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大脑血流代谢杂志。2015年2月；35(2): 188–192.
在线发布2014年11月19日。 数字对象标识：10.1038/jcbfm.2014.201
预防性维修识别码：项目经理4426747
PMID：25407269

高血压未能破坏年轻或老年Fisher（F44）Cyp1a1Ren2转基因大鼠的白质完整性

菲利普·霍兰德,1,2,7 Mercede A Pannozzo品牌,1 马克·巴斯丁,2,三 Allison D McNeilly公司,4 凯伦·弗格森,2 莎拉·考基,2,5 Maurits A Jansen公司,6 加文·D·梅里菲尔德,6 伊恩·马歇尔,三 约翰·马林斯,5 乔安娜·M·沃德劳,2,三 Calum Sutherland公司,4和凯伦·霍斯堡1,2,*
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摘要

高血压与白质高密度的风险增加有关；然而，最近的研究结果对这种联系提出了质疑。我们研究了高血压和其他脑血管危险因素是否影响诱导性高血压大鼠白质完整性。无论是单独还是与衰老和高脂肪饮食联合使用，磁共振成像均未观察到白质高信号。喂食高脂肪饮食的老年高血压大鼠胼胝体各向异性分数适度降低，无明显病理特征。在此，我们表明，在该模型中，单纯中度高血压或伴有其他危险因素对白质完整性的影响最小。

关键词：衰老、脑血管病、高血压、MRI和白质

介绍

高血压与白质（WM）高信号（WMH）风险增加有关1并且是脑血管疾病发展中仅次于衰老的第二重要因素，脑血管疾病是导致血管性痴呆的已知因素。临床上，WM病变（WML）在MRI上表现为液体衰减反转恢复或T2-加权磁共振成像（MRI），与有髓纤维正常细胞结构的破坏有关。然而，如扩散张量（DT-）和磁化转移（MT-）MRI所示，在没有改变分数各向异性（FA）的情况下增加组织水的流动性是一种早期成像特征，这两种MRI已被用于探索高血压的WM改变。2,三高血压与WML和正常WM中FA降低、平均扩散率（MD）增加和磁化传递比（MTR）降低相关，2,4通常包括室周WM和胼胝体（CC）。三然而，高血压可能不是WMH的主要沉淀因素，并与其他非血管因素有关，5抗高血压治疗未能阻止WML进展，进一步支持了这一观点。6

动物模型已被用于探索高血压对中枢神经系统的影响（参见Bailey等7 和海恩斯沃思等8)，但就其在中枢神经系统结构完整性中的作用得出了相互矛盾的证据。自发性高血压易发性大鼠卒中（SHRSP）表现出明显的WML，而自发性高血压大鼠尽管血压（BP）相似，但未能再现SHRSP中观察到的损伤，9病变局限于尾状体。这与最近的数据一致，这些数据表明，存活到老年而未发生中风的SHRSP无法显示总WML。10

鉴于两种常用模型之间高血压影响的差异，以及由于饮食、糖尿病和遗传易感性等多种共病风险因素，在探索人类单纯性高血压方面存在困难，1,11我们的目的是利用MRI和免疫组织化学方法探讨诱导性高血压转基因大鼠WM完整性的变化，在该转基因大鼠中，高血压的发病和持续时间是可控的。12我们之前已经证明，MRI对中度脑灌注不足小鼠模型中的微小WM改变敏感，13因此，我们假设持续的高血压会导致中枢神经系统WM的微结构改变，进一步的，老龄化或额外的脑血管危险因素，如高脂肪摄入，会加剧WM的破坏。

