美国财务会计准则委员会J。2015年3月；29(3): 1043–1055.
共生菌群具有肝保护作用并可预防小鼠肝纤维化
,*,1 ,*†,1 ,‡,2 ,* ,‡ ,* ,* ,§ ,§ ,§ ,¶ ,*和*†,三
*美国加利福尼亚州拉荷亚圣地亚哥加利福尼亚大学医学系；†美国加利福尼亚州圣地亚哥VA圣地亚哥医疗系统医学部；‡诺华研究基金会基因组研究所，美国加利福尼亚州圣地亚哥；§系统与转化科学，RTI国际，美国北卡罗来纳州三角研究园；和¶美国南卡罗来纳州查尔斯顿南卡罗莱纳医科大学口腔健康科学系
1这些作者为这项工作做出了同等贡献。
2当前附属公司：BioNano Genomics，美国加利福尼亚州圣地亚哥。
2014年6月24日收到；2014年11月3日接受。
- 补充资料
补充数据
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摘要
细菌及其产物跨肠屏障转移在肝病患者中很常见，有证据表明实验性肝纤维化依赖于细菌移位。本研究的目的是研究常规和无菌（GF）C57BL/6小鼠的肝纤维化。在饮用水中注射硫代乙酰胺（TAA）21周或反复腹腔注射四氯化碳（CCl）可导致慢性肝损伤4). 与常规小鼠相比，GF小鼠的肝纤维化程度增加。肝细胞表现出更多的毒素诱导的氧化应激和细胞死亡。这伴随着肝星状细胞的激活增加，但肝脏炎症介质没有显著差异。类似地，使用Myd88/Trif缺陷小鼠的基因模型（缺乏下游先天免疫信号）比野生型小鼠具有更严重的纤维化。分离的Myd88/Trif缺陷肝细胞在培养中更容易受到毒素诱导的细胞死亡的影响。总之，共生菌群可预防小鼠慢性肝损伤后的纤维化。这是首次描述共生菌群在维持肝内环境稳定和预防肝纤维化方面的有益作用的研究-Mazagova，M.，Wang，L.，Anfora，A.T.，Wissmueller，M.、Lesley，S.A.、Miyamoto，Y.、Eckmann，L.、Dhungana，S.、Pathmasiri，W.、Sumner，S.，Westwater，C.、Brenner，D.A.、Schnabl，B.共栖微生物群具有肝保护作用，可预防小鼠肝纤维化。
关键词：细菌移位、先天免疫系统、微生物组
任何原因的急性肝损伤都会导致肝细胞凋亡和细胞死亡。死亡的肝细胞被免疫系统清除，并被再生的肝实质细胞取代。持续的和慢性的肝损伤耗尽了肝脏的增殖能力，死亡的肝细胞不再被新的肝细胞取代。肝脏中的成纤维细胞（主要是肝星状细胞）被激活为肌成纤维细胞，产生细胞外基质蛋白，并在肝实质的细胞外间隙沉积纤维瘢痕。纤维化过程可能导致终末期肝病或肝硬化，最终破坏肝脏的代谢功能。除了清除病原体外，目前还没有针对慢性肝病患者的特殊治疗方法，通常需要进行肝移植(1).
慢性肝病患者的肠道通透性增加，这有助于细菌和细菌产物穿过肠道屏障进入肠外器官，包括全身循环(2–5). 转位细菌或其产物通过与肝脏固有免疫系统受体结合而成为实验性肝纤维化的重要介质(6). 一些研究已经确定LPS信号在实验性肝纤维化中的作用。LPS-TLR4信号通路中断的突变小鼠对肝损伤和纤维化具有抵抗力(7–9). TLR4在患者中也被证明是肝纤维化的重要调节剂(10). TLR9是一种模式识别受体，由细菌DNA中特异存在的CpG基序激活，TLR9缺陷小鼠对实验性肝纤维化具有抵抗力(11). 我们最近证实肠道炎症和细菌移位会导致肝纤维化通过小鼠小肠固有层单核细胞TLR2信号和肠上皮细胞肿瘤坏死因子受体I信号(12). 然而，TLR3配体聚（I:C）抑制肝纤维化通过激活NK细胞杀伤肝星状细胞和产生干扰素-β和干扰素-γ(13–15). 此外，TLR7介导的I型干扰素信号传导可预防实验性肝纤维化(16). 总之，细菌产物对肝脏固有免疫系统的激活和肝纤维化的进展具有不同的影响。
在本研究中，我们检测了在服用TAA或反复注射CCl诱导的中毒性肝损伤后肝纤维化发展中缺乏共生微生物群的情况4.
