二硫键在皮肤角质形成细胞角蛋白中间丝组织和动力学中的作用

二硫键的形成限制了K5/K14纤维在体外的伸长

人类K14蛋白包含五个半胱氨酸残基：C4、C18和C40位于其N末端头部结构域，C367和C389位于其中央杆结构域，所有这些在哺乳动物中都是保守的(图2，A和B). 发现残基C367（而非C389）在相互作用的K5/K14 2B棒状畴晶体中介导反二聚体同型二硫键(Lee等人，2012年). 我们设计了一种不含半胱氨酸的K14变体，命名为K14CF，其中所有五个半胱氨酸残基都被丙氨酸取代，以检查消除所有K14依赖的二硫键对灯丝组装和网络形成的影响。

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图2。

通过体外K14依赖的分子间二硫键的形成限制纤维伸长。（A） 半胱氨酸残基在人K5和K14蛋白中的定位。（B） 几种哺乳动物K14序列的比对：智人(NP_000517号),Bos金牛座(NP_001160047号),家犬(NP_001240670号),小家鼠(NP_058654号)、和褐家鼠(NP_001008751号). 半胱氨酸残基以黄色突出显示。（C） 角蛋白组件的高速沉淀（150000克，30 min），然后对上清液（Sup）和颗粒（Pel）馏分进行还原SDS-PAGE分析。K14WT和K14CF在氧化缓冲条件下与K5WT共组装时，组装效率不同。黑线表示中间车道已拼接。（D） 通过基于密度计的上清液（S）和颗粒（P）组分分析定量灯丝组装效率，如C中所述。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。（E） 阴性染色和透射电子显微镜显示了含有K14WT-和K14CF的细丝在氧化环境中以及在组装后阶段暴露于还原环境时的结构特征。条形，100 nm。（F） 在氧化缓冲条件下组装时灯丝长度的测量。数据来自三个独立的实验。每次实验至少测量100根细丝。误差线代表SD。（G）K5/K14WT和K5/K14 CF在不同缓冲条件下的体外组装数据汇总。“极短IF”小于150 nm，“短IF”为200–500 nm，“中间IF”为500–1000 nm，“长IF”大于1µm。

在体外，K14CF在标准聚合缓冲条件下（包括还原剂；Aebi等人，1983年). 通过使用负染色/电子显微镜或高速沉淀分析比较K5/K14CF和K5/K14 WT组件，可以证实这一点(图2，C–E). 在培养基中进行转染试验的结果Krt14号机组^−/−角质形成细胞（见下一节），这些发现表明，由于生物化学/结构缺陷，在K14的氨基酸位置4、18、40、367和389用丙氨酸替换Cys不会显著损害其组装能力。

在没有还原剂的情况下进行体外组装反应提供了一个抗氧化环境，允许形成分子间和/或分子内二硫键，并产生了不同的结果。在这种条件下，含有K14WT的组装体显示出一系列二硫键物种，如Western blotting所示，这些物种表现出迟缓的流动性，并且涉及K14和K5。相比之下，含有K14CF的组装体仅表现出K5介导的二硫键(图S2)，确定K5中的半胱氨酸也有助于体外形成分子间二硫键。此外，K5/K14WT配对聚合效率显著较低（在高速沉降试验中降低了约35%），并产生短纤维（电子显微照片上测量的长度为～100–150 nm），而K5/K14 CF配对保持了较高的组装效率，并产生更长的纤维（大多>300 nm；图2、D和F). 这些发现与早期的观察结果一致Steinert等人（1976年），并表明分子间二硫键的形成限制了（野生型）K5/K14细丝在体外的伸长。涉及K5的二硫键（具有四个Cys残基；图2 A)可能是氧化缓冲液条件下含有K14CF的细丝长度低于正常值的原因(图2 E). 值得注意的是，当最终组件在组装后阶段直接转移到标准还原缓冲环境时，含有K5/K14WT的灯丝长度正常化(图2、E和G). 这些观察结果意义重大，因为它们表明抗氧化环境可能会调节体内表皮角质形成细胞中K5/K14丝的伸长。

