II型细菌CRISPR（簇状规则间隔的短回文重复序列）/Cas9系统可以通过突变形式的Cas9（Cas9）来诱导RNA导向的双链DNA断裂或单链“缺口”D10A型或案例9n）1-三CRISPR/Cas9技术已被用于在小鼠基因组中产生可遗传的变化，大大减少了开发基因工程小鼠模型（GEMM）所需的时间4-6然而，纯合生殖系突变通常会导致胚胎致死或发育缺陷，并且不是组织特异性的，这限制了此类模型用于研究成人组织中的基因功能。此外，虽然合子中的CRISPR/Cas9定向突变能够快速产生复合突变体，但创始人的遗传嵌合体和等位基因分离限制了无需进一步交叉就能产生大量实验小鼠群体的能力。在这里，我们描述了一种快速四环素（强力霉素）调节的方法，该方法能够诱导体内单个转基因的多个位点的遗传操作。
我们和其他人以前使用重组酶介导的盒交换方法将四环素诱导的cDNA和shRNAs传递到一个确定的基因组位点，从而减少与随机整合相关的创始人效应7,8作为原则证明，我们选择了特征明确的大肠腺瘤性息肉病（Apc）抑癌基因作为靶点，因为Apc的种系丢失对胚胎是致命的9而成年小鼠肠道中Apc的破坏会导致增生性息肉的形成10.我们首先产生了针对小鼠的单导向RNA（sgRNAs）亚太区在紧邻NGG-PAM序列上游12bp处包含一个独特的“种子”区域（参见方法）。我们还开发了sgRNAs来靶向Trp53基因(补充图1A)，该基因的失活通常与APC结肠癌同时发生。使用Surveyor分析法对转染小鼠ES细胞的分析显示了预期的修改(补充图1A). 接下来，我们将每个U6 sgRNA盒克隆到一个新的列1a1-目标构造，TRE上游3克-调节GFP-IRES-Cas9()，这有助于生成携带多个串联U6-sgRNA盒的构建物。作为sgRNA表达和Cas9介导的DNA切割的控制，我们生成了一个靶向小鼠8号染色体上非基因区域的sgRNA(CR8号机组).
mESCs中的可诱导基因组编辑。A类c3GIC9的示意图列1a1-目标载体。将U6-sgRNA盒（NsiI/SbfI）克隆到一个独特的NsiI位点，在U6启动子上游重建NsiI部位，允许添加更多的U6-sg RNA模块。B类1μg/ml dox处理72小时后ES细胞克隆中的GFP诱导。C、。测量员分析CR8，亚太地区和Trp53基因对个体靶向ES细胞克隆（每个基因型显示2个克隆）进行dox处理2天后的基因座。星号表示在一些克隆中观察到在缺少dox的情况下可检测到的突变事件。D类.转基因c3GIC9中Apc位点的指数频率-Apc/Trp53如图所示，加入或不加入1μg/ml dox的ESCs培养物（误差条为SEM，n=2）。E类野生型、单等位基因或双等位基因indels在亚太区和Trp53基因c3GCI9基因座-Apc/Trp53用dox处理ESCs 10天，然后在没有dox的情况下扩展为单个克隆（克隆A，n=83；克隆B，n=71）。F类。帧移位（蓝色）和帧内突变（绿色）的频率亚太区和Trp53基因ESC克隆中的基因座E类.克.饼图表示indels（左）和frameshift突变（右）的频率亚太区和Trp53基因结果表明，91-94%的克隆在两个位点都携带双等位基因indels，40-49%的克隆在所有4个等位基因中都携带移码突变。
我们生产了靶向KH2 ES细胞克隆CR8号机组,亚太区和Trp53基因并通过Surveyor分析测试是否存在插入和删除（indels）。两种GFP诱导（与Cas9相关）()并且靶点修饰发生在dox治疗的2天内()并且随着时间的推移而增加(). 此外，靶向ES细胞克隆携带亚太区和Trp53基因串联的sgRNAs显示出等效的indel频率()表明两个串联sgRNAs的存在并不影响Cas9-介导的切割效率。为了直接评估我们的系统在多个基因中诱导双等位基因修饰的能力，我们治疗了两个独立的c3GIC9-Apc/Trp53双亲ES克隆与dox共培养10天，去除dox并允许单个克隆在没有Cas9表达的情况下扩增。