材料和方法

动物

以Fisher-F44为背景的Cyp1a1Ren2转基因大鼠表达小鼠Ren-2公司在细胞色素P450启动子（Cyp1a1）的控制下，肝脏中的基因在内部繁殖。幼年大鼠被随机分为两组(补充图1)并以标准饮食喂养（对照组；n个=12; 15±1.2周；14至17周）或含有0.15%吲哚-3-甲醇（I3C；高血压；n个=14; 16±1.1周；范围14至17周），导致肾素-血管紧张素级联反应增加和血压升高。老龄大鼠再次随机分为四组(补充图1)第1组(n个=9; 69±1.9周；范围66至71周）和第2组(n个=9; 69±2.1周；范围66至70.5周），接受标准饮食，和第3组(n个=11; 67±3.6周；范围61至70.5周）和第4组(n个=11; 66±2周；范围62至67）接受含有0.15%I3C的标准饮食。此外，在最后4周内，第2组和第4组分别改用不含I3C（对照组和脂肪组）或0.15%I3C的高脂肪饮食（45%Atwater燃料能量fat；英国埃塞克斯特殊饮食服务公司）。此外，三只年老的动物因健康不佳而被淘汰，分别来自第1、3和4组。所有实验均根据1986年《英国内政部动物（科学程序）法案》进行，符合当地伦理和兽医批准（爱丁堡大学生物医学研究资源）以及ARRIVE指南。

磁共振成像

未定义大鼠并将其置于MRI支架中（德国瓦茨堡Rapid Biomedical有限公司）。控制直肠温度和呼吸以确保正常生理参数。T型2使用安捷伦7T临床前扫描仪（英国雅顿安捷伦科技公司）收集DT-和MT-MRI数据；采用72毫米体积线圈和双通道相控阵鼠脑线圈（Rapid Biomedical）。使用轴向快速自旋回波序列进行扩散张量成像，计算FA和MD，使用两个自旋回波序列执行MT-MRI(补充数据). 测量CC、内囊和伞的平均扩散率、FA和MTR。

免疫组织化学

磁共振成像后，大鼠在异氟醚深度麻醉下用肝素化生理盐水灌注，然后用4%对甲醛灌注，在石蜡包埋前取下大脑并进行后固定。适当的6μm切片与MRI评估的区域相对应（0.86至−0.1 mm和−1.34至−2.18 mm前角），因为这些区域以前在自发性高血压大鼠和SHRSP菌株中表现出脆弱性。预处理后使用标准方法进行免疫染色，以去除石蜡，并在10 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 6）中微波提取淀粉样前体蛋白抗原。选择抗体来可视化WM纤维束的不同细胞成分。使用抗髓鞘碱性蛋白（MBP）（1:5000；英国沃特福德Millipore）评估髓鞘完整性。使用抗淀粉样前体蛋白（1:1000；Millipore）评估轴突损伤。阻断然后生物素化的二级抗体（1:100）和链霉亲和素-过氧化物酶复合物溶液后，在4°C下用一级抗体孵育切片过夜。使用3,3′二氨基苯扎定四氯化氢定位过氧化物酶活性（Vector，Peterborough，UK）。使用图像J（v1.43，NIH，Bethesda，MD，USA）评估侧脑室上方CC中MBP染色的百分比面积。在放大200倍的条件下拍摄双侧图像，并由对干预不知情的观察者手动描绘CC。然后将四个预先定义的感兴趣区域随机放置在图像上，并计算免疫阳性MBP的百分比面积作为髓鞘密度的测量。为了评估轴突的完整性，对所有动物的CC进行了仔细筛选，以确定在肿胀或球状轴突中是否存在强烈的淀粉样前体蛋白免疫反应。

统计分析

血压数据显示为不同组每两周的平均值。统计比较使用t吨-在不同时间点（诱导后第0天、第4-5周以及实验结束时）的测试和显著性值调整为0.01，以纠正多重比较。磁共振成像数据表示为每个受试者双侧感兴趣区域的平均值。使用多元方差分析对各组之间测量的每个区域的MD、FA和MTR值进行统计比较，以校正多重共线性的使用（总体效应；图1和​和2）。2). 只有当检测到适当的显著总体影响以防止I型错误时，才对单个MRI指标进行方差分析，以确定MD、FA和MTR的特定区域变化(P⩽0.05). MBP染色面积百分比通过以下方法进行评估t吨-对年轻队列进行测试，并对老年队列进行方差分析。所有结果均以平均值±标准差表示，并使用SPSS 19.0进行统计分析；SPSS公司，美国芝加哥。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为jcbfm2014201f1.jpg