K14结合半胱氨酸和/或二硫键的缺失干扰角质形成细胞中核周集中IF网络的形成和/或维持

在Lee等人（2012），我们提出了一个同源的K14 Cys367介导的反二聚体二硫键有助于角蛋白IFs的核周集中网络的形成。接下来，我们通过对角质形成细胞进行转染分析，检测K14结合的半胱氨酸和/或二硫键的完全丢失是否会干扰角质形成细胞核内角蛋白IFs的细胞内组织Krt14号机组^−/−原代培养的小鼠角质形成细胞不含K14，但含有K5/K17和K5/K15预先存在的IF网络(Chan等人，1994年;劳埃德等人，1995年). GFP-K14WT在Krt14号机组^−/−在接受荧光成像的固定制剂中，角质形成细胞显示出三种角蛋白网络组织模式：“泛细胞质”（即角蛋白丝均匀分布在细胞质中）、“核周浓缩”（大多数丝集中在核周区域）和“外周”IF网络（纤丝集中在细胞外围；图3 A; 看见图S3用于这些类别的定量定义）。GFP-K14WT的主要IF组织方式是核周浓缩，发生在59%的转染细胞中，而全细胞质IF组织模式发生在22%的细胞中(图3 B). 相比之下，含GFP-K14CF的纤丝仅在17%的转染细胞中表现出核周浓度的IF网络Krt14号机组^−/−角质形成细胞，而其中高比例（66%）显示泛胞质网络(图3，A和B). 这些发现表明，K14结合的半胱氨酸和/或二硫键的缺失对10nm细丝的形成没有明显影响，但干扰了原代培养中小鼠皮肤角质形成细胞中核周浓缩IF网络的形成和/或维持。重要的是，在K14CF表达细胞中观察到的核周浓缩网络的不完全丢失可能反映了其他I型角蛋白的贡献，例如K16和K17，因为它们都含有几个半胱氨酸，包括一个对应于K14的C367的半胱氨酸以及K17在Krt14号机组^−/−小鼠角质形成细胞(特洛伊和图尔克森，1999年; 未发布的数据）。K15是在这些条件下表达的另一种I型角蛋白，可能在这种不完全渗透表型中不起作用，因为它在与K14的C367相对应的位置缺少半胱氨酸残基(Lee等人，2012年).

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图3。

核周角蛋白网络的形成和/或维持受到K14结合半胱氨酸和/或二硫键缺失的影响。（A） 免疫荧光成像揭示了原代培养中含有K14的纤维网络的三种不同的组织模式Krt14号机组^−/−转染GFP-K14WT或GFP-K14 CF的小鼠角质形成细胞：“泛细胞质”、“核周浓缩”和“外周”IF网络。棒材，10µm。（B） 如A所示，每种类型中频网络的频率。数据以三个独立实验的平均值±标准差表示。（C） 通过比较表达GFP-K14WT和GFP-K14 CF（绿色通道）的角质形成细胞的实时电影记录的静态图像。H2B-mCherry（红色通道）被联合转染以观察细胞核。所示图像对应于使用激光扫描共焦显微镜（参见视频1和2). N、 核心。棒，10µm。（D） 在第0、3和6小时的z堆叠图像的2.5维视图中，转染角质形成细胞的细胞质（绿色通道）和H2B-mCherry标记的细胞核（红色通道）中含有GFP-K14WT或GFP-K14 CF网络。

我们推测，在固定细胞制备中观察到的三种不同的角蛋白纤维网络结构模式(图3 A)可以代表沿时间连续体的不同阶段，而不是终端或稳定表型。与前者一致，R.E.Leube及其同事已经表明，角蛋白IFs在培养的上皮细胞中经历了一个空间和时间模式的循环：非常短的丝状物首先聚集在细胞外围，然后随着它们向细胞中心的连续流动而伸长，在那里，它们被捆绑在一起，形成一个围绕核的网络（例如。，Windoffer和Leube，2004年,2011;Kölsch等人，2010年). 通过使用激光扫描共焦显微镜对活细胞成像，我们分析了细胞中频动力学Krt14号机组^−/−表达GFP-K14WT或GFP-K14 CF的小鼠角质形成细胞(图3、C和D; 和视频1和2). 在每个时间点，为每个位置总共采集了七个z堆栈（每个堆栈的厚度为0.43-µm，总厚度为3µm）。在小鼠角质形成细胞中，GFP-K14WT的行为与Leube及其同事描述的角蛋白周期一致(Windoffer等人，2011年)：短丝状物似乎在细胞外围形成，然后随着它们的定向运动而伸长，并在核周区域积聚(图3 C和视频1）。尽管其金额与野生型对应物相当(图S4 B)GFP-K14CF似乎只完成了周期的一半：短丝确实在细胞外围形成，并开始向细胞中心推进，但在细胞中点，这一过程被中断，以至于很少有长丝稳定地到达核周区域(图3 C和视频2）。相反，含有GFP-K14CF或“空白空间”的离散“小点”在细胞核附近盛行。我们生成了z堆栈图像的2.5维视图(图3 D)这些结果证实，含有GFP-K14WT的丝状物很容易形成围绕H2B-mCherry标记细胞核的核周富集网络，而含有GFP-K14CF的丝样物则集中在细胞外围和细胞质中部，但在细胞的核周区域明显缺乏。此外，我们观察到表达GFP-K14CF的细胞倾向于表现出细胞核和整个细胞（>60%的细胞；图S5、A、B、D和F; 和视频3)相对于GFP-K14WT表达细胞（<15%的细胞；图S5、C和F）。总之，这些数据表明，K14结合的半胱氨酸和/或二硫键在角蛋白循环中起着重要作用，通过它们调节角蛋白IFs核周网络的进展和/或稳定性。此外，除了影响所报告的核尺寸外(Lee等人，2012年)实时成像研究表明，核周角蛋白网络的丢失与细胞核和整个细胞的运动增强有关。