材料和方法
肝纤维化动物模型
TAA诱导的GF小鼠肝纤维化
GF雄性C57BL/6小鼠是在北卡罗来纳大学国家灵长类啮齿动物资源中心（北卡罗来那州教堂山，美国）繁殖并获得的，并保存在诺华研究基金会基因组研究所（加利福尼亚州圣地亚哥，美国）的GF隔离器中(17). 常规雄性C57BL/6小鼠购自Charles River（马萨诸塞州威明顿市，美国），并保存在加州大学圣地亚哥分校的一个特定的无致病性动物饲养室中。TAA（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）以0.3 g/L的浓度溶解在饮用水中，通过过滤进行消毒，共给药21周。每1-2周更换一次饮用水。GF和常规小鼠使用相同数量的TAA。在TAA治疗的21周内，3只普通小鼠和1只GF小鼠死亡。本研究显示的结果基于以下动物数量：未经处理的（载具）常规(n个=5）和GF小鼠(n个=3），TAA处理的常规(n个=16）和GF(n个=12）只小鼠。
CCl公司4-GF小鼠诱导的肝纤维化
对于CCl4实验中，GF雄性C57BL/6小鼠是在密歇根大学（密歇根州安娜堡）的GF和Gnotobioc小鼠设施中繁殖并获得的，并保存在南卡罗来纳州医科大学Gnobioc动物中心的GF隔离器中（美国南卡罗莱纳州查尔斯顿）(18). 用CCl治疗C57BL/6小鼠4(4µl/g体重；1:8玉米油稀释），或玉米油作为对照（4µl/g体重），每周腹腔注射3次。重复注射共12次。由于一些GF小鼠的垂死外观，小鼠在第二次注射CCl后又恢复了2天4，第三次注射以1:32的稀释度进行。常规C57BL/6小鼠购自Charles River，保存在加州大学圣地亚哥分校的一个特定的无致病性动物饲养场中，并使用相同剂量的CCl进行平行治疗4最后一次注射后第3天收获小鼠。CCl治疗期间41只普通小鼠和2只GF小鼠死亡。本研究显示的结果基于以下动物数量：注油常规(n个=4）和GF小鼠(n个=3），CCl4-注入式常规(n个=11）和GF(n个=7）小鼠。
CCl公司4-Myd88和Trif缺乏小鼠诱导的肝纤维化
Myd88和Trif（Myd88）缺陷小鼠−/−/特里夫LPS2/LPS2)小鼠已被描述为C57BL/6基因背景(19). 作为对照，雄性C57BL/6小鼠在圣地亚哥加利福尼亚大学的一个特定的无致病性动物饲养场中繁殖，并与Myd88在同一动物架上并行处理−/−/Trif公司LPS2/LPS2老鼠。用CCl治疗小鼠4(2µl/g体重；第一次和第二次注射分别用玉米油1:100和1:50稀释，然后用1:4稀释）或玉米油作为对照（2µl/g体重），每三天腹腔注射一次。重复注射共12次。最后一次注射后2天收获小鼠。CCl治疗期间4、2只野生型小鼠和1只Myd88−/−/特里夫LPS2/LPS2老鼠死了。本研究显示的结果基于以下动物数量：注入油的野生型(n个=5）和Myd88−/−/特里夫LPS2/LPS2老鼠(n个=4），CCl4-注入野生型(n个=8–13）和Myd88−/−/特里夫LPS2/LPS2老鼠(n个=16）只小鼠。
为了诱导肠道失调，雄性C57BL/6小鼠每天灌胃一次万古霉素100毫克/千克体重、新霉素200毫克/千克重量、甲硝唑200毫克/公斤体重和氨苄西林200毫克/kg体重的混合物，持续1周。消灭共生菌群后，用10只小鼠灌胃10的结肠活动单位大肠杆菌（或PBS作为对照）并腹腔注射CCl4(2µl/g体重；1:4玉米油稀释；n个=每组10）或玉米油作为对照（2µl/g体重；n个=每组5次）每周3次，共12次。最后一次注射后2天收获小鼠。我们使用大肠杆菌从一名腹膜炎患者（ATCC#23535）分离出血清型O74:K:H39。大肠杆菌每次灌胃时在营养琼脂/肉汤中新鲜生长。
在每个单独的实验中，老鼠的年龄都相匹配，并且可以随意获得水和食物。为了分离库普弗细胞，GF和传统C57BL/6小鼠在圣地亚哥加利福尼亚大学繁殖和饲养。所有动物都按照各个机构的指导方针和美国国立卫生研究院（马里兰州贝塞斯达）的规定接受人道护理。