年轻大鼠的生理和磁共振成像结果。正常大鼠饮食中添加0.15%的I3C会导致Cyp1a1Ren2大鼠血压逐渐升高，这与第4周至第5周的对照组大鼠血压有显著差异，收缩压达到>160 mm Hg，并且在研究期间血压仍显著升高(A类). 对照组和病理学检查高血压大鼠的白质区均未发现明显改变(B类，髓鞘碱性蛋白免疫组织化学）或MRI(C)技术，表明仅高血压对年轻大鼠白质完整性的影响最小。FA，分数各向异性；MD，平均扩散率；核磁共振成像；MTR，磁化传递比。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为jcbfm2014201f2.jpg

老年大鼠的生理和磁共振成像结果。在老年Cyp1a1Ren2大鼠的饮食中添加0.15%的I3C会导致血压逐渐升高，这与第4周至第5周的同窝对照大鼠有显著差异，收缩压达到>160 mm Hg，并且在研究期间保持显著升高(A类). 向对照组或高血压（Hyp）大鼠亚组添加高脂肪对血压没有显著影响。髓鞘碱性蛋白免疫组化评估白质完整性无明显变化(B类); 然而，MRI技术在仅在侧脑室边界比较胼胝体的MD、FA和MTR时发现了显著的总体差异(C). 随访ANOVA显示，仅高脂肪大鼠的对照组和高血压组的FA有显著变化，MD或MTR值无显著变化。其余白质区域没有明显的整体变化（这就排除了MRI指标的随访单变量分析，以避免潜在的I型错误），表明高血压对老年大鼠白质完整性的影响最小。方差分析；FA，分数各向异性；MD，平均扩散率；核磁共振成像；MTR，磁化传递比*单个MRI指标的显著变化(P（P）<0.05).

结果

高血压对幼年大鼠的影响

向年轻的Cyp1a1Ren2转基因大鼠添加0.15%的I3C后，血压逐渐升高，这与第4周至第5周的对照同窝大鼠有显著差异（t(18)=5.80,P（P）<0.01;图1A)当高血压大鼠收缩压大于160毫米汞柱时。16周后，I3C喂养的大鼠收缩压显著高于131±2.2毫米汞柱（t(18)=18.44,P（P）<0.01）。

T台上没有公开的WMH2-加权MRI(补充图2)在幼年大鼠中，总体分析未能检测到所有研究区域的任何显著显微结构变化(图1C). 与MRI上没有WM改变相一致，CC中没有明显的轴突病理改变，髓鞘密度也没有显著变化（t(21)=0.88,P（P）=0.39;图1B).

高血压对老年大鼠的影响

向老年Cyp1a1Ren2转基因大鼠（第3组至第4组）添加0.15%的I3C后，血压逐渐升高，这与第4周至第5周的对照同窝鼠（第1组至第2组）有显著差异（t(18)=3.02,P（P）<0.01;图2A)当高血压大鼠收缩压>160 mm Hg时。14周后，喂食I3C的大鼠的收缩压显著高于146±4.1 mm Hg（t(15)=5.85,P（P）<0.01）。成像前4周，向对照组（第2组）和高血压组（第4组）老龄大鼠的子集添加高脂肪饮食对血压没有显著影响(图2A).

T上没有明显的WML2-老年大鼠的MRI加权成像(补充图2)尽管总体分析发现四组之间存在显著的显微结构改变，但在CC（F(9,98)=2.01;P（P）<0.05;图2C)侧脑室边界处（0.86至-0.1 mm的前角），而不是伞（F(9,98)=0.53;P（P）>0.05）或内囊（F(9,98)=0.66;P（P）>0.05). 对CC的单变量随访比较显示，FA显著降低（F(3,36)=3.00,P（P）<0.05); 然而，MD（F(3,36)=0.90,P（P）>0.05）和MTR（F(3,36)=2.61;P（P）>0.05）不变。FA的这种特定变化主要是因为喂食高脂肪饮食的高血压大鼠（第4组）与喂食正常饮食的对照组（第1组）之间的差异。轴突完整性分析未发现轴突断裂的证据(补充图3)或髓鞘完整性发生显著变化（F(3,33)=1.29,P（P）=0.30;图2B和补充图4). 皮尔逊相关分析第页统计数据表明，CC FA值与终末期收缩压之间没有显著相关性(第页=0.199,n个=40，以及P（P）=0.22），或MBP密度(第页=0.132,n个=37，以及P（P）=0.44），没有脂肪的额外影响。