在桑格测序分析的154个ESCs克隆中，超过94%的克隆在给定的位点显示双等位基因断裂(). 这两个等位基因的帧移位与下indel比率接近2:1（偶然）()这意味着对功能丧失突变的选择并不能解释观察到的indels的高频率。最重要的是，90%以上的克隆在两个位点都表现出双等位基因修饰亚太区和Trp53基因(（左），几乎一半的克隆在4个等位基因中的每一个都含有移码中断(，右侧）。这些数据表明，iCRISPR系统可用于诱导单个转基因的多个靶点的破坏。
在某些情况下，我们发现ES细胞克隆在缺乏dox的情况下表现出indels的证据（见星号，). 在分析的39个克隆中，13个（33%）表现出一定程度的非正统突变。然而，“非正统”突变的频率并没有随着持续培养而增加(，另请参见11)这表明它们是由于转染过程中Cas9的泄漏表达引起的。因此，我们为每个靶向事件筛选最多6个克隆，以确定用于小鼠生产的非突变克隆。
CRISPR/Cas9基因组编辑也可能导致“偏离目标”突变12.我们确定了潜在的非靶基因座(补充表1，见方法），并评估其在dox处理的c3GIC9中的突变-Apc/Trp53ES细胞。在所有sg的偏离目标预测中-Trp53基因（12个站点）和sg-亚太区（6个位点）sgRNAs，只有一个Trp53基因预测（介绍麋鹿3)显示了indels的证据(补充图1B). 该区域在每个dox处理的Trp53 sgRNA克隆中都被修饰(补充图1C)这意味着它是一个真正的非目标站点。在18个预测的非目标中，只有OFT7(麋鹿3内含子）在PAM上游的12bp种子区显示出100%的互补性(补充表1)，与先前的观察结果一致，并表明sgRNA的3'区决定了靶特异性1.
通过使用Cas9n“nickase”变体与靶向交替DNA链的紧密间隔sgRNAs结合，可以减少培养细胞中的非靶向突变，从而提高预期位点的特异性三。我们克隆sgRNAs以与现有sgRNAs配对亚太区和Trp53基因(补充图1A)，并生成目标ES克隆，每个克隆都带有一个TRE配对组合3克调控Cas9n转基因。正如预期的那样，Cas9n的诱导促进了两者的indelsTrp53基因(补充图1C)以及亚太区(补充图1D)但消除了(麋鹿3)新加坡-Trp53基因非目标站点(补充图1C). 我们的调查不是全基因组的，因此我们不能排除sgRNAs/Cas9复合物影响其他区域的可能性。然而，这些数据表明，使用“配对镍酶”方法可以产生条件敲除，同时减少不希望的基因组修改。
接下来我们生产了携带c3GIC9靶向性的转基因小鼠CR8号机组,亚太区和Apc/Trp53以及c3GIC9n靶向亚太区(亚太区n个). 创始人的育种证实，每个目标等位基因都是以孟德尔比率传递的，表明在胚胎发育期间没有毒性(补充表2). 尽管如此，即使是少量泄漏的Cas9表达也会引发种系突变事件。测序结果显示，后代中只有16/166个位点（9.6%）携带杂合突变CR8号机组,亚太区或Trp53基因在每个菌株中，这些杂合子突变是相同的，这表明它们是由ESC中的罕见事件引起的，这些事件有助于创始人的生殖系，而不是繁殖期间的独立自发事件。因此，在ESC克隆生成过程中，Cas9的泄漏表达偶尔会诱导dox-independent突变，但通过选择合适的F1子代进行菌株繁殖，这是容易控制的。