转染367位含有单一半胱氨酸残基的K14变异体可部分挽救角蛋白循环和核周IF组织

我们报道，在肿瘤衍生角质形成细胞系转染时，用367位的丙氨酸（K14C367A变异体）替换Cys会削弱K14影响细胞核大小和形状的能力(Lee等人，2012年). 我们在GFP载体主干（GFP-K14C367A）中设计了相同的变体，并通过将半胱氨酸放回K14CF主干中的367位（K14CF-C367变体；图S4 a）设计了一个新的互补K14变体。然后我们研究了在Krt14号机组^−/−原代培养的小鼠角质形成细胞。表达GFP-K14C367A的角质形成细胞显示核周IF网络的频率显著降低（仅在26%的细胞中可见；图4，A和B)，这一发现与Lee等人（2012）然而，48%表达GFP-K14CF-C367变异体的细胞显示出核周浓缩网络(图4，A和B). 相对于表达亲代GFP-K14CF主干的细胞，这意味着显著增加（参见图3 B).

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图4。

年核周围集中网络的部分救援Krt14号机组^−/−角质形成细胞转染K14CF-C367。（A） 免疫荧光成像显示，GFP标记的K14C367A和K14CF-C367的过度表达导致角蛋白纤维网络组织的三种模式Krt14号机组^−/−原代培养的小鼠角质形成细胞。棒材，10µm。（B） 如A所示，每种类型中频网络的总体频率。数据表示为三个独立实验的平均值±SD。（C） 表达GFP-K14CF-C367（绿色通道）的活小鼠角质形成细胞的视频记录的静态荧光图像。H2B-mCherry（红色通道）被联合转染以观察细胞核。显示了0到6小时的七个时间点（参见视频4和5). 最大强度投影确定了表达GFP-K14CF-C367的两个不同的小鼠角质形成细胞群体：有（w/periN）或无（w/o periN）核周浓缩网络（分别为45%和55%）。棒材，10µm。（D） 与时间0、3和6 h的二维图像相对应的z堆叠图像的2.5维视图（以C为单位）。

接下来，GFP-K14CF-C367–表达Krt14号机组^−/−对小鼠角质形成细胞进行活细胞成像。观察到两种不同的细胞群(图4、C和D)：45%的转染细胞表现出正常的角蛋白循环，角蛋白丝伸长并不断向细胞核移动，从而形成一个围绕核的丝状物网络(视频4)然而，55%的细胞显示角蛋白丝循环受损，最终未能形成核周网络，即使丝伸长最初看起来是正常的(视频5). 荧光强度的定量表明，表达水平的差异并不能解释这两种行为（图S4 C）。因此，这种差异可能反映了K14、K16和/或K17中其他半胱氨酸的部分参与。总之，这些发现表明K14中的C367参与但不完全足以在皮肤角质形成细胞中建立正常的丝周期和正常的核周角蛋白丝网络组织。此外，我们观察到表达GFP-K14CF-C367的角质形成细胞显示出异常细胞运动行为的显著正常化Krt14号机组^−/−角质形成细胞（图S5、E和F），这表明K14中的C367在这方面起着重要作用。