肝细胞、库普弗细胞和肝星状细胞的分离和培养
利用磁细胞分选法从正常肝脏中分离肝细胞组分在其他地方也有描述(20,21). 肝星状细胞在塑料上培养，并在培养第5天收获。在用LPS（100 ng/ml）或poly（I:C）（10μ将从GF和常规C57BL/6小鼠分离的Kupffer细胞刺激6小时，以诱导细胞死亡，将肝细胞培养在含有0%胎牛血清的培养基199（无酚红）中，并加入CCl4（0.5–1 mM）持续24 h。通过使用Infinity试剂盒（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科学公司）测量上清液中的丙氨酸氨基转移酶（ALT），或使用细胞毒性检测试剂盒（印第安纳波利斯州罗氏公司）进行细胞死亡测定，评估细胞死亡。
染色程序和ALT测量
将福尔马林固定的肝脏样本包埋在石蜡中，并使用所述的标准染色方案，用抗-4-羟基壬醛（4-HNE）（美国德克萨斯州圣安东尼奥市阿尔法诊断公司）抗体进行染色(22). 为了检测肝脏中的死亡细胞，使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）对切片进行染色分析。对每个样本的40个高倍场进行阳性染色细胞计数。切片也用天狼星红染色，以评估所述的纤维化(21). 使用Infinity（赛默飞世尔科技公司）的试剂盒测量ALT水平。
蛋白质印迹分析
按说明进行蛋白质印迹分析(23)使用初级抗体α-微管蛋白，生长抑制和DNA-损伤诱导（Gadd）-153（CHOP；所有圣克鲁斯生物技术公司，圣克鲁斯，加利福尼亚州，美国），平滑肌α-肌动蛋白（SMA；Dako，Carpintia，CA，USA）和细胞色素P450 Cyp2e1（Millipore，Billerica，MA，USA。使用NIH ImageJ分析对条带进行定量。
实时PCR分析
如别处所述，进行RNA提取和实时定量PCR(24)使用从NIH qPrimerDepot获得的特定底漆组。所有数据均归一化为18S基因表达。数值是相对于载体对照小鼠给出的。如前所述，从小鼠粪便中提取DNA(22,25). 为了量化粪便细菌，使用了以下已发表的细菌引物序列：16S rRNA基因(26),梭状芽孢杆菌簇I(27),厚壁菌属(28)、和拟杆菌纲(29).
吲哚-3-丙酸的液相色谱-质谱分析
在甲醇中制备吲哚-3-丙酸（IPA）储备溶液（MP生化公司，美国加利福尼亚州圣安娜市）。使用10 ng/ml IPA与80%甲醇的溶液来调节质谱仪。多反应监测（MRM）过渡米/z（z）187.9/59.1用于监测IPA信号。所有质谱/质谱数据都是在配备Waters'Acquity Ultra Performance Liquid色谱（Waters Corporation，Milford，MA，USA）的API 4000 Q-trap质谱（AB SCIEX，马萨诸塞州弗明翰，美国）上采集的，该色谱在电喷雾电离（ESI）负离子模式下运行。ESI条件如下：毛细管电压−4.5 kV；去簇电位−25 V；入口电位−10 V；碰撞能量−24 V；碰撞电池出口电位−7 V；帷幕气20；离子源气体160；离子源气体260；温度450°C。氮气用作雾化器和辅助气体。质谱仪在MRM模式下运行。在安捷伦Eclipse XDB-C18（4.6×50 mm，5µm） 柱在30°C下操作，使用95:5水：乙腈和0.15%乙酸作为流动相A，95:5乙腈：水和0.15%醋酸作为流动相B（MPB）。使用梯度流从柱上洗脱IPA，梯度流从100%MPA开始，在2分钟内以0.6 ml/min的流速在100%MPB结束。在水中建立溶液标准曲线，线性范围为10–1000 ng/ml。a 25µ使用225稀释1等分的重组血浆提取物（之前用于核磁共振分析，未提供）µl HPLC级水。在样品制备过程中，血浆中的IPA提取物被净稀释30倍。样品分析采用前后标准曲线。分析员1.42通过使用MRM过渡峰下的面积来处理浓度响应数据(米/z（z）187.9/59.1).