有条件删除亚太区在小鼠肠道中诱导增生增殖并阻止分化，导致快速肠功能障碍和死亡13.确定CRISPR/Cas9系统是否可以重述条件亚太区基因敲除表型体内，我们用dox治疗4-5周龄的R26-rtTA/c3GCI9双转基因动物，并对其进行长期监测。dox治疗10天后肠绒毛的测量分析显示预期的基因改变(补充图2A)免疫染色证实Apc和p53蛋白丢失(). 值得注意的是，我们观察到一些p53阳性细胞和罕见的染色增强现象，可能反映了调节蛋白质稳定性的区域缺失(，箭头）。那些携带亚太区-靶向sgRNAs显示Wnt靶基因Axin2和Lgr5的诱导倍数为40-60倍，原癌基因cMyc的诱导倍数显著增加（130倍(补充图2B). 与分子反应相一致，组织学显示，溶菌酶阳性的Paneth细胞显著增殖、隐窝扩张（Ki67-绿色）、分化显著减少（角蛋白20-红色）和异位生成(,补充图2C)，如急性Apc缺失后所预期13令人惊讶的是，Cas9n/配对sgRNA方法在产生亚太区突变为Cas9(补充图2A)，促进Wnt靶基因表达类似或更大的增加(补充图2B)，并产生了相同的肠道表型().
成年小鼠的可诱导基因组编辑。答：。10天dox处理的R26-rtTA/c3GIC9肠道切片的免疫荧光染色-CR8号机组,亚太区、和Apc/Trp53小鼠，如图所示。对Apc（红色）和p53（绿色）进行染色的切片显示，在dox治疗后，每个靶蛋白都丢失了。白色箭头表示在脱氧处理的c3GCI9中罕见的“p53高”细胞簇-Apc/Trp53动物。比例尺为50μm。B类.10天dox处理的R26-rtTA/c3GIC9肠道切片的免疫组织化学和免疫荧光图像-CR8、Apc、Apc/Trp53和c3GIC9n-亚太区(亚太区n个)老鼠。对切片进行增殖标记（Ki67-绿色）、分化标记（K20-红色）和Paneth细胞标记（溶菌酶-棕色）染色。Apc-靶向sgRNAs的诱导导致Paneth细胞增生过度生长、分化受阻和异位生成。比例尺为100μmC类R26-rtTA/c3GIC9有机物培养物的Brightfield图像-亚太区转基因小鼠用dox（0.5μg/ml）处理0、24或7天，然后在培养基中扩增10天。D类.培养物中球体形成的定量C类条形图表示退出dox后10天内球体（与正常类有机物相比）的百分比。E类.c3GIC9全细胞裂解物的Western blot-亚太区和c3GIC9-Apc/Trp53如图所示，经dox处理的有机物培养物显示全长Apc丢失，非磷酸化β-catenin增加，反映出Apc蛋白丢失后信号增强，并且仅c3GIC9中p53蛋白缺失-Apc/Trp53细胞。Apc印迹的未剪切全长图像如图所示补充图3，显示CRISPR介导的编辑后截短蛋白的表达。
为了更密切地评估iCRISPR随时间的功能，我们利用了这样一个事实，即Apc失活会导致培养的肠道类器官发生可测量的形态（球形）变化14我们从双转基因小鼠中分离出肠隐窝，并在添加dox后的不同时间评估器官形态。我体外试验CRISPR诱导2天即可产生未分化球体(，未显示）其频率随时间增加。(). D7脱氧核糖核酸处理的培养物实际上是100%的球形，显示出全长Apc蛋白的完全丢失，非磷酸化β-连环蛋白相应增加，这是Apc丢失的下游后果(,补充图3B). 来源于dox-treated c3GIC9的培养物-Apc/Trp53基因串联小鼠显示p53几乎完全缺失(和补充图3)进一步证实了该方法对多基因失活的有效性。
有趣的是，p53在类器官培养物和肠道中的表达是镶嵌的，可能反映出框架内缺失不会导致蛋白质表达的损失，也可能反映出没有修饰细胞的缺失Trp53基因轨迹(,补充图3). 为了全面评估Cas9/Cas9n诱导后产生的indels的频率，我们在55000个读取/样本的平均深度下，对经脱氧核糖核酸处理的小鼠肠道和胸腺gDNA中的每个靶位点进行了测序。经过10天的dox治疗后，两种组织都表现出较高的靶基因修饰频率（50-85%）()尽管indels的大小和类型在每个位点和组织之间差异很大(,补充图4). Cas9n与配对亚太区-与单一sgRNAs相比，靶向sgRNAs显示出对缺失事件的偏向亚太区-靶向sgRNA(补充图4C)以及删除大小的显著增加(,补充图4A，D). 与ESCs的观察结果一致，c3GIC9串联小鼠表现出两者的一致突变亚太区和Trp53基因基因(，右2= 0.972).
