Frizzled6控制小鼠的头发图案

摘要

Frizzled（Fz）家族的创始成员于果蝇属作为产生角质刚毛和毛发正确方向所需的基因，这一过程被称为组织极性或平面极性(1,2). Fz家族成员随后在动物王国被发现(三)、细胞培养实验和果蝇属表明它们作为Wnt受体发挥作用(4–8). 目前的证据表明，Fzs可以通过至少三种不同的途径发出信号：“典型Wnt途径”（涉及β-catenin的稳定和选择性基因激活）、rho/jun激酶途径和动员钙的G蛋白途径(9). 目前，参与组织极性信号传导的配体的身份尚不清楚。

到目前为止，体内在10个哺乳动物Fz基因中，只有3个基因的功能被定义。损失Fz3公司在中枢神经系统的轴突发育和寻路中产生缺陷(10,11); 损失Fz4公司导致进行性小脑变性、食道扩大、内耳血管纹萎缩和视网膜血管发育缺陷(12–14); 和损失Fz5公司产生卵黄囊缺陷和胎盘血管生成(15). 这些不同的表型是否涉及组织极性途径尚不清楚。然而，真正的哺乳动物组织极性系统几乎肯定存在，因为(我)大多数（如果不是全部）都有哺乳动物的直系亲属果蝇属与组织极性有关的基因，以及(ii（ii）)在发育中的小鼠听觉毛细胞中观察到方向性缺陷，这些毛细胞中的任何一种都有缺陷(Vangl2、Scrb1型、和塞尔斯1; 参考文献。16和17)可溶性Wnt拮抗剂在外植体培养中也能诱导类似的缺陷(18).

在本文中，我们发现与小鼠靶向突变相关的表型Fz6公司基因非常类似于在果蝇突变体。这些数据表明，哺乳动物的毛发图案使用的是一种依赖于Fz的组织极性系统，类似于为毛发图案设计的系统果蝇属角质层。

实验程序

Fz6的生成(-/-)老鼠。这个Fz6公司敲除结构删除密码子1–125（编码信号序列和大多数富含半胱氨酸的配体结合域），并携带一个loxP侧翼PGK-neo公司同源臂与载体内单纯疱疹病毒胸苷激酶盒之间的盒。将线性化DNA电穿孔成129个胚胎干细胞，并在含有G418和更昔洛韦的培养基中培养细胞。接种后8天采集菌落，并通过Southern blot杂交进行筛选。携带同源重组等位基因的胚胎干细胞克隆被注射到C57BL6囊胚中。采用标准方法进行动物繁殖和基因分型。目标Fz6公司等位基因在混合C57BL6×129背景和纯129背景上均保持不变。loxP侧翼PGK-neo公司通过与生殖系cre小鼠杂交去除盒(19).

通过胚胎聚集产生和分析嵌合体小鼠。ICR之间的ChimerasFz6公司（+/+）和C57BL6×129Fz6公司（+/-）或Fz6公司（-/-）通过使用标准胚胎聚集方法生成(20). 大约在出生后第10天（P），对小鼠拍照，将每只后脚侧面和背面的皮肤切成一块，压平，用昆虫针固定在Sylgard块上，并在5-溴-4-氯-3-吲哚β之前和之后拍照-d日-半乳糖苷（X-Gal）染色。在一组动物中，对头部和背部的皮肤进行了类似的分析。

抗体生产和纯化。将与小鼠Fz6的C末端17 aa相对应的合成肽与戊二醛交联至BSA，并在N末端添加额外的半胱氨酸（CSASRARKEQGAGSHSDA）(21)并用于免疫家兔。使用与Affi-Gel 10基质（Bio-Rad）偶联的相同肽对抗血清进行亲和纯化。

免疫印迹法。P1小鼠背部皮肤在50 mM Tris·HCl、pH 7.5/150 mM NaCl/1 mM EDTA/1%SDS/蛋白酶抑制剂中均质。提取物在7000×克在4°C下保持5分钟。通过SDS/PAGE解析上清液蛋白，并用亲和纯化的抗Fz6抗体进行检测。