统计分析
曼·惠特尼U型统计分析采用秩和检验、双尾Student检验或ANOVA与Newman-Keuls多重比较检验（Prism，GraphPad Software，Incorporated，La Jolla，CA，USA）。数据以平均值±表示扫描电镜.P（P）选择≤0.05作为显著性水平。
结果
在GF小鼠中TAA诱导的肝纤维化增加
为了确定共生菌群在肝纤维化发病机制中的作用，常规和GF小鼠被给予TAA通过饮用水21周。肝纤维化最初是通过评估肝胶原来测量的α1（I）mRNA水平。胶原蛋白的表达水平α与TAA治疗的常规小鼠相比，GF小鼠肝脏中的1（I）基因显著升高(P（P）= 0.01;). 为了评估慢性肝损伤导致的纤维化，用天狼星红对胶原蛋白沉积进行染色。在接受正常饮用水的GF或常规小鼠中未观察到胶原蛋白沉积。GF小鼠在饮用TAA 21周后出现桥接性纤维化，常规小鼠在相同时间内暴露于TAA后出现门脉纤维化，一些间隔延伸至肝小叶(). 天狼星红阳性区的量化证实，与TAA暴露后的常规小鼠相比，GF小鼠的胶原蛋白沉积显著增加(P（P）= 0.007;). 活化的肝星状细胞是肝纤维化的主要基质生成细胞类型。SMA是活化的肝星状细胞/肌成纤维细胞的标记物，在TAA 21周后，GF小鼠的肝脏中比传统小鼠的肝脏表达更高(). 尽管1只经载体处理的GF小鼠在Western blot上表现出较强的SMA反应性，但该小鼠并未表现出肝星状细胞活化的其他特征，包括肝胶原mRNA表达或蛋白沉积增加。此外，其他4只未经治疗的GF小鼠在基线时未表现出星状细胞活化增加的特征（未显示）。因为Cyp2e1需要将TAA生物活性化为其亲电衍生物(30)，测定Cyp2e1在肝脏的表达。与TAA给药后的常规小鼠相比，GF小鼠中的Cyp2e1蛋白表达类似(). 为了研究肠道微生物群的缺失是否会导致肝脏炎症的差异，从而解释GF小鼠肝纤维化的增加，我们检测了肝脏中细胞因子和趋化因子的表达。接受TAA的GF小鼠显示出类似的炎性细胞因子IL-1的肝脏基因表达水平β、IL-6和TNF-α(P（P）IL-1=0.01β传统的与。GF遵循TAA；)、趋化因子Ccl2（也称为单核细胞趋化蛋白-1）、Ccl3（巨噬细胞炎症蛋白-1α)和Ccl5（RANTES）与TAA治疗的传统小鼠的比较(). 综上所述，在TAA治疗21周后，GF小鼠表现出更大的肝纤维化。
慢性肝损伤导致GF小鼠肝纤维化加重。GF和常规小鼠（Conv）在饮用水中用TAA处理21周。作为对照，GF和常规小鼠单独作为车辆（veh）饮用水。A类)肝胶原蛋白α1（I）（Col1a1）mRNA。B类,C类)胶原沉积通过天狼星红染色进行评估，并通过图像分析进行定量。图中显示了用天狼星红染色的代表性截面。天,E类)肝脏SMA和Cyp2e1蛋白的蛋白质印迹。F类,G公司)肝细胞因子和趋化因子的基因表达*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
TAA治疗后GF小鼠肝脏活性氧累积增加和肝细胞死亡增加
接下来，我们通过4-HNE染色来评估活性氧物种（ROS），4-HNE-是一种高活性醛，由多不饱和脂肪酸暴露于过氧化物和ROS中产生，并用作氧化应激的标记物(31). TAA诱导的活性氧在GF小鼠的肝脏中高于常规小鼠。未经治疗的小鼠肝脏中未显示任何4-HNE染色(). Gadd-153属于转录调节蛋白的CCAAT/增强子结合蛋白家族，在转录后水平上由ROS诱导(32). TAA处理的GF小鼠的肝脏中Gadd153蛋白水平显著高于常规小鼠的肝脏(P（P）= 0.03;). Gadd153激活活性氧下游的细胞死亡反应(33,34). 与Gadd153水平增加一致，经TAA治疗后，GF小鼠的肝细胞死亡率显著高于常规小鼠(P（P）= 0.02;). 然而，与未经TAA处理的小鼠相比，经TAA治疗的常规小鼠和GF小鼠的血浆ALT水平没有显著增加。持续给予TAA通过饮用水导致肝细胞持续轻度死亡。总之，在TAA治疗后，GF小鼠的肝脏ROS积累增强，这与肝细胞的更多细胞死亡有关。
TAA给药后GF小鼠肝脏反应性氧化应激增加和肝细胞死亡。A类)对常规（Conv）和GF、载体和TAA处理小鼠的肝脏切片进行4-HNE免疫组化染色。显示了具有代表性的部分。B类)用Gadd153（CHOP）和微管蛋白抗体进行免疫印迹分析肝裂解物。使用ImageJ量化条带的强度，并将Gadd153蛋白水平归一化为微管蛋白水平作为负荷控制。C类)使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche）对肝脏切片进行染色以检测死亡肝细胞。显示了具有代表性的部分。天)每个载玻片上有40个高倍视野（HPF）用于阳性染色细胞的计数*P（P）< 0.05.
