，内体的常驻者(10). 不含酵母PSD1型和PSD2型除非补充乙醇胺，否则无法生长，乙醇胺通过二磷酸胞苷（CDP）-乙醇胺途径促进PE的生产(11,–13). 虽然Psd2p是酵母所特有的，但Psd1p是哺乳动物的一种基本蛋白质，从细菌到酵母再到后生动物都在进化上得到了保护(14). 线粒体PS脱羧途径和内质网（ER）定位的CDP-乙醇胺（Kennedy）途径在细胞中产生大多数PE。这种划分表明，这些细胞器中的PE池在功能上可能是不同的。事实上，破坏两种主要的PE生成途径（CDP-乙醇胺和Psd途径）中的任何一种对小鼠来说都是胚胎致死性的(15,16). 因此，每条途径产生的PE具有哺乳动物发育所需的独立功能。

事实上，其中一条主要PE生成途径定位于线粒体，这表明线粒体内产生的PE对正常的线粒体功能至关重要。它进一步表明，将内质网产生的PE导入线粒体的机制要么缺乏，要么效率低下。事实上，CDP-乙醇胺途径产生的PE与线粒体膜结合不良(11,12,17). 酵母或哺乳动物细胞中缺乏Psd1p会影响线粒体形态，损害细胞生长，并降低呼吸能力(18,–20). 此外，psd1级Δ酵母线粒体基因组丢失频率较高(11,21). PE与呼吸复合物III物理相关(22)和IV(23)；然而，在这两种配合物中，只有配合物IV的活性在psd1级Δ酵母(18). 此外，PE最近与线粒体融合有关(19)和跨外膜的蛋白质输入(24). 尽管Psd1p提供了一个对正常线粒体生理学至关重要的PE特权库，但我们对Psd1p本身的理解却出人意料地有限。

Psd1p是作为酶原合成的，必须导入线粒体内膜，在那里进行处理以达到其功能状态(7,21). 导入线粒体后，Psd1p的线粒体靶向序列（MTS）通过两种基质肽酶（线粒体加工肽酶和Oct1p）的顺序作用被删除(7). Psd1p的自催化处理是其功能的必要步骤(25)可在其整合到线粒体内膜（IM）之前或之后发生(7). 通过丝氨酸解过程，在甘氨酸和丝氨酸残基之间的保守LGST基序内发生自催化(7,25,–29). 丝氨酸解将酶分离为成熟的α和β亚基，这些亚基保持非共价结合，并在NH处生成丙酮酸修复基₂酶活性绝对必需的α亚基末端(25,29,30). β亚单位整合到线粒体的IM中，并将α亚单位锚定在IM的膜间隙（IMS）侧(7,8). 虽然与Psd1p活性无关，但Psd1p的氨基末端是必要的，足以通过Pdr5p信号在酵母中诱导多药耐药性(27). 关于Psd1p活性所需的结构基序，几乎一无所知。

在诺氏疟原虫，pkPsd1自动催化由其基底PS加速(31)增加了Psd1p自催化依赖于底物的可能性。在酵母中酿酒酵母，Psd1p缺少NH₂-末端跨膜结构域在基质中定位错误，但仍会发生自催化作用(7). 有趣的是，尽管这种突变的Psd1p等位基因保留了催化活性在体外(7)，它不起作用体内(7,27,31). 这被视为Psd1p发挥作用的证据体内，必须将其正确集成到IM中，使其活动站点面向IMS(7). 然而，由基质定位错误的Psd1p得出的结果可能只是反映了IM的基质侧不存在PS，这一点尚未得到证实，或者，缺乏膜锚的Psd1p无法将α亚基定位在膜表面以脱羧PS。在同一项研究中，在欧根奈罗导入研究表明，放射性标记的Psd1p很容易导入，并在线粒体中发生自催化作用，但在微粒体中没有(7). 因此，可以得出结论，线粒体特异性因子对于Psd1p的自催化作用以及Psd1p的功能是必要的。然而，当与微粒体孵育时，Psd1p未能进行自催化，这可能只是反映了其无法参与内质网移位机制。