抗体和其他试剂

使用了以下抗体：抗K14（兔，免疫荧光1:1000，免疫印迹1:5000）和抗K5（兔，1:1000免疫荧光，1:3000免疫印迹）来自Covance，抗结蛋白凝集素（一种针对结蛋白凝集素I和II中保守的C末端片段产生的兔多克隆抗体；1:2000；Angst等人，1990年)是K.Green（伊利诺伊州芝加哥西北大学范伯格医学院）赠送的礼物，抗GAPDH（兔子，1:1000）和抗蛋白二硫异构酶（PDI；兔子，1:100）来自细胞信号技术，IRDye 800CW山羊抗兔子IgG（1:2000）来自LI-COR生物科学，Alexa Fluor 594山羊抗兔子-IgG（1:1000）Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（1:1000）来自Life Technologies。Alexa Fluor 594 C5-甲酰胺和DAPI来自Life Technologies，三（2-羧乙基）膦（TCEP）来自Thermo Fisher Scientific，以及N个-乙基马来酰亚胺（NEM）来自Sigma-Aldrich。DMEM/无钙/低葡萄糖和DMEM/无钙/低糖/无苯基红用于制备黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）培养基，FAD成像培养基来自美国Biologicals。限制性内切酶产品来自新英格兰生物实验室公司。除非另有说明，否则所有其他化学品均来自Sigma-Aldrich。

角蛋白纯化、角蛋白丝体外组装和聚合效率

pT7HMT-K5WT、pT7HMT-K14WT、t7HMT-K14CF和t7HMt-K14CF-C367转化为大肠杆菌BL21（DE3）产生相应的重组人角蛋白作为包涵体。如前所述，使用HiTrapQ和MonoQ柱纯化角蛋白（GE Healthcare）(Lee和Coulombe，2009年). 将包涵体溶解在尿素“缓冲液A”中（50 mM Tris-HCl、6.5 M尿素、1 mM EGTA、1 mM-PMSF和2 mM二硫苏糖醇，pH 8.5），然后应用于HiTrapQ柱上，然后使用MonoQ柱。使用盐酸脲胍“缓冲液B”（50 mM Tris-HCl、6.5 M尿素、0.5 M盐酸胍、1 mM EGTA、1 mM-PMSF和2 mM二硫苏糖醇，pH 8.5）的线性梯度洗脱法洗脱角蛋白。用MonoQ柱制备并纯化了等摩尔比含K5和K14的异型配合物(Lee和Coulombe，2009年). 将纯化角蛋白复合物的浓度调整为0.15 mg/ml，用于纤维组装实验。使用以下三种缓冲液通过连续透析组装角蛋白混合物：（1）9 M尿素和25 mM Tris-HCl，pH 7.5，室温下4 h；（2） 2 M尿素和5 mM Tris-HCl，pH 7.5，室温下放置1 h；和（3）5 mM Tris-HCl，pH 7.5，在4°C下过夜。在角蛋白组装期间，使用还原试剂β-巯基乙醇的存在或不存在来提供还原或氧化环境。在一些实验中，在氧化条件下组装的角蛋白丝在组装后阶段受到还原条件的影响。角蛋白聚合物的物理状态通过高速沉降分析（150000克持续30分钟；Ma等人，2001年)然后使用ImageJ对颗粒和上清液部分进行SDS-PAGE和密度测定(施耐德等人，2012年). 数据以三个独立实验的平均值±SD表示。

透射电子显微镜

使用7600或HU-12A仪器（日立）通过阴性染色（1%乙酸铀酰）和透射电子显微镜检查角蛋白组装体的超微结构。使用AmtV602和ImageJ免费软件程序，在记录的显微照片（80000×标称放大倍数）上测量灯丝长度。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。为了获得横截面上的角蛋白丝，通过高速沉淀将聚合角蛋白造粒，并将其固定在2%戊二醛、0.2%单宁酸、0.1M二羧酸缓冲液（pH 7.2）中，在4°C下过夜，在2%四氧化锇/0.1M二羧酸缓冲液中冰上后固定30分钟，室温下用2%醋酸铀酰整体染色1h，包埋在1%琼脂中，在分级乙醇中脱水，并包埋环氧树脂（电子显微镜科学）。将样品重新埋入“OO”蜂胶胶囊中，并在60°C下聚合24小时。用乙酸铀酰和柠檬酸铅复染薄切片（60–80 nm），并使用日立7600显微镜进行观察。使用AmtV602和ImageJ软件在显微照片（80000×标称放大倍数）上测量灯丝直径。在测量横切丝的直径时，只包括没有分支的孤立致密点。数据以三个独立实验的平均值±SD表示。