小鼠Cas9/Cas9n诱导后基因修饰的频率和类型。答：。对照组肠道（深蓝色）和胸腺（浅蓝色）中吲哚的频率(CR8号机组)、dox-na-ive（无R26-rtTA）和D10 dox处理小鼠亚太区和Trp53基因如图所示（误差条为SEM，n≥3）。B类.散点图，显示指数的频率和大小亚太区和Trp53基因如图所示，dox处理的肠道中的基因座。蓝色点表示移码突变，而绿色点表示帧内指数（n=4）。C类.显示频率相关性的散点图亚太区和Trp53基因c3GIC9中的indels-Apc/Trp53串联小鼠。肠和胸腺的数据一起显示。D类如图所示，dox处理的小鼠的肠道和胸腺中的移帧（蓝色）和帧内indels（绿色）的频率（每个基因座和每个组织n=4）
Cas9突变可产生移码和帧内索引，原则上应以2:1的比例发生。由于框内缺失可以产生功能蛋白，组织中移码突变的相对丰度可以表明基因功能的丧失对细胞适应度是否有积极、消极或中性的影响。与这一观点一致，Apc和Tp53失活在ESCs中没有产生选择性优势，并且两个基因座都显示出预测的2；1帧移位与帧内删除的比率(). 相反，Apc失活在肠道中产生了实质性的选择性优势，sgApc/Cas9小鼠的肠道组织显示出对Apc截断的强烈偏见（97%移码突变）(). 在这些相同的动物中，p53失活在分析的时间范围内几乎没有额外的优势15因此，移码指数的频率保持在预测的2/3频率（72%）附近。值得注意的是，虽然Apc的破坏具有很强的选择性优势，而p53的破坏则没有，但这两个位点都表现出等效的CRISPR介导的修饰()这意味着该系统可以用于研究“适应度中性”突变。
如ESCs和类有机物中所示，Cas9诱导突变体内具有时间依赖性，因为连续4天表达Cas9诱导的突变显著减少，并降低了肠道的整体疾病负担(补充图5). 因此，通过定时接触dox改变Cas9表达的持续时间，可以进一步控制基因功能的改变体内此外，限制Cas9表达的能力可能会减少与sgRNA-Cas9复合物组成性表达相关的毒性和非靶向效应，sgRNC-Cas9复合体可以与数千个基因组序列相关16.