GF小鼠对CCl更敏感4-诱导性肝损伤与肝纤维化
为了排除肠道微生物群在吸收前代谢口服TAA的可能性，在GF小鼠中研究了第二种肝纤维化模型。CCl反复腹腔注射4是绕过胃肠道的肝纤维化实验动物模型。我们还切换了GF小鼠的来源和GF设施的位置，以控制小鼠的遗传和环境混杂变量。与TAA诱导的肝纤维化类似，肝胶原α1（I）mRNA表达()、胶原蛋白沉积(P（P）= 0.05;)与CCl后的常规小鼠相比，GF中肝星状细胞的激活增加4注射(). CCl患者肝Cyp2e1蛋白表达相似4-治疗过的GF和常规小鼠(). 受CCl影响的常规小鼠4注射显示肝脏炎性细胞因子IL-1水平相似β、IL-6和TNF-α与GF小鼠相比(). 尽管趋化因子Ccl2没有差异，但与常规小鼠相比，GF小鼠肝脏中Ccl3和Ccl5的基因表达更高(P（P）=0.04（对于Ccl5常规）与。CCl后的GF小鼠4;). 持续给予TAA通过低剂量饮用水导致肝细胞轻度死亡；CCl公司4每三天注射一次，每次注射后都会引起周期性肝毒性。CCl公司4-血浆ALT水平表明，GF小鼠的诱导性肝损伤显著高于常规小鼠(P（P）= 0.002;). 这些结果表明，GF小鼠表现出加重的毒素诱导的肝损伤和纤维化。
CCl对GF小鼠肝纤维化的增强作用4注射。用CCl治疗GF和常规（Conv）小鼠4总共12次。作为对照，GF和常规小鼠接受油（载体）注射。A类)肝胶原蛋白α1（I）（Col1a1）mRNA。B类,C类)胶原沉积通过天狼星红染色进行评估，并通过图像分析进行定量。图中显示了用天狼星红染色的代表性截面。天,E类)肝SMA和Cyp2e1蛋白的蛋白质印迹。F类,G公司)细胞因子和趋化因子的肝脏基因表达。(H（H）)血浆ALT水平*P（P）≤ 0.05; **P（P）< 0.01.
缺乏Myd88和Trif的小鼠表现出肝损伤和纤维化加重
TLR识别出病原体相关分子模式（PAMPs）后，TLR的胞内结构域招募2个特异性适配器分子Myd88和/或Trif来协调下游信号(35,36). Myd88和TRIF（Myd88−/−/特里夫LPS2/LPS2) (19)对TLR配体无反应。为了确定先天性免疫识别受体信号的缺乏是否影响肝纤维化，通过反复腹腔注射CCl诱导中毒性肝损伤4Myd88中发现肝胶原mRNA表达增加−/−/特里夫LPS2/LPS2小鼠与野生型小鼠的比较(). Myd88患者的肝胶原沉积和肝星状细胞活化显著增高−/−/特里夫LPS2/LPS2CCl后的小鼠4注射(P（P）= 0.04;). 野生型和Myd88中肝脏Cyp2e1蛋白的表达同样减少−/−/特里夫LPS2/LPS2CCl后的小鼠4处理(). 炎症分子的肝脏表达与CCl后GF小鼠的结果相似4管理。肝肿瘤坏死因子-αMyd88中，Ccl2、Ccl3和Ccl5基因表达较高−/−/特里夫LPS2/LPS2CCl后小鼠与野生型小鼠的比较4，但这并没有达到统计显著性。IL-1无差异β和IL-6(). CCl公司4-Myd88患者的诱导性肝损伤明显较高−/−/特里夫LPS2/LPS2通过血浆ALT水平测定小鼠与野生型小鼠的比较(P（P）= 0.03;). 我们证实了先前的报告，即在稳态条件下，Myd88或TLR缺陷对肠道微生物群组成的影响最小(37). 两个优势细菌门的丰度拟杆菌纲和厚壁菌属野生型和Myd88相似−/−/特里夫LPS2/LPS2老鼠(补充图1). 这些和之前的结果表明，先天免疫信号的缺乏会加剧小鼠中毒性肝损伤和纤维化。
Myd88/Trif缺陷小鼠更容易受到毒素诱导的肝纤维化的影响。C57BL/6和Myd88−/−/特里夫LPS2/LPS2给小鼠注射油作为对照或CCl4总共12次。A类)肝胶原蛋白α1（I）（Col1a1）mRNA。B类,C类)胶原沉积通过天狼星红染色进行评估，并通过图像分析进行定量。图中显示了用天狼星红染色的代表性截面。天,E类)肝脏SMA和Cyp2e1蛋白的蛋白质印迹。F类,G公司)细胞因子和趋化因子的肝脏基因表达。H（H）)血浆ALT水平。野生型野生型*P（P）< 0.05.
Myd88/Trif缺陷的肝细胞更容易受到毒素诱导的细胞死亡的影响
肝纤维化是一个受多种因素调节的过程，包括肝细胞损伤、炎症和细胞外基质沉积。为了解释微生物群在肝纤维化中的有益作用，我们利用缺乏先天免疫信号的基因小鼠模型，从Myd88中分离出实质细胞和非实质细胞−/−/特里夫LPS2/LPS2老鼠。从Myd88分离的肝星状细胞−/−/特里夫LPS2/LPS2小鼠纤维生成基因SMA、胶原的表达没有显著差异α1（I）和TGF-β1、促炎基因Ccl2或增殖标记物增殖细胞核抗原在培养激活期间与野生型小鼠分离的细胞进行比较().