鉴于Psd1p在细胞和线粒体PE代谢中的核心重要性，确定Psd1p自动催化的分子要求至关重要，因为这一过程是Psd1b发挥功能所必需的。在本研究中，我们证明，尽管整个LGST基序广泛保守，但只有丝氨酸残基对Psd1p的自催化、活性和功能是绝对必要的。进一步的酵母Psd1p自催化不需要底物（PS），也不需要线粒体特异性脂类、蛋白质或辅因子。事实上，针对分泌途径的Psd1p具有自我催化能力和完全功能体内因此，为了实现高效的自动催化，酵母Psd1p必须具有与膜包埋的转座子结合的能力。此外，为了在细胞中发挥作用，经过处理的Psd1p必须能够接触到其底物PS。

实验程序

结果

Psd1p保守LGST基序的特征

LGST基序在细菌和人类中广泛保守(25,29) (图1A类). 虽然该基序对Psd1p自催化和/或功能的重要性已在细菌中确立(29),恶性疟原虫(31)，酵母(7)和哺乳动物(28)据我们所知，尚未对LGST基序的每个氨基酸的个别作用进行系统研究。因此，为了进一步了解LGST基序的单个残基的功能，携带单个和组合LGST突变的酵母Psd1p突变体在psd1级Δpsd2型Δ应变。在没有Psd1p和Psd2p的情况下，酵母是乙醇胺营养不良菌(11,12). 因此，突变体Psd1p构建体支持psd1级Δpsd2型无乙醇胺时的Δ应变报告了其功能性。由于我们的Psd1p抗血清只检测β亚单位，因此在每个构建物的COOH末端附加了一个3×FLAG标签，以便在自动催化后检测α亚单位。重要的是，添加了COOH端子3×FLAG标签的野生型（wt）Psd1p功能齐全(图1,B类和C类). 与其他研究一致(27)，LGS替代三种丙氨酸（LGS/AAA）完全阻止了自动催化(图1B类)；此外，这种突变体未能挽救乙醇胺营养不良psd1级Δpsd2型Δ应变(图1C类). 突变亮氨酸（L461A）或苏氨酸（T464I）残基不会导致任何明显的自催化缺陷(图1B类). 只有丝氨酸残基（S463A）的突变，伴随或不伴随相邻苏氨酸（ST/AI）的额外突变，才能完全阻止任何可检测到的自催化。与专性丝氨酸相邻的甘氨酸（G462A）突变显著损害了自催化；然而，仍检测到一些经过处理的Psd1p。与低水平的自催化作用一致，G462A Psd1p突变体支持细胞生长psd1级Δpsd2型Δ无乙醇胺条件下的宿主菌株(图1C类). 相反，S463A、ST/AI和LGS/AAA突变体都未能拯救psd1级Δpsd2型Δ乙醇胺营养缺陷型。在不添加乙醇胺的情况下，L461A和T464I Psd1p突变体完全促进了生长。接下来，测量每个突变体的活性(图1D类). 将含有PC、PE和荧光标记PS（NBD-PS）的单层脂质体与分离自psd1级Δ酵母（−）或psd1级Δ酵母转化如图所示。正如生长研究所预期的那样，保守丝氨酸残基的单一突变（S463A）或组合突变（ST/AI和LGS/AAA）完全消除了PS脱羧酶活性。相反，L461A、G462A和T464I突变体都保留了一些（尽管降低了）PS脱羧酶活性。因此，丝氨酸残基是高度保守的LGST基序中唯一的氨基酸，是Psd1p自动催化和活性所必需的。