在我们的系统中，突变的空间诱导是由rtTA等位基因的表达位置决定的，因此Cas9也是如此。因此，将rtTA限制在特定组织的策略提供了一种产生组织特异性基因破坏的方法。为了探索Cas9在其他组织中诱导基因组编辑的潜力，我们使用流体动力学转染在c3GIC9 Apc的肝脏中以限制性和镶嵌性的方式表达rtTA3n个老鼠。组织学分析显示，GFP阳性肝细胞内预期有总β-连环蛋白和非磷酸化β-连环素的细胞质和细胞核蓄积(补充图6). 因此，通过集中交付（如上）或使用Cre-dependent系统来控制rtTA的表达17，CRISPR系统可用于产生组织特异性和条件性基因缺失体内综上所述，我们的数据显示，依赖于dox的Cas9或Cas9n诱导体内诱导靶基因改变，以重现传统条件敲除方法的效果。
最近的研究描述了CRISPR/Cas9介导的基因组编辑的应用体内使用病毒传递或DNA转染18-21。虽然能够基于CRISPR的快速编辑来产生基因修改和染色体重排，但此类方法仅限于可通过外源性构建物（即肝、肺、脑）有效访问的组织。从鼠标建模的角度来看，iCRISPR平台在概念上类似于可诱导的基于Cre的系统（即CreER），尽管很难直接比较每种系统的有效性。首先，与基于LoxP的等位基因产生的缺失不同，CRISPR/Cas9依赖于NHEJ不精确的DNA修复，因此产生了异质的遗传突变体群体。理论上，通过使用靶向基本蛋白质结构域编码区的sgRNAs和/或使用成对的sgRNA来增加缺失大小，可以增加“无效”等位基因的频率(). 其次，Cre介导的缺失效率因基因组区域和重组事件大小而异，而sgRNA序列或NHEJ效率的变化可能会影响CRISPR/Cas9突变。重要的是，我们并不认为iCRISPR方法取代了基于Cre/LoxP的条件敲除，而是为研究基因功能提供了一种灵活和互补的替代方法体内当传统方法不适用时（例如用于创建特定的基因截断），或者足够快速或可扩展。
在R26-rtTA公司小鼠，TRE3克-介导的Cas9诱导在肠道、皮肤和胸腺中很强，尽管TRE3克启动子在成年小鼠中显示出一些嵌合体，如果给予适当的rtTA表达（例如通过直接传递或替代转基因菌株），它可以诱导其他组织中的基因断裂，例如肝脏(补充图6). 替代TRE启动子或Cre依赖的TRE-LSL-Cas9转基因的掺入，类似于组织特异性shRNA表达产生的那些转基因17，应能在更广泛的组织中诱导突变，从而在发育期间或在成人中允许组织限制性条件基因破坏。此外，iCRISPR平台可通过分别使用dCas9-KRAB和dCas9-VP64变体的转录抑制（CRISPRi）或激活（CRISPRa）进行适应性CRISPR介导的基因抑制22,23这些系统提供了一种强有力的方法来同时调节多个基因的表达，而不存在突变异质性，然而，它们尚待全面评估体内而且，与Cas9不同，它不会导致经常与疾病相关的永久性基因改变。
最后，我们的工作表明，配对sgRNA与Cas9n的结合使用可以导致非常严重的功能丧失表型体内同时减少非目标突变，使其成为大多数应用的首选系统。虽然这种方法要求每个靶点表达2个sgRNA，但c3GIC9n靶向载体可以容纳至少6个U6-sgRNA盒，而不会显著降低靶向效率(补充图7). 当然，增加基因组靶点的数量也会增加突变的复杂性和异质性，因此，针对许多基因的菌株的分析可能很复杂，最适合于对这些变化进行积极选择的癌症研究。无论如何，诱导型CRISPR/Cas9介导的基因组编辑提供了一种简单的策略，可以在不到6个月的时间内开发有条件的遗传“缺失”模型，为研究基因功能提供了一个灵活、快速和低成本的平台体内试验。
联机方法
动物