X-Gal组织化学。在标准X-Gal染色溶液中，在37°C下对以下胚胎或组织进行X-Gal染色过夜(22)补充0.02%吐温20：(我)胚胎日龄（E）14.5个胚胎，在4°C的PBS、0.5%戊二醛中浸泡固定3h；(ii（ii）)E16.5胚胎或P1小鼠，新鲜冷冻，10μm冷冻切片，室温下在PBS、0.5%戊二醛中固定10分钟；和(三)取嵌合体小鼠背部后脚和头部皮肤，室温下用0.5%戊二醛PBS固定40分钟。在保留loxP侧翼的小鼠之间没有观察到X-Gal染色模式的差异PGK-neo公司或用cre重组酶从其上切下盒带。

免疫组织化学。在用X-Gal预处理的皮肤切片上进行免疫染色。试剂来自以下来源：抗小鼠角蛋白14多克隆抗体（Covance，Denver，PA）、生物素化山羊抗兔IgG（Vector Laboratories）和外源性过氧化酶结合物（Sigma）。

组织化学。苏木精/伊红染色采用标准方法进行。P3小鼠的后脚新鲜冷冻，10μm冷冻切片，室温下在PBS、4%PFA中固定10 min，并染色。

原位杂交。 现场杂交基本上按照描述进行(23)用未固定的冷冻切片组织和从小鼠Sonic hedgehog cDNA合成的反义和正链核糖探针。

结果

Fz6-nlacZ表达式模式。作为系统定义体内根据每个哺乳动物Fz基因的作用，我们构建了一个假定的空等位基因Fz6公司，其中的核定域衍生物大肠杆菌β-半乳糖苷酶（nLacZ）在Fz6公司发起人(图1A类和B类). 组织化学分析Fz6公司（+/-）和Fz6公司（-/-）动物显示nlacZ公司皮肤和血管系统的报告(图1C–G类和数据未显示）。在出生后的皮肤中，表皮和毛囊中有强表达。Fz6-nlacZ公司在发育中的皮肤中的表达在大约E11处检测到，在推测的毛囊前体中的表达首次在大约E13处检测到。在成熟的毛囊中，Fz6-nlacZ公司表达沿毛囊长度持续，但在黑色素细胞和毛乳头中低于检测极限。

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图1。

靶向突变Fz6公司基因和表达Fz6-nlacZ公司在皮肤和毛囊中。(A上部)的结构Fz6公司轨迹。黑色矩形代表七个外显子；在外显子2-7中，阴影区域代表Fz6公司编码区域。(左下方)目标向量。LNL、，PGK-neo公司loxP位点侧翼基因；单纯疱疹病毒胸苷激酶盒。(赖特)用特异性PCR引物对尾DNA进行基因分型新Fz6接合（KO）或内源性Fz6公司目标等位基因（Endo）中缺失的序列。(B类)用针对Fz6的C末端17 aa的亲和纯化抗体检测P1皮肤蛋白质的免疫印迹。≈85 kDa的带出现在Fz6公司（+/+）样本，但在Fz6公司（-/-）样本，推测为Fz6；在两个样品中都可以看到≈55 kDa的交叉反应带。蛋白质分子质量标准从上到下依次为100、90、80、70、60和50kDa。(C类)E14.5胚胎X-Gal染色。(左侧)Fz6公司(+/+). (赖特)Fz6公司(+/-). (D类和E类)X-Gal染色Fz6公司E16.5时的（-/-）皮肤；在里面E类类似的切片也进行了角蛋白-14（棕色）的免疫染色。X-Gal染色出现在周皮、表皮和毛囊中。(F类)侧面放大图像Fz6公司（+/-）胚胎C类显示X-Gal染色集中在发育中的毛囊中。(G公司)X-Gal染色Fz6公司≈P1时的（+/-）表皮。C–G类表现出强烈的表达Fz6-nlacZ公司报道表皮和毛囊的发育。Fz6公司（+/-）和Fz6公司（-/-）显示相同的X-Gal染色模式。