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图1。

只有保守的LGST基序的丝氨酸残基对于酵母Psd1p的自催化和功能是必需的。 A、，指示物种Psd的Clustal Omega序列比对。灰色方框突出了保守的LGST基序。星号表示相同的残留物。单点表示保守程度较低的残留物，以及双点表示高度保守的残基。B、 psd1级Δpsd2型Δ酵母（−）和psd1级Δpsd2型用指示的Psd1p结构转化的Δ酵母在合成全葡萄糖中培养过夜(SCD公司)补充2m的介质米乙醇胺。免疫印迹法检测全细胞提取物中Psd1p的α和β亚基；Tom70p用作加载控件。C、 psd1级Δpsd2型Δ酵母（−）和psd1级Δpsd2型用指示的Psd1p构建物转化的Δ酵母被发现在SCD板上±2 m米乙醇胺，在30°C下培养48小时。D、，线粒体是从psd1级Δ酵母（−）和psd1级Δ酵母用在富含乳酸的培养基中生长的指示Psd1p构建体转化。线粒体在指定温度下与NBD-PS孵育40分钟，并通过TLC分离磷脂。Psd活性测定为每毫克线粒体每分钟形成的NBD-PE量（平均值±S.E。，n个= 6). 用TLC分离10 nmol NBD-PS和NBD-PE作为迁移标准。使用Student’st吨测试。这个星号表明与psd1级Δ (−).NS公司，相对于而言不显著psd1级Δ (−).

Psd1p自催化不需要底物

为了测试酵母Psd1p是否需要其底物（PS）进行自动催化，我们采用了遗传方法。简言之，PS是通过磷脂酰丝氨酸合成酶1（Pss1p）在内质网线粒体相关膜亚室合成的(17,48,–52)) (图2A类). 缺乏酵母PSS1，编码Pss1p的基因，对乙醇胺（或胆碱）具有营养缺陷，因为Psd1p和其他PE生物合成途径没有使用PS(53) (图2B类). 然而，在电源开关1Δ酵母，内源性Psd1p的β亚单位与wt酵母中的Psd1p共迁移，表明仍存在自催化作用(图2C类). 因此，酵母中的Psd1p自催化不需要底物PS。然而，可能在酵母中，类似于诺氏疟原虫，PS可增加Psd1p的自催化速率(31).

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图2。

Psd1p的自催化加工不需要其底物或线粒体特异性磷脂。 A、，示意图显示了PS和CL生物合成途径中的亚细胞定位和遗传靶向步骤。CDP-DAG公司，胞苷二磷酸二酰甘油；化学机械抛光，胞苷单磷酸；G3P公司，3-磷酸甘油；PGP公司，磷脂酰甘油磷酸盐。B、，所示酵母菌株在YPD中培养过夜，添加10μCi/ml³²P（P）_我放射标记线粒体磷脂，提取后用TLC分离。巴基斯坦，磷脂酸；圆周率磷脂酰肌醇。C、，在YPD中生长过夜后，通过免疫印迹在来自指示菌株的全细胞提取物中分析Psd1p；Aco1p和Aac2p用作加载控制。这个星号指示与抗体反应的非特异性条带。

Psd1p自催化并不强制要求线粒体特异性脂质

与微粒体一起孵育时，Psd1p不能进行自催化(7)提示这一过程可能需要一些线粒体特异性因子。为了研究Psd1p是否需要独特的线粒体脂质环境，我们再次采用了遗传学方法。心磷脂（CL）及其上游中间体磷脂酰甘油（PG）是独特的线粒体脂质(54). 磷脂酰甘油磷酸合成酶（Pgs1p）在CL生物合成途径的早期阶段发挥作用(55) (图2A类). 在第1页Δ酵母，缺乏PG和CL(图2B类)，Psd1p仍发生自动催化(图2C类). 因此，Psd1p自催化不需要线粒体特有的磷脂。