根据第11-06-012号方案，所述小鼠的生产和所有治疗均由斯隆-凯特琳纪念癌症中心动物护理和使用委员会（IACUC）批准。通过MSKCC转基因核心设施通过囊胚注射产生ES细胞衍生小鼠。将动物饲养在混合C57B6/129上，并使用之前描述的引物和方案对繁殖后代进行特定等位基因（R26-rtTA和col1A1）的基因分型17,24多西环素通过食物粒剂（625mg/kg）给药（Harlan Teklad）。动物研究不是盲目的。为了检测p53蛋白，在6Gy全身照射后4小时处死动物。对于流体动力质粒输送12.5μg pCAGs-rtTA3质粒与0.9%无菌氯化钠溶液混合。在5-7秒内将总量相当于体重10%的氯化钠/质粒混合物注射到小鼠的尾侧静脉中。
克隆
hCas9（来自pX330）或hCas9n（pX335）被克隆到列1a1-TRE3G-GFP-IRES下游的靶向载体。将编码引导RNA的序列克隆到pX330和pX335中进行初步验证1.U6启动子+引导RNA对进行PCR扩增（序列补充表3)并将（NsiI/SbfI）克隆到TRE3G启动子上游的NsiI位点。NsiI位点改造了U6-sgRNA盒的上游，可用于sgRNA的顺序添加。这个c（c）ol1a1-TRE公司三克-克FP公司-我可再生能源-C类作为9（c3GIC9）和c3GIC9n靶向载体不能存放在Addgene，因为含有TRE3G启动子的质粒分布受到限制，但可根据要求提供。
ES细胞靶向
如前所述，所有ES细胞均保存在含有LIF的M15培养基中的辐照供料器上24转染细胞后两天，用含有150 ug/ml潮霉素的培养基处理细胞，并在选择9-10天后挑选单个存活克隆。挑选克隆两天后，从培养基中取出潮霉素，然后在标准M15中培养细胞。要在列1a1我们首次通过多重验证期望积分的轨迹列1a1聚合酶链反应24第二，根据制造商说明（Invitrogen），使用Taqman拷贝数分析确认存在单个GFP盒。
免疫组织化学和免疫荧光
将组织固定在新制备的4%多聚甲醛中24小时，嵌入石蜡中，并由IDEXX RADIL（密苏里州哥伦比亚）切片。通过以下两种方法之一对切片进行重新水化和揭盖（抗原提取）：（i）在压力锅中，在含有0.05%吐温20的10mM Tris/1mM EDTA缓冲液（pH 9）中热处理10分钟，或（ii）在37℃下，蛋白酶K处理（200 ug/ml）10分钟（溶菌酶染色）。对于免疫组织化学，切片用3%H处理2O（运行）2在含有1%BSA的TBS/0.1%Triton X-100中封闭10分钟。对于免疫荧光，切片未经过氧化物酶处理。在阻断缓冲液中4C培养过夜的主要抗体为：鸡抗GFP（1:500，#ab13970）、兔抗ki67（1:100，Sp6克隆，Abcam#ab16667）、兔抗KRT20（1:250，细胞信号技术，#13063）、抗溶菌酶（1:800，Dako，#EC3.2.1.17）、兔防p53（1:200，Leica Biosystems，#NCL-p53-CM5p）和兔抗APC（1:150，Abcam#15270）。对于免疫组织化学，将切片与抗兔ImmPRESS HRP缀合的二级抗体（Vector Laboratories，#MP7401）孵育，并使用ImmPatch DAB（Vector Laboratories，#SK4105）进行染色质开发。用哈里斯苏木精对染色玻片进行复染。对于免疫荧光染色，二级抗体在室温下黑暗中的TBS中应用1小时，用TBS清洗两次，用DAPI复染5分钟，并安装在ProLong Gold（Life Technologies#{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P36930”，“term_id”：“1248281091”，“term_text”：“P26930”}}第36930页). 使用的二级抗体为：抗鸡488（1:500，DyLight IgG，#ab96947）和抗兔568（1:50，分子探针，#a11036）。使用10倍（蔡司NA 0.3）或20倍（蔡司NA 0.17）物镜和ORCA/ER CCD相机（日本滨松滨松光电公司），在蔡司Axioscope Imager Z.1上采集荧光、ISH和IHC染色切片的图像。使用Photoshop CS5软件（加利福尼亚州圣何塞市Adobe Systems Inc.）处理原始.tif文件，以调整级别和/或应用假着色。