Fz6（-/-）小鼠的毛发模式。 Fz6公司（-/-）小鼠是活的和可繁殖的，并且看起来健康状况良好。然而，仔细检查发现，身体大部分表面的头发图案发生了明显的变化(图2). 在WT小鼠中，脚背面的毛发朝向手指，头部和背部背面的毛发则朝向尾部。>100中Fz6公司（-/-）到目前为止，对小鼠进行的检查表明，前脚的毛发方向正常，但每只后脚上都有一个毛发轮回，右脚顺时针，左脚逆时针(图2A–D). 在混合C57BL6×129背景上，≈30%Fz6公司（-/-）小鼠头部背面有严重异常的毛发图案(图2G–N（G–N）); 剩下的头发图案中有轻微的畸变Fz6公司（-/-）小鼠。这些图案包括由方向不同的毛发形成的螺纹（例如。，图2我和N个)以及由具有收敛方向的毛发形成的簇或脊（例如。，图2K和M（M）). 在相同的遗传背景下，背部的头发部分重新朝向中线Fz6公司（-/-）小鼠(图2O（运行）和P（P）). 胸部的头发在WT中排列成两个对称的轮匝（左顺时针，右逆时针），并可变地重新排列(图2秒和T型).图2T型显示了Fz6公司（-/-）鼠，胸部有一个单一且更集中的螺纹。然而，当头发仍然相对较短时，在大约P8–P11处可以最清楚地看到头发图案(图2A–D和G–R公司)，它们显然在年长的动物身上存在(图2S–V). 在Fz6公司与混合C57BL6×129背景相比，（-/-）表型在纯129背景上出现；特别是，在纯129背景下，背部和侧面的毛发与WT图案的偏差更大(图2问和R（右）)头部严重图形畸变的频率增加到≈80%。在相同的繁殖群体中，在>60个群体中没有观察到毛发图案异常Fz6公司（+/-）或Fz6公司迄今为止对（+/+）小鼠进行了检查，因此在接下来的描述中，我们将考虑Fz6公司（+/-）和Fz6公司（+/+）作为WT表型的等效代表。

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图2。

改变的发型Fz6公司（-/-）小鼠。(A–D)WT和Fz6公司（-/-）后脚大约在P11。(A类和C类)左脚。(B类和D类)右脚。(E类和F类)在大约P3时，对后脚背部表面的冷冻皮肤切片进行苏木精/伊红染色，结果表明Fz6公司（-/-）毛囊形态正常，但在异常图案区域（如图所示F类)，它们以发散方向排列。(G–N（G–N）)大约P9时，头部背面的头发显示出头发图案的异质性Fz6公司（-/-）小鼠。在每个图像的横向边缘处可以看到耳朵；罗斯特拉尔向上。(O–R（运行-恢复）)大约P8的背部毛发在WT中显示出从吻侧到尾侧的方向(O（运行）)，向中线均匀偏移Fz6公司（-/-）在混合C57BL6×129背景上(P（P）)，以及纯129背景下的可变偏差(问和R（右）)包括一个螺纹R（右）罗斯特拉尔向上。(秒和T型)颈部和胸部的发旋大约在P13。一对螺纹秒在WT小鼠中是不变的。在…之间Fz6公司（-/-）小鼠，模式是可变的。(单位和V（V）)头部背面的毛发大约在P13。在年长的老鼠中，头发越长，改变的头发模式就越不明显。

不寻常的发型Fz6公司（-/-）小鼠似乎不是由毛发密度的差异引起的，例如，在转基因小鼠的拥挤和定向错误的毛发中可以看到，这些转基因小鼠过度产生LEF-1或稳定的β-连环蛋白，并且受角蛋白-14发起人(24,25). 个体结构的光镜检查Fz6公司发育期和成年期的（-/-）毛囊表现出明显的正常形态，包括与皮肤表面成一定角度的生长(图2E类和F类)和极化表达音猬因子在头发矩阵中（未显示数据）。从它们在平底鞋上的外观来看，位于异常图案区域（例如，轮回中心）的毛囊并不符合相邻毛囊的平行排列，而这些毛囊几乎是WT外套所有区域的特征(图2E类和F类). 在Fz6公司（-/-）小鼠在P1时，耳蜗毛细胞在C57BL6×129和纯129背景下均显示出正常的静纤毛方向（数据未显示）。