靶向ER的Psd1p体外自催化

放射性标记的Psd1p在与微粒体孵育时不能进行自催化(7)可能反映了对线粒体特异性蛋白或辅因子的需求，或者，由于Psd1p中缺少信号序列而无法参与内质网移位机制。为了区分这两种可能性，我们生成了一个嵌合体在vitr中o构造(图3A类). 首先，Psd1p的MTS被羧肽酶Y的信号序列取代(35). 安NX（X）S公司N个-在CPY信号序列之后，在Psd1p跨膜结构域上游立即添加糖基化信号。此外，在Psd1p和CPY*mPsd1p的COOH末端添加了六个蛋氨酸残基，使我们能够在自动催化后检测α和β亚基。³⁵S标记的Psd1p或CPY*mPsd1p分别与纯化的线粒体或犬微粒体孵育。如预期(7)，Psd1p导入线粒体并以时间和膜电位依赖的方式进行自催化(图3B类，释放的α亚单位由箭头). 相反，无论是否存在质子动力，CPY*mPsd1p都没有导入线粒体，也没有进行自催化。然而，当CPY*mPsd1p与微粒体孵育时，它现在具有自催化能力，而Psd1p没有进行自催化(图3C类箭头突出显示释放的α亚单位）。此外，还添加了N个-CPY*mPsd1p的糖基化信号进入微粒体腔，这是基于经EndoH治疗后CPY*psd1p流动性增加，从而去除未成熟细胞N个-聚糖(图3D类). 因此，Psd1p可以在非线粒体细胞器中进行自催化，只要它包含合适的信息，允许它参与细胞器的移位机制。

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图3。

靶向ER的Psd1p经历自动催化在体外. A、，的示意图在体外Psd1和CPY*mPsd1构造。百万吨线粒体靶向序列；TM（TM）跨膜结构域；CPY公司，羧肽酶Y的ER靶向信号；NXS公司，已插入N个-糖基化信号。B、 在体外的导入[³⁵S] 在IM上质子动力存在（+ΔΨ）或不存在（-Δψ）的情况下，蛋氨酸标记的Psd1或CPY*mPsd1进入wt线粒体。用胰蛋白酶去除非进口前体。分析了每个前体（−）的5%和每个时间点的100%。P（P），前体；我，进口中间体；米，成熟的β亚基。C、，Psd1或CPY*mPsd1为[³⁵S] 蛋氨酸标记在体外在没有（−）或（+）犬胰腺微粒体的情况下。采集微粒体膜并进行模拟处理(M（M）)或用EndoH治疗（+）。对于CPY*mPsd1，糖基化(+首席人事官)和脱糖基化（−首席人事官)前驱体(P（P）)以及β亚单位。在B类和C类，的箭头指示自催化后α亚基的位置。D、，一张示意图，描绘了嵌入微粒体中的自动催化处理CPY*mPsd1的拓扑结构。附加的未成熟N个-描述了聚糖。

靶向ER的Psd1p在体内发挥作用

缺乏跨膜结构域的Psd1p被错误定位于线粒体基质，并在洗涤剂存在的情况下保留了残余催化活性，但未能挽救PE水平psd1级Δ主机(7). 这可能反映了这样一个事实，即PS通常不存在于IM的基质侧（这一点尚不清楚），或者β亚基需要膜锚来将α亚基固定在膜表面附近，使PS脱羧为PE。因为PS是在内质网中生成的(图2A类)，基板不应限制指向该隔间的Psd1p。因此，在CPY*mPsd1p的COOH末端添加了一个3×FLAG标签来代替六种蛋氨酸(图4A类). 在中表达时psd1级Δpsd2型Δ酵母，CPY*mPsd1p与ER共分馏，而Psd1p在线粒体中富集(图4B类). EndoH治疗后，只有CPY*mPsd1p的迁移率增加(图4C类). 作为N个-糖基化发生在内质网而不是线粒体，这些结果表明CPY*mPsd1p是内质网的靶向体内.