小肠类有机物的分离培养
隔离
取近端小肠15 cm，用冷PBS冲洗。纵向打开后，用冷的PBS冲洗，直到上清液澄清。然后将肠切成5mM的块，放入10ml冷的5mM EDTA-PBS中，并使用10ml移液管剧烈重悬。吸取上清液并用10ml EDTA替换，放置在4°在台式压路机上压10分钟。然后再次重复30分钟。吸取上清液，然后向肠中加入10ml冷PBS，并用10ml移液管重新悬浮。在收集了这10毫升含有PBS的肠隐窝部分后，重复这一步骤，收集每个连续的部分，并在显微镜下检查是否存在完整的肠隐睾和绒毛缺失。然后将10ml部分与10ml DMEM基本培养基（含有Pen/Strep、谷氨酰胺、B27（Invitrogen 17504-044）、1mM N-乙酰半胱氨酸（Sigma-Aldrich A9165-SG）的高级DMEM F/12，其中含有10U/ml DNAse I（Roche，04716728001））混合，并通过100微米过滤器过滤到BSA（1%）涂层管中。然后通过70微米过滤器将其过滤到BSA（1%）涂层管中，并以1200 RPM的转速旋转3分钟。吸取上清液，将细胞颗粒与含有5%FBS的5ml基本培养基混合，并在650 RPM下离心5分钟。然后将纯化的地穴重新悬浮在基础培养基中，并与生长因子减少基质（BD，354230）以1:10的比例混合。40μl的再悬浮液被镀在48孔板中，并放置在37孔板中°C培养箱聚合10分钟。然后将250ul小肠类有机物生长培养基[含有50 ng/mL EGF（Invitrogen PMG8043）、100 ng/mL Noggin（Peprotech 250-38）和500 ng/mL R-spondin（R&D Systems，3474-RS-050）的基本培养基]放置在基质凝胶顶部。在适当的情况下，培养基中添加0.5 ug/ml强力霉素（较高浓度的强力霉素对类有机物有毒）。
维护
每两天更换一次有机物培养基，每5-7天以1:4的比例传代。为了传代，去除生长培养基，将Matrigel重新悬浮在冷PBS中，并转移到15ml猎鹰试管中。使用p1000或p200移液管机械分离有机物，并移液50-100次。将7 ml冷PBS添加到试管中，并用移液管吸取20次，以充分清洗细胞。然后以1000 RPM离心细胞5分钟，并抽吸上清液。然后将其重新悬浮在GFR基质凝胶中，并按照上述方法重新放置。冷冻时，旋转后，将细胞重新悬浮在含有10%FBS和10%DMSO的碱性培养基中，并无限期保存在液氮中。
蛋白质分析
在传代后4天，在含有3ml生长培养基的6孔培养皿的每个1孔中的300ul Matrigel中生长小肠类器官，然后用125ng/ml阿霉素处理4小时以诱导p53表达。然后使用几次冷PBS冲洗从苦参中回收有机物。用Lamelli缓冲液溶解有机物颗粒。用于Western blot的抗体为：抗APC（1:400，FE9克隆，Millipore#MABC202）、抗非磷酸化β-catenin（1:1000，#8814，细胞信号技术）、抗p53（1:500，#NCL-p53-505，Novocastra）和抗actin-HRP（1:10000，#ab49900，Abcam）。
RNA分离和QPCR
用于小肠样品。用玻璃片刮取近端十二指肠（约1英寸）的绒毛和隐窝。用棒式均质器将绒毛/隐窝颗粒溶解在1mL Trizol（Invitrogen，15596-026）中，根据制造商说明提取RNA，并通过DNA酶处理10分钟和柱纯化（Qiagen RNeasy）去除污染DNA。使用Taqman逆转录试剂盒（Applied Biosystems，#N808-0234）和随机六聚体从1μg总RNA制备cDNA。使用SYBR绿色试剂（Applied Biosystems）和Axin2、Lgr5、Myc特异性引物进行定量PCR检测(补充表3).