Fz6公司(-/-)：Fz6（+/+）胚胎嵌合体。在果蝇属，遗传镶嵌分析表明法兹局部作用决定表皮极性。机翼上的图案缺陷在法兹（-/-）组织贴片和紧邻突变贴片的遗传WT细胞的小区域中(1,26). 这些实验的简单结构有助于解释果蝇属翼片，由上皮单层组成，每个细胞形成一个单极化的毛发。哺乳动物的毛发发育更为复杂，因为每个毛囊都由间充质细胞和上皮细胞之间的一系列相互作用决定，这两者都有助于形成成熟的毛囊(27). 来自迁移神经嵴细胞的黑色素细胞也存在于毛囊发育的早期，并成为毛囊的组成部分。为了确定Fz6在头发图案中的局部作用程度，并评估以下相对密度对头发图案的影响Fz6公司（-/-）和Fz6公司（+/+）上皮细胞，我们研究了由白化ICR聚集产生的嵌合体Fz6公司（+/+）和着色C57BL6×129Fz6公司（-/-）胚胎(图3A类). 这两个品系的不同色素沉着表型也允许对黑素细胞可能参与Fz6依赖性发纹的实验性测试。这种可能性是通过观察颅神经嵴细胞在发育中的头部的骨、软骨和软组织的形成中发挥中心作用而得到的(28).

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图3。

嵌合小鼠的产生。(A类)实验示意图(左侧)和控制(赖特)胚胎聚集协议。(B类和C类)未保存(B类)和X-Gal-染色(C类)白化病ICR头部的扁平皮肤Fz6公司（+/+）：着色C57BL6×129Fz6公司大约P10的（-/-）嵌合体小鼠显示了表皮细胞（X-Gal染色或未染色）和黑素细胞（着色或白化）的独立组织嵌合体模式。固定和X-Gal染色过程中会出现少量组织收缩。(D类)嵌合体小鼠腹部的X-Gal染色冰冻切片显示了特征性的异质性Fz6公司单个毛囊内的（-/-）表皮细胞（X-Gal-染色）。这张图片还显示了在单个毛囊的尺度上，表皮细胞和黑素细胞组织嵌合的独立模式。

在31只白化ICR小鼠中Fz6公司（+/+）：着色C57BL6×129Fz6公司根据毛发色素沉着和/或X-Gal染色，（-/-）胚胎聚集和在大约P10、30时检查明显为嵌合体。在这个实验中，色素沉着标记来自Fz6公司（-/-）胚胎和X-Gal染色标记Fz6公司（-/-）表皮和毛囊。对于每只动物，首先分析头部、背部和后脚的毛发方向和色素沉着，然后进行X-Gal染色。图4A–E显示了后脚的这种分析示例Fz6公司（-/-）表型是独特的，显示出最小的动物间变异。在单个小鼠中，被色素毛发占据的皮肤表面百分比和X-Gal染色的百分比之间存在大致的相关性，这两者都反映了Fz6公司（-/-）组织到嵌合体。然而，从黑素细胞和皮肤上皮细胞的不同胚胎起源来看，色素头发和X-Gal染色皮肤的模式和位置并不相关（图。三B类和C类和4B–E类).

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图4。

胚胎聚集嵌合体中的毛发图案大约在P10。从左到右，每一水平行显示一只嵌合体小鼠，其一只后脚的背表面，该脚皮肤的未染色扁平部分，未染色扁平部位的示意图，其中每个箭头指示局部毛发方向，以及X-Gal染色后的相同扁平部分。在头发方向图中，绿色和红色箭头分别表示白化头发和有色头发的近似贡献。(A–E)白化ICRFz6公司（+/+）：着色C57BL6×129Fz6公司（-/-）嵌合体自上而下增加了Fz6公司（-/-）组织。(F类)对照白化ICRFz6公司（+/+）：着色C57BL6×129Fz6公司（+/-）嵌合体显示WT和Fz6公司（+/-）组织，但呈现WT发型。平面支架左下方错位头发的小边界B类在平面支架的右下方F类是脚外侧边缘高度弯曲的皮肤变平后产生的伪影。

对嵌合体后脚的检查表明，毛发图案与正常情况不同(图4A类)受到轻微影响(图4B类)部分受到严重影响(图4C类)或最多(图4D类和E类)表面的。发纹缺陷的位置和严重程度与X-Gal染色上皮细胞的位置和数量（或密度）之间存在明显的相关性（例如。，图4B类和C类). 相比之下，图案缺陷和头发色素沉着之间几乎没有关联。例如，图4B类和C类显示脚上杂乱无章的发纹，没有色素沉着，以及图4E类在缺乏色素沉着的区域显示出最严重的表型，即全轮。相反，在几个有色素沉着区域的嵌合体足中，很少或没有X-Gal染色，毛发方向基本正常（数据未显示）。在对照实验中(图3A类)，11个由白化ICR聚集产生的嵌合体Fz6公司（+/+）胚胎和色素C57BL6×129Fz6公司（+/-）胚胎与WT毛型无偏差(图4F类)表明在Fz6公司(+/+):Fz6公司（-/-）嵌合体不是由ICR和C57BL6×129组织并列产生的。综上所述，这些数据表明Fz6在局部起作用，控制或传播宏观毛发模式，上皮细胞而非黑素细胞是Fz6依赖信号的来源。