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图4。

将Psd1p重新定向到ER体内. A、，的示意图体内Psd1和CPY*mPsd1构建体。百万吨线粒体靶向序列；TM（TM）跨膜结构域；CPY公司羧肽酶Y的ER靶向信号；NXS公司，插入N-糖基化信号。B、，亚细胞组分由psd1级Δpsd2型Δ酵母（−）和psd1级Δpsd2型用在YPD中生长的Psd1或CPY*mPsd1通过一系列差异离心转化的Δ酵母。用SDS-PAGE对每一组分的30微克进行分离，并对Psd1p的两个亚单位（α和β）和以下细胞器标记进行免疫印迹；Qcr6p（线粒体）、Sec62p（ER）和Hsp70p（胞浆）。C、，全细胞提取物psd1级Δpsd2型用生长在YPD中的Psd1或CPY*mPsd1转化的Δ酵母在37°C下模拟处理（M）或用EndoH处理（+）4h。免疫印迹法检测Psd1p的β和α亚基，Aac2p作为负荷对照。对于CPY*mPsd1，糖基化(+首席人事官)和脱糖基化（−首席人事官)β亚基被指示。

重要的是，ER-directed CPY*mPsd1p是功能性的。线粒体（P13）和ER（P40）来源于psd1级Δ和psd1级Δpsd2型Δ酵母缺乏任何可检测到的Psd活性(图5,A–C). 如预期，wt酵母或psd1级Δpsd2型经Psd1p转化的Δ酵母在P13/线粒体部分具有显著的Psd活性(图5B类)但不是P40/ER分数(图5C类). 相反，psd1级Δpsd2型用CPY*mPsd1p转化的Δ酵母在P40/ER组分中具有显著的PS脱羧酶活性(图5,A类和C类). 根据PS脱羧酶活性的预期，CPY*mPsd1p与wt对应物一样具有自动催化能力(图5D类). 最后，CPY*mPsd1p挽救了psd1级Δpsd2型Δ应变类似于Psd1p(图5E类). 因此，Psd1p无需嵌入面向IMS的线粒体IM中，即可为细胞的其余部分提供PE。

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图5。

指向ER的Psd1p功能正常体内. A、，线粒体（P13P来自图4B类)以及来自wt酵母（wt）的微粒体（P40）组分，psd1级Δ酵母，psd1级Δpsd2型Δ酵母（−），以及psd1级Δpsd2型用生长在YPD中的Psd1或CPY*mPsd1转化的Δ酵母与NBD-PS在指定温度下培养40分钟。提取脂质，用TLC分离，用PharosFX成像仪检测NBD标记的物种。B中，线粒体和C、，测定微粒体Psd活性（平均值±S.E。，n个= 3). 通过单向方差分析确定显著差异(psd1级Δpsd2型Δ与Psd1p或CPY*mPsd1相比psd1级Δpsd2型Δ（−））或学生的t吨测试（30与4°C；重量与psd1相比Δ).D、，用免疫印迹法分析从YPD过夜培养的指示菌株中提取的全细胞提取物中Psd1p的β和α亚基；Pic1p用作加载控件。E、，指示菌株被发现在SCD±2 m上米乙醇胺，并在30°C下生长3天。

讨论

Psd1p在许多物种的PE生成中起着关键作用。Psd1p作为PE的重要来源，在线粒体和细胞水平上都至关重要，为了履行其重要作用，它经历了一个不寻常的自我处理事件，产生脱羧酶反应所需的丙酮酸修复基团(25,29,30). 我们对这种自催化事件的理解尚不完整，目前尚不清楚是否需要Psd1p多肽本身不提供的因子。因此，在本研究中，我们对保守LGST基序的每个氨基酸残基进行了全面分析。S463A、ST/AI和LGS/AAA突变体均未能进行自动催化或挽救psd1级Δpsd2型Δ乙醇胺营养不良，而L461A和T464I突变没有引起任何自催化缺陷，并且能够在不补充乙醇胺的情况下完全促进生长。专性丝氨酸附近的甘氨酸突变显著损害了自催化作用；然而，仍检测到一些加工过的Psd1p，G462A突变体保留了一些催化活性。因此，在保守的LGST基序中的四个残基中，只有丝氨酸是绝对必要的自动催化。这与这两种细菌的研究一致，其中相当于酵母S463A的突变消除了酶活性(29)和真核生物（哺乳动物细胞和酵母），其中S463A突变未被完全处理且缺乏活性(7,28). 有趣的是，尽管G462A Psd1p突变体支持一些生长psd1级Δpsd2型Δ宿主菌株在固体培养基上无乙醇胺的情况下，在液体培养基中，G462A突变体相对于其他非系列LGST突变体在无乙醇胺情况下具有严重的生长缺陷（数据未显示）。结合其部分自催化缺陷，这表明LGST基序的甘氨酸残基可能起着重要的但并非必需的结构作用。也许由于其灵活性，甘氨酸可能允许相邻丝氨酸中的羟基以这样的方式定位，从而加强甘氨酸羰基碳的亲核攻击。这种定位对于高效的自动催化可能是必要的。