讨论

白质病变在老年受试者的MRI上常见，其存在与年龄和脑血管风险因素有关，包括高血压。1在此，我们证明高血压单独或与进一步的脑血管危险因素（包括老龄化和高脂肪摄入）结合不会导致总WML，T2加权MRI上WMH的缺乏就是证明。最近包括DT-和MT-MRI的替代方法已经证明了对轻微WM破坏的敏感性。13一致的是，我们检测到侧脑室背侧CC的FA显著轻微减少；然而，这只在喂食高脂肪饮食的老年高血压大鼠中表现得很明显，这暗示了一种综合效应。尽管血压显著升高，但这些指标与观察到的FA变化之间没有显著相关性。我们的数据与最近发现SHRSP大鼠WM没有明显中断的其他人一致，这些大鼠无中风存活了10个月10或需要增加慢性低灌注以诱发WML。14综上所述，数据表明，在这里测试的持续时间内，仅高血压不足以驱动WM改变，我们进一步表明，在老龄大鼠（~21个月）中，老龄化和迟发性高血压的组合不会影响此模型中WM的完整性。由于髓鞘损伤可能是继发于血管危险因素的WM损伤的一个相对较晚的特征（病理学研究表明），这可能是因为我们没有将大鼠暴露在高血压或高脂肪环境中足够长的时间。

虽然使用相对新颖的模型有利于可控性高血压诱导，但该模型尚未广泛用于高血压后中枢神经系统病理评估的研究是本研究的局限性。为此，我们之前已经研究了不同高血压持续时间的年轻Cyp1a1Ren2转基因大鼠的脑血管改变15并确定丘脑脑血管病变。因此，高血压动物没有明显的WM改变可能表明丘脑区域存在区域性脆弱性。另外，如人类研究所示，髓磷脂损伤可能发生得较晚，尸检结果集中于髓磷脂的丢失，但更早的变化可以检测到体内突出水分变化作为早期特征。脑血管危险因素（老龄化和高脂肪饮食）的结合以及该转基因品系中恶性高血压的潜在发展限制了我们的研究持续4个月。我们不能排除高血压持续超过4个月或起病时血压快速升高可能会影响白质完整性；然而，这种大鼠模型中血压逐渐升高的现象符合人类的情况。

总之，年轻和老年高血压大鼠均未表现出明显的WM紊乱，这进一步提出了关于高血压对WMH发展影响的问题。白质结构完整性仅在高血压、老龄化和高脂肪饮食的联合存在下轻微改变，表明多种危险因素的累积效应。

笔记

作者声明没有利益冲突。

脚注

补充信息随附《脑血流与代谢杂志》网站上的论文(网址：http://www.nature.com/jcbfm)

作者感谢英国老年医学会、英国老年痴呆症研究所和老年痴呆症协会的资助。PRH、MB、KJF、SC、JMW和KH是爱丁堡大学认知老龄化和认知流行病学中心（CCACE）的成员，该中心是跨理事会终身健康与幸福倡议（G0700704/84698）的一部分。感谢BBSRC、EPSRC、ESRC和MRC的资助。部分工作由CCACE成像飞行员奖和ARUK East of Scotland Dementia Network颁发的奖项资助，对此我们深表感谢。使用爱丁堡大学医学和兽医学院爱丁堡临床前成像设备进行磁共振成像。

补充材料

补充信息

工具书类

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文章来自脑血流与代谢杂志由以下人员提供SAGE出版物