在培养的Myd88/Trif缺陷肝细胞中，毒素诱导的细胞死亡更高。从C57BL/6和Myd88中分离出非实质性和实质性肝细胞−/−/特里夫LPS2/LPS2老鼠。A类)原代肝星状细胞（HSC）培养5天。纤维化基因（SMA、Col1a1和TGF）的表达-β1） 用定量PCR分析增殖标记物（PCNA）和Ccl2。显示了4种不同肝星状细胞分离的平均值。B类)在用LPS（100 ng/ml）或poly（I:C）（10μg/ml）持续3 h。LPS和poly（I:C）诱导IL-1的表达β和TNF-α用定量PCR分析。显示了3种不同Kupffer细胞隔离的平均值。C类)用LPS（100 ng/ml）或poly（I:C）（10μg/ml）持续6小时。IL-1β和TNF-α用定量PCR分析。显示了3种不同Kupffer细胞隔离的平均值。天)用CCl处理小鼠原代肝细胞4（0.5 mM）持续24小时CCl4-通过测量上清液中的ALT和测定细胞死亡率来评估诱导的细胞死亡。显示了6种不同肝细胞分离的平均值*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01; ***P（P）< 0.001.
枯否细胞是肝脏中的常驻巨噬细胞，也是肝脏疾病中炎症介质的主要来源。实验性枯否细胞耗竭抑制肝纤维化(38). 库普弗细胞在肝纤维化中被移位的细菌产物激活，但在重复激发时对细菌产物如脂多糖表现出耐受性(39). 研究Kupffer细胞生物学的变化是否有助于观察到的GF和Myd88的纤维化表型−/−/特里夫LPS2/LPS2小鼠，从野生型和Myd88中分离出初级Kupffer细胞−/−/特里夫LPS2/LPS2小鼠和LPS或poly（I:C）刺激。LPS与TLR4结合并传播其细胞内信号通过Myd88和Trif；poly（I:C）是TLR3激动剂，激活TLR3受体下游的Trif。野生型Kupffer细胞显示LPS和poly（I:C）诱导的IL-1表达显著升高β和TNF-α与Myd88/Trif缺陷型Kupffer细胞相比(P（P）=0.03，对于LPS诱导的IL-1β和TNF-α野生型mRNA与。Myd88/Trif缺陷型Kupffer细胞，P（P）聚（I:C）诱导的IL-1为0.047β和TNF-α野生型mRNA与。Myd88/Trif缺陷型Kupffer细胞；). 还从常规和GF C57BL/6小鼠中分离Kupffer细胞，并在培养中用LPS或poly（I:C）处理。基线，LPS或聚（I:C）诱导的TNF-α和IL-1βGF分离的Kupffer细胞和常规小鼠之间的表达无显著差异(). 因此，在缺乏微生物群的情况下，Kupffer细胞不太可能介导炎症反应和纤维化反应。
然后，我们将重点放在肝细胞上，因为肝细胞可能更容易受到GF小鼠体内毒素的影响。上清液中ALT升高和细胞死亡（释放LDH）增加证明了CCl4导致野生型C57BL/6小鼠原代培养肝细胞死亡(P（P）ALT=0.02；P（P）LDH=0.04）或从Myd88/Trif缺陷小鼠中分离(P（P）ALT=0.002；P（P）=0.0001（对于LDH）。Myd88分离的肝细胞−/−/Trif公司LPS2/LPS2小鼠对CCl的反应显示出明显高于野生型肝细胞的细胞毒性4(P（P）ALT=0.02；P（P）LDH=0.002；). 总之，肝细胞对毒素诱导的细胞死亡的易感性增加为GF小鼠肝损伤和纤维化的加剧提供了可能的解释。
Myd88中肝细胞Cyp26a1表达较少−/−/特里夫LPS2/LPS2和GF小鼠
为了在微生物群的缺乏和毒素诱导的肝损伤增加之间提供可能的解释，我们使用来自已接受或未接受肝毒素治疗的常规和GF小鼠的混合肝mRNA进行微阵列。一些P450基因在GF小鼠肝脏中的表达较低。其中，我们证实Cyp26a1的表达减少。与TAA治疗后的常规小鼠相比，GF小鼠肝脏中Cyp26a1 mRNA的表达较低(P（P）= 0.009;)或CCl4注射(P（P）= 0.007;). TAA后在常规小鼠中诱导Cyp26a1(P（P）= 0.03;)或CCl4处理(P（P）= 0.02;). 同样，Myd88/Trif缺陷的肝细胞在基线检查和CCl后Cyp26a1基因表达降低4文化处理(P（P）= 0.043;). 由于P450酶表达的改变可能导致毒性产物的积累，这可能有助于增加GF小鼠的毒性诱导肝毒性。