野生型小鼠角质形成细胞的原代培养和钙转换实验

所有涉及小鼠的研究都经过了约翰·霍普金斯动物护理和使用委员会的审查和批准。如前所述，从1倍或2倍C57BL/6新生小鼠皮肤中分离角质形成细胞(Bernot等人，2004年). 用0.25%胰蛋白酶/0.02mM EDTA在4°C下处理手术切除的小鼠躯干皮肤16–20小时，从而恢复表皮。使用基于淋巴镜（Stemcell Technologies）的密度梯度离心法（1600 rpm，4°C下20 min）从表皮分离角质细胞，并在表皮角质细胞培养基CnT57（低钙，0.07 mM；CELLnTEC）中培养，直至达到90%融合。通过切换到角质细胞基础培养基2（KBM-2，Lonza）进行钙转换实验，补充1.8 mM钙和10%FBS（Atlanta Biologicals；Hennings等人，1980年;Poumey和Pittelkow，1995年). 钙离子转换24小时后采集角质形成细胞。

细胞裂解物的制备、蛋白质凝胶电泳和免疫印迹分析

为了制备全细胞裂解物，细胞在冷尿素裂解缓冲液中进行裂解（pH 7.0，6.5 M尿素；50 mM Tris-HCl；150 mM氯化钠；5 mM EDTA；0.1%Triton X-100；50µM NEM；1 mM PMSF；凝乳抑素、亮氨酸蛋白酶和胃蛋白酶各1µg/ml；抑肽酶和苯甲脒各10µg/ml；安替比林2µg/mI；以及50 mM氟化钠）。为了检测二硫键合角蛋白的溶解度，首先在低温Triton X-100裂解缓冲液中裂解角蛋白细胞（除了没有尿素外，与尿素裂解缓冲液类似，并且包括1 mM原钒酸钠），然后通过离心（4°C下14000 rpm，30 min）造粒，以分离Triton可溶性组分和不溶性组分。然后将洗涤剂不溶性蛋白质溶解在相同体积的尿素溶解缓冲液中。

对于免疫印迹，使用Bradford分析（Bio-Rad Laboratories）以牛血清白蛋白为标准测定细胞裂解物中的蛋白质浓度。在20 mM TCEP存在下，在十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液（生命科技）中制备SDS-PAGE样品，并在室温下培养1 h以还原二硫键。未经处理的裂解物直接在LDS样品缓冲液中制备。等量的细胞裂解物通过SDS-PAGE溶解并转移到硝化纤维素膜（0.45µm；Bio-Read Laboratories，Inc.）。使用一级抗体进行定量红外免疫印迹分析（LI-COR Biosciences），然后使用与红外荧光染料IRDye800结合的二级抗体(Feng等人，2013年).

Krt14号机组^−/−小鼠角朊细胞原代培养及转染检测

新分离的1或2倍大的角质形成细胞Krt14号机组^−/−新生小鼠皮肤(劳埃德等人，1995年)使用P1原代细胞4D-Nucleofection X试剂盒（Lonza）通过pBK-CMV His-GFP-K14WT或半胱氨酸变体转染。为了研究角蛋白IF的组织结构，将转染的角蛋白细胞接种在胶原涂层盖玻片（VWR）上，在CnT57培养基中培养72 h，用冷甲醇固定，并进行免疫荧光染色。为了分析角蛋白动力学，Krt14号机组^−/−角质形成细胞由pShuttle-CMV-H2BmCherry和GFP标记的K14变异体（摩尔比1:3）共同转染，并在FAD培养基（由DMEM/Ham的F12组成；[3.5:1.1 vol/vol]和低钙[0.05mM Ca²⁺];Reichelt和Haase，2010年)48小时，进行活细胞成像实验。

免疫荧光显微镜和图像处理

如前所述，对细胞骨架结合的半胱氨酸键进行染色(Lee等人，2012年). 简言之，将甲醇固定的角质形成细胞在5 mM NEM/PBS（pH 7.0）中在室温下培养2小时以阻断所有游离半胱氨酸巯基，在10 mM TCEP/PBS（pH 7.0）中培养1小时以减少二硫键，并在2.5µM马来酰亚胺（与AF594/PBS偶联，pH 7.0，在4°C下过夜，以对收获时参与二硫键的硫醇基团进行染色。然后在黑暗环境中进行免疫荧光染色。