与通常在遗传镶嵌中观察到的突变组织的邻接区相比果蝇属，皮肤的扁平支架Fz6公司(+/+):26层（-/-）嵌合体小鼠经常显示WT和突变上皮细胞的散布，并且在横截面上，经常观察到单个毛囊中同时含有这两种细胞Fz6公司（+/+）和Fz6公司（-/-）单元格(图3D类). 有趣的是，即使在含有大量突变组织的嵌合体中，毛发图案通常表现为局部不规则，而不是轮生(图4D类)，并且只有2/60的后脚可见完整的轮生(图4E类). 这些观察结果表明，即使是少量Fz6公司（+/+）细胞邻近或散布Fz6公司在大多数情况下，（-/-）细胞可以破坏轮生体的发育。令人感兴趣的是，嵌合体小鼠毛发模式的最大程度紊乱发生在以下区域Fz6公司（+/+）和Fz6公司（-/-）表皮细胞散布（例如。，图4D类)而均匀WT或突变的表皮具有高度的局部有序性。

讨论

本研究将Fz6确立为小鼠发纹通路的基本成分。The aberrant hair patterns inFz6公司（-/-）小鼠没有表现出完全的方向随机化，而是表现出局部排序，相邻毛发的方向显示出高度相关性。在许多动物的鬃毛和毛发中也可以看到局部秩序果蝇属组织极性突变，这种发生导致宏观模式类似于Fz6公司（-/-）小鼠(1,29). 在果蝇属目前的证据表明，这种局部顺序可能反映了在相邻细胞的近端和远端面之间传递极性信息的信号复合体的组装(30). 在小鼠中，相邻毛囊之间的距离很大，即使在发育早期，也表明可能存在更复杂的信号传播机制。

复杂的毛发图案在多种哺乳动物中普遍存在，包括豚鼠、草原犬、马、猪、牛、狗和人类(图5). 此外，在许多物种中，包括我们自己的物种，毛发图案的个体差异也有很好的记录(31,32). 西沃尔·赖特的经典研究(33)证明了豚鼠毛发模式变化的孟德尔性质，目前的证据表明遗传因素也可能与人类有关（例如。，图5C类和D类和参考文献。32和34). 目前的工作表明，这些模式的自然变异，无论是物种内部还是物种之间，都可能是由参与组织极性信号传递的基因的序列变异引起的，包括Fz6公司有趣的是，最近的一项研究(35)为惯用手和头皮上头发轮回的方向之间的联系提供了证据，这表明，为头发定型的同一系统也可能在大脑左右不对称性中发挥作用。

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图5。

哺乳动物的毛发模式。(A–D)人类的发旋。(A类)单枕骨轮生。(B类)前额轮生，前额毛发在前额的另一侧向上延伸。这个受试者的兄弟有相同的发型。(C类和D类)父亲的双枕轮(C类)和儿子(D类). (E类和F类)马的毛发图案。(E类)大多数马的眼睛之间只有一个轮回；牛身上也有类似的螺纹。(F类)后腿（左侧）和躯干（右侧）交界处侧面的毛发图案。(G公司和H（H）)豚鼠的毛发模式。身体表面的突出螺纹(G公司)被称为玫瑰花结。(我)在狗身上，复杂的毛发图案通常出现在上胸部；图中显示的是奇瓦瓦犬胸部对称的螺纹。(J型)美国草原犬，胸部上部有两个两侧对称的轮生体之一。G公司,H（H）、和J型转载自参考文献。36–38分别是。

致谢

笔记

缩写：Fz，Frizzled；X-Gal，5-溴-4-氯-3-吲哚β-d日-半乳糖苷；P（P）n个，出生后第天n个; E类n个，胚胎期n个; nLacZ，核定域衍生物大肠杆菌β-半乳糖苷酶。

请参阅第页的评论9173.

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