GF和Myd88/Trif缺陷肝细胞中Cyp26a1基因的表达。A类)GF和常规小鼠（Conv）在饮用水中用TAA处理21周。作为对照，GF和常规小鼠单独饮用饮用水作为载体。肝脏Cyp26a1 mRNA表达。B类)用CCl治疗GF和常规（Conv）小鼠4总共12次。作为对照，GF和常规小鼠接受油（载体）注射。肝脏Cyp26a1 mRNA表达。C类)从C57BL/6和Myd88中分离出肝细胞−/−/特里夫LPS2/LPS2小鼠和CCl治疗4（1mM）持续24小时。Cyp26A1mRNA表达。显示了6种不同肝细胞分离的平均值。天)使用液相色谱-质谱/质谱法定量GF和常规小鼠给药载体或TAA血浆中的IPA水平。E类)粪便中的梭状芽孢杆菌簇I通过定量PCR测定*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
为了进一步阐明慢性肝损伤导致GF小鼠肝纤维化增强的机制，我们对未经治疗和TAA治疗的常规和GF小鼠的血浆进行了IPA的液相色谱-质谱/质谱分析。我们发现，与传统小鼠相比，GF小鼠的血浆中不含IPA()，确认了我们之前公布的结果(17). IPA是膳食色氨酸的脱氨产物，是一种强大的抗氧化剂(40). IPA的产生完全取决于肠道微生物群的存在产孢梭菌(17). 我们确认了C.产孢存在于我们传统小鼠的粪便中(). IPA保护原代神经元和肝细胞免受氧化应激诱导的细胞死亡(40,41). 正如我们观察到的那样，与TAA治疗后的常规小鼠相比，GF中的肝脏氧化应激增加()GF小鼠中IPA的缺失可能使肝细胞更容易发生细胞死亡。
由大肠杆菌补充
糖尿病与从肝脏脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎的进展有关(42)以及淤胆性肝纤维化的进展(43). 为了研究肠道微生物组成的变化是否与毒物诱导的肝损伤和纤维化的进展有关，通过反复口服非致病性药物诱导机体出现生物失调大肠杆菌12次注射CCl后4，小鼠补充大肠杆菌与对照灌胃小鼠相比，显示出类似程度的肝纤维化(补充图2A类–C类). 与对照组小鼠相比，益生菌不良小鼠体内ALT水平测定的肝损伤略高(P（P）= 0.045;补充图2天)表明革兰氏阴性菌引起的失调大肠杆菌仅为CCl的次要贡献者4-诱导肝纤维化。
讨论
有一个不断发展的概念，即肠道通透性增加和细菌移位导致的肠道衍生细菌产物在慢性肝病的纤维化进展中起着关键作用(44). 首先，肝病患者全身细菌产物水平增加，如LPS和细菌DNA，肝病的严重程度与细菌衍生LPS的血浆水平相关(4). 第二，使用不可吸收抗生素或稳定肠屏障降低肠道细菌负荷可改善实验性肝纤维化(8,12,45–48). 第三，先天免疫信号中只有一个基因缺失的小鼠无法感知细菌产物或传播信号，因此对肝纤维化具有抵抗力(7–9,11). 总之，这些临床和实验研究强调了共生菌群作为慢性肝病促炎信号的重要性。另一方面，TLR3和TLR7抑制实验性肝纤维化(13,16). 因此，我们想用GF小鼠研究易位细菌及其产物在肝纤维化中的作用。我们进行了一项新的观察，即在慢性肝损伤中，微生物群是肝脏稳态所必需的。GF和Myd88/Trif缺陷小鼠在服用肝毒素诱导的慢性肝损伤后均增加了肝纤维化。
我们的发现符合宿主和共生微生物群之间相互共生的更广泛图景。由于缺乏细菌，GF小鼠表现出严重的表型，这种表型包括代谢反应的调节、维生素缺乏和免疫系统的失调(17,49). 肠道微生物群可以被认为是人体的一个重要组成部分，它为宿主提供了额外的好处，例如从其他不可消化的碳水化合物中提取热量、胆汁酸代谢和其他代谢功能(50). 对于其他疾病，如结肠炎和炎症性肠病，也建立了类似的概念。激活免疫系统对抗共生微生物群有助于疾病的慢性化(51). 使用抗生素减少肠道微生物群可保护传统小鼠免受右旋糖酐硫酸钠诱导的结肠炎的影响(52,53)，但GF小鼠加重了实验性结肠炎(54,55). 微生物群和微生物产物对于分泌IL-10的调节性T细胞的发育是必需的，因此对于疾病中结肠的稳态也是必需的(55–57).