最近，使用在体外基于转录/翻译的分析，报告了LGST基序中每个残基的重要性诺氏疟原虫（pk）Psd缺乏NH₂-终端膜锚(56). 与我们的结果类似，可溶性pkPsd的自催化需要丝氨酸残基在体外然而，与我们的结果相反，pkPsd中相邻甘氨酸的突变也完全阻止了其自动催化。这个也一样在体外系统还表明，可溶性pkPsd的自催化作用因其底物PS的存在而增强(31). 相反，酵母Psd1p在完全没有底物的情况下仍会发生自催化(图2B类). 我们推测这些细微的差异是由所使用的实验范式造成的(体外与体内)以及膜包埋结构域的缺失（可溶性pkPsd）或存在（酵母Psd1）。

利用一株不含线粒体特有的两种已知磷脂（PG和CL）的酵母菌株，以及一个与分泌途径相关的嵌合Psd1p构建物，我们证明在酵母中，Psd1p自动催化并不依赖于任何线粒体特异性磷脂、蛋白质或辅因子。事实上，通过简单地将Psd1p的线粒体靶向信号与羧肽酶Y的信号序列交换，CPY*mPsd1p被靶向ER，在那里它被自催化处理、酶活性和完全功能体内.

这些结果使我们能够重新解释以前报告中的一些结论(7). 首先，如报告所述，放射性标记的Psd1p与微粒体孵育时未能进行自催化(7)源于Psd1p缺少传统信号序列这一事实。当提供这种分类信息时，CPY*mPsd1p可以在微粒体而不是线粒体的环境中进行自动催化。因此，有可能在某种程度上促进细胞器的移位机制，也许是通过形成具有自催化能力的第三褶皱。这一点得到了以下观察结果的支持：即使线粒体质子动力耗尽后，Psd1p的输入在外膜转位酶中被阻止，Psd1仍会发生自催化作用(7). 基于PS的自催化促进作用诺氏疟原虫缺乏预测的跨膜结构域的Psd(31)、和在体外LGST基序中甘氨酸对自催化的需求(56)很容易推测，当pkPsd未整合在膜中时，甘氨酸残基的结构柔性促进了这种构象，并通过底物的存在而稳定。

第二，当用psd1级Δ应变，尽管保持了显著的催化活性(7)并不表明Psd1p必须嵌入线粒体IM中，其活性位点朝向IMS才能发挥作用体内相反，基质定位错误的Psd1p保留了在洗涤剂提取物中测得的活性，这仅仅是因为它仍在进行自动催化。是否未能恢复PE水平仍有待解决体内反映了无锚β无法在膜表面附近正确定位α亚单位，或者IM基质侧缺乏PS。然而，显而易见的是，当底物的获取不受限制时，靶向非线粒体细胞器的Psd1p可以进行自我催化，发挥作用，并挽救乙醇胺营养不良psd1级Δpsd2型Δ酵母。

CPY*mPsd1p在非线粒体细胞器中进行自催化的能力意味着，一旦Psd1p嵌入膜或参与转座子，这种自激活过程所需的一切都由Psd1b本身提供。此外，CPY*mPsd1p拯救psd1级Δpsd2型在没有乙醇胺的情况下Δ酵母表明，正如预期的那样，PS是内质网面向细胞体的小叶的正常成分。因此，Psd1p针对不同亚细胞隔室的能力可以拯救乙醇胺营养不良psd1级Δpsd2型Δ酵母可以作为一种通用策略来报告给定膜室中PS的存在。

致谢

参考文献