SURVEYOR试验检测突变
使用SURVEYOR突变检测试剂盒（转基因/IDT）检测Cas9诱导的突变。简而言之，使用Herculase II（600675，安捷伦科技公司）对预期突变位点周围约500bp的区域进行PCR扩增。对PCR产物进行柱纯化（Qiagen），并进行一系列熔化温度循环，在每个连续循环中退火温度逐渐降低25然后添加SURVEYOR核酸酶以选择性消化异源双链DNA。在2%琼脂糖凝胶上观察消化产物。
序列分析
桑格
c3GIC9-Apc/Trp53基因ESCs克隆用dox（1μg/ml）处理10天，从dox中去除2天，然后在低密度下作为单个细胞进行电镀，并允许其膨胀6天以上。将单个ESC克隆直接挑选到15μl DNA裂解缓冲液中（70mM Tris pH8.8，160mM（NH4)2SO公司4，6.5mM氯化镁2，蛋白酶K（400μg/ml）），并在55°C持续2小时，然后是95°C持续20分钟。使用特定PCR引物从1μl粗gDNA中扩增目标区域(补充表3)并通过染料终止剂测序进行测序（Genewiz Inc.，新泽西州南普莱恩菲尔德）。在非纯合子indel事件的情况下，使用“CRISPR-Caller”算法对重叠序列轨迹进行反褶积(https://github.com/shackett/CRISPR-Caller/blob/master/CRISPR-Caller.R)，修改以映射到小鼠基因组。任何无法反褶积以明确识别两个独特等位基因的痕迹（例如，每个位置或不可匹配区域有两个以上的峰）都被排除在进一步分析之外。
MiSeq公司
使用特定PCR引物从基因组DNA中扩增目标区域(补充表3)，扩增子以等摩尔量汇集，测序文库使用Kapa Biosystems HTP文库制备试剂盒（cat#kk8234）制备，严格遵循制造商的说明。使用TruSeq SBS Kit v3（Illumina）将条形码库汇集到150bp/150bp配对末端MiSeq运行中。为了寻找插入/删除事件，使用BWA版本0.7.10（BWA-mem-M）将序列数据（FASTQ文件）映射到小鼠（MM10）基因组。然后直接处理输出SAM文件以过滤对中的一个读取，并过滤mapq≥50。在这个读取集中，我们直接扫描雪茄串，查找1）预测长度（150bp）的读取，或2）包含一个且仅包含一个插入（I）或删除（D）事件的读取。150bp的读取被计算为WT，对于包含indel的读取，我们提取事件的长度并存储indel长度的直方图。最后的输出是通过筛选的读取总数的计数，在有索引和无索引的情况下进行了细分。由于在整个读取长度上测序固有的相对较高的错误率，单碱基取代被忽略并被评分为WT。这可能导致对WT读取频率的轻微高估。
非目标预测
我们根据以下标准在小鼠基因组中鉴定出20mer序列，这些序列与主要Apc和Trp53靶向sgRNAs完全或部分一致：紧邻3'NGG-PAM序列的12bp种子区域中最多有1个错配，sgRNA 5'端8bp区域中最多5个错配。为了做到这一点，我们使用SHRiMP映射器（gmapper ls）搜索所有无间隙比对，对整个小鼠基因组的比对得分为30%。然后对该列表进行后处理，以筛选与上述不匹配标准的匹配项。对于每个预测区域，我们设计了围绕该位点的PCR引物，并通过Surveyor分析评估indel形成。