问题是细菌菌群如何保护肝脏和防止肝纤维化。使用缺乏下游TLR信号的Myd88/Trif缺陷小鼠，发现肝细胞更容易受到毒素诱导的细胞死亡的影响。这与CCl后升高的ALT水平一致4注射GF或Myd88/Trif缺陷小鼠体内我们已经证实了之前两项研究的结果，这两项研究证明了微生物群对P450酶肝脏表达的需求(58,59). 我们还观察到，慢性肝损伤后GF小鼠的肝脏中P450酶（如Cyp26a1）下调。正如我们在GF或Myd88/Trif缺陷小鼠的损伤肝脏中观察到的那样，这些I期外源性代谢酶的低表达可能会导致毒性产物的积累、氧化应激和肝毒性的增加。低基线水平的细菌产物可能足以保护肝脏免受毒性刺激。较高系统水平的微生物产物可能不会产生额外的耐药性，而是会激活肝星状细胞和枯否细胞/招募的巨噬细胞，从而增加肝脏损伤。这打破了实质细胞死亡和再生之间的微调平衡，导致肝细胞失去再生能力时结疤组织沉积。肝纤维化是由于肝细胞持续死亡和肝细胞再生能力下降所致(60,61). 如我们的研究所示，肝星状细胞随后激活并在肝脏的细胞外空间沉积基质蛋白。然而，在传统小鼠中，其他机制可能涉及肝脏保护和维持肝脏稳态。当然可以想象，慢性肝损伤后，微生物群的产物直接作用于肝实质细胞。事实上，微生物衍生的IPA可能为肝脏提供氧化应激保护。尽管这些可能性值得未来仔细研究，但我们在这里描述的工作表明，内脏轴心的保护性方面是一个未被认可的方面。这种微生物介导的保护作用导致肝细胞对细胞损伤的抵抗力增强，并增强了自卫能力。
导致肝脏疾病的第二个公认概念是肠道失调。肠道微生物群的破坏可导致多种疾病，包括非酒精性脂肪性肝炎等肝病(42,62). 中毒性肝病发病后的代谢障碍以厚壁菌门（即厚壁菌属成员）的发病率增加为特征乳酸杆菌,多莉娅、和毛螺菌科
不定莎草放线菌门的操作分类单位数量也显著增加，尤其是该属的成员红蝽菌科在CCl中4-治疗组。中毒性肝损伤还导致盲肠微生物多样性减少(25). 在这项研究中，我们证明了重复灌胃大肠杆菌结果肝损伤轻微加重，但肝纤维化不加重。这与最近的一项研究一致，该研究表明，高脂肪饮食诱导的生物失调会加剧胆汁淤积，但不会加剧毒性肝纤维化(43). 营养不良可能导致肠道炎症、肠屏障破坏和细菌移位(6,63,64). 随后，移位的细菌产物导致肝脏炎症和肝损伤(6). 然而，细菌产物的移位取决于肠道渗漏的程度。我们以前曾报道过，与其他类型的肝损伤（如胆汁淤积）相比，中毒性肝病后肠道渗漏较低(25). 因此，与其他类型的慢性肝病相比，肠道生物失调可能对毒性肝纤维化的进展没有那么大的作用。
综上所述，这是首次证明正常微生物群在慢性肝病中的有益作用的研究。识别保护性细菌种类和产品，通过它们减少肝损伤和纤维化，将有助于合理尝试操纵肠道微生物群，使其达到保护状态和健康状态。这将最终改善慢性肝病患者的预后。
致谢
作者感谢Richard Glynne博士、Alan Hofmann博士、Reiner Wiest博士、Balfour Sartor博士、Dimitrios Moskophidis博士和Eric Johnson博士的有益讨论。该研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）拨款K08-DK081830、R01-AA020703（至B.S.）、U01-AA021856（至B.B.S.和D.A.B.）和2P42-ES010337（至D.A.B..）的支持。所述项目得到弗吉尼亚州研究与发展办公室生物医学实验室研发服务（发给B.S.）颁发的编号为1I01BX002213的奖项的支持。作者承认，北卡罗来纳大学教堂山分校的国家灵长类啮齿动物资源中心拨款P40RR018603和P30-DK34987，用于提供GF小鼠。MUSC灵长类动物核心由NIH拨款P30 GM103331支持。IPA分析是在RTI内部研究与发展基金下进行的，部分由NIH东部地区综合代谢组学资源核心（拨款1U24DK097193）进行。没有作者有财务、个人或职业利益冲突需要披露。
词汇表
| 中高音 | 丙氨酸氨基转移酶 |
| CCl公司4 | 四氯化碳 |
| GF公司 | 无菌的 |
| 加德 | 生长抑制和DNA损伤诱导 |
| 4-酮 | 4-羟基壬烯醛 |
| 投资促进机构 | 吲哚-3-丙酸 |
| 第450页 | 细胞色素P450 |
| PAMP公司 | 病原相关分子模式 |
| ROS公司 | 活性氧物种 |
| TAA公司 | 硫代乙酰胺 |
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