对于间接免疫荧光，固定细胞样品在10%正常山羊血清/0.1%Triton X-100/PBS中在室温下封闭1h，在一级抗体溶液中培养1h，用PBS洗涤，在二级抗体溶液培养，用DAPI复染，并安装在FluorSave试剂安装介质（EMD Millipore）中。使用配备ApoTome II附件和AxioCam MRm相机（均来自卡尔蔡司）的荧光显微镜（Axio Observer.Z1）作为单焦面采集荧光图像。聚焦于原子核的中心来选择焦平面。使用63×Plan-Apochromat油浸物镜拍摄照片，系统由AxioVision 4.8.2软件（卡尔蔡司）控制。ImageJ免费软件中的共定位模块用于评估角蛋白和二硫化物信号之间的共定位（阈值通道1和2[范围0–255]=125），并生成共定位通道（8位灰度）。

在分析转染的小鼠角质形成细胞时，可以区分三种不同的角蛋白纤维网络组织模式（图S3）。使用ImageJ，我们测量了角蛋白丝的荧光信号的相对强度，该荧光信号穿过从细胞外边缘到核膜的空间，以代表其角蛋白IF网络的组织。为此，使用Freehand命令在16位灰度图像上从细胞外膜到核膜（通过细胞核中心对齐）绘制任意线。细胞外围到核膜的距离被任意设置为1，以便于比较大小和形状稍有不同的细胞，因为新生小鼠皮肤分离的角质形成细胞具有异质性(多托，1998年). 使用相对荧光强度（FI%，范围从0到100）作为y轴，并使用相应的相对距离（RD，范围从细胞外膜的0到核膜的1）作为x轴来建立图（定义标准见图S3）。随机选择每种转染剂的50张图像，并进行定量，以确定数据集内的一致性，该数据集是通过盲目进行定性评估获得的。

活细胞成像和图像处理

小鼠角质形成细胞在PBS中清洗，并在转染48小时后切换到FAD成像介质。使用单点激光扫描共焦显微镜（LSM780-FCS；卡尔蔡司）记录图像。使用40×Plan-Neofluar油浸物镜和Zen软件（卡尔蔡司）拍摄照片。将密闭培养皿中的细胞保存在37°C和5%CO的环境室中₂湿度为25°C。GFP和mCherry的激发分别设置为488 nm和561 nm。成像参数的选择基于以前角蛋白动力学的活细胞成像研究(Windoffer和Leube，2004年). 记录间隔为5分钟，色深为12位，图像分辨率为1024×1024像素。每个时间点记录了七个聚焦平面（光学切片厚度为每层0.43µm），聚焦于细胞中心，视频记录持续6小时。使用Zen软件压缩时间序列的3D堆栈，生成最大强度投影，和感兴趣的区域是使用AxioVision 4.8.2软件（均来自卡尔蔡司）从投影图像中选择的，用于准备图形和将图像转换为QuickTime电影（Apple）。使用Zen软件从z堆栈重建2.5维图像。此外，对最大强度投影进行了原子核运动分析。自动选择并标记Nuclei，并使用Imaris软件（Bitplane）跟踪其相应位置和速度。

定义

在我们的活细胞成像研究中，我们指的是一个“正常”的角蛋白周期，即短角蛋白丝在细胞外围形成，然后随着它们向细胞中心的持续稳定流动而伸长，并在形成核周集中网络时在细胞中心聚集。或者，我们指的是“受损”的角蛋白循环，即细胞外周角蛋白丝的成核或伸长被破坏，或角蛋白循环期间未能形成或维持核周浓缩网络。

统计分析

使用Excel 2011（Microsoft）和Prism版本5（GraphPad Software，Inc.）进行统计分析。这个t吨当比较两种条件或样品时使用测试（见图S1、C和S4、B和C）。在比较三种条件或样品时，使用了单向方差分析（ANOVA）（参见图5 F和S5 F）。P值<0.05被认为是显著的。

我们感谢库伦实验室成员的支持，感谢吉尔·哈基姆（Jill Hakim）和珍妮特·福尔默（Janet Folmer）的技术援助，感谢医学院显微镜设施（用于活细胞成像实验）（美国国立卫生研究院（NIH）授予S10 OD016374），感谢瓦莱丽娅·库洛塔（Valeria Culotta）、迈克尔·马图尼斯（Michael Matunis）、安德鲁·埃瓦尔德（Andrew Ewald）、瑞恩·霍布斯（Ryan Hobbs），和Carole Parent寻求建议。

本研究由美国国立关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH）向P.A.库伦（P.A.Coulombe）提供的AR042047赠款资助。

作者声明没有竞争性的经济利益。