钾-氯协同转运蛋白KCC2磷酸化对神经元活性的调节

摘要

KCC2活性的调节是神经元Cl动态变化的基础⁻发育和疾病中的体内平衡和GABA能信号

成人中枢神经系统（CNS）中的快速突触抑制主要通过GABA介导_A类Rs和GlyRs，它们是配体门控的Cl⁻通道囊性纤维变性. [1]. 神经元内Cl的稳态⁻浓度[Cl⁻]_我，由Cl的动态功能调节建立⁻通道、转运体和交换器是GABA和甘氨酸功能的主要决定因素，并赋予GABA_A类Rs和GlyRs具有独特的功能可塑性[2,三](方框1). 尽管对GABA进行了许多调查_A类R调制作为抑制性突触强度的决定因素[4——7]，对氯的功能作用关注较少⁻运输监管。调节[Cl的分子机制⁻]_我GABA的动态变化_A类中枢神经系统发育、突触活动和神经疾病中的R和GlyR信号[8,9]才刚刚开始被理解。

神经元维持低[Cl的能力⁻]_我依赖于神经元特异性K–Cl协同转运蛋白KCC2，即主要的Cl⁻成年神经元中的挤压器[8,10]. KCC2，阳离子-氯共转运蛋白（CCC）的成员SLC12A型基因家族，利用能量有利的质膜K⁺挤压Cl的浓度梯度⁻超过电化学平衡值。因为未成熟中枢神经元的特点是KCC2的功能表达低于Na–K–2Cl协同转运子亚型NKCC1，后者介导Cl⁻吸收，[Cl⁻]_我保持高位，GABA_A类R激活导致这些细胞的去极化反应而不是超极化反应[8,11——13]. 这些去极化GABA_A类R介导的反应影响早期网络活动[14]以及神经元迁移所需的活动依赖性突触变化[15,16]和电路形成[17——19]. 在出生后的大脑发育过程中，KCC2功能表达的增加与GABA-和/或甘氨酸能信号从去极化到超极化的变化有关[8,10]. 事实上，如果没有KCC2，GABA能信号的抑制强度就会减弱，并可能导致膜兴奋性增加[20——22]. KCC2表达的遗传缺陷，如秀丽隐杆线虫[23]，黑腹果蝇[24,25]、和小家鼠[21,26——28]导致网络超兴奋性的发展。

在成熟的中枢神经系统中，去极化GABA_A类R介导的反应通常与兴奋性的病理增强有关[29]，尽管一些神经元群体通常表现出这些反应[30——33]即使没有活性诱导的细胞内Cl⁻负载[8,34]. KCC2介导的共转运缺陷，GABA能抑制作用减弱，出现去极化GABA_A类R介导电流[22,35]在某些类型的癫痫（如颞叶癫痫）中有记录[29,36——38]神经病理性疼痛（包括与周围炎症或神经损伤相关的痛觉过敏和超敏反应）[39——41]以及外伤性脑和脊髓损伤后[42——45].

（去）磷酸化是KCC2调节的一种有效但尚不清楚的机制，具有治疗意义

KCC2活动的变化导致GABA的变化_A类在发育和上述疾病状态中正常发生的R和GlyR介导的反应在很大程度上归因于KCC2 mRNA转录和/或翻译的时空控制差异（例如[46——49]). 尽管KCC2共转运功能在这些条件下经常发生改变，但仅KCC2 mRNA或总蛋白的表达水平似乎不太可能解释KCC2活性的快速变化。最近的工作表明，KCC2 mRNA翻译不是KCC2功能调节中的主要速率限制步骤，并且在以兴奋性增加为特征的病理生理状态下，KCC2的降解速度可能会增强[50,51]. 已知KCC2活性依赖性功能下调或上调的快速时间尺度（分钟到小时）[35,50,52,53]KCC2的快速功能调节可能由几个相互依赖的机制介导，通过多个细胞内第二信使系统实现转运体活性的急性调节，从而触发翻译后共价修饰。然而，这并不排除在转录水平上KCC2功能表达变化的长期巩固[37].

越来越多的证据表明，蛋白（去）磷酸化是KCC2-介导的氯离子的重要调节器⁻挤压[35,54——64]，通过对内吞作用、蛋白水解切割、降解和其他机制的影响，通过调节固有转运速度、转运蛋白对离子底物的亲和力和在质膜表面表达的功能性转运蛋白的数量，改变转运蛋白的功能[8,50,51,58,61]. 膜相关KCC2的半衰期异常快（HEK-293细胞约5分钟[58]). KCC2的这种快速（去）磷酸化控制的膜再循环可能能够对位于质膜和运输囊泡中的KCC2分子的相对量和内在功能特性进行动态翻译后调节。此外，这项工作经常被引用于海马（HC）切片中KCC2蛋白的快速质膜转换[65]表明在KCC2降解持续增加的条件下，质膜KCC2净减少，时间常数约为20分钟，囊性纤维变性[50]. 因此，翻译后调控对于快速确定KCC2的功能表达水平，进而决定神经元Cl的表达水平至关重要⁻生理和病理生理条件下的挤压能力。

在这里，我们回顾了说明KCC2的调节性丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化对其转运功能的重要性的最新数据(图1). KCC2磷酸化的调节变化可能对GABA介导的突触抑制的效果产生重大影响_A类Rs和GlyRs，与神经发育、网络兴奋性和神经疾病有关。更好地理解KCC2通过磷酸化进行功能调节的机制，可以选择性调节KCC2的活性，从而为操纵GABA能和甘氨酸信号提供一种新的方法，用于治疗神经疾病。

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图1

KCC2（神经元特异性K–Cl协同转运体）重要调节性磷的示意图。橙点表示转运蛋白细胞质C末端中对KCC2的功能调节至关重要的磷光体的位置，包括酪氨酸903（Y903）、苏氨酸906（T906）、丝氨酸940（S940）、苏氨酸1007（T1007）和酪氨酸1087（Y1087）。粉红色区域表示超极化GABA能量传输所需的KCC2“ISO”域[90].

KCC2丝氨酸940的蛋白激酶C依赖性磷酸化：鉴定及其对机体应激反应的影响

李等。[58]确定KCC2 C末端尾部丝氨酸940（S940）是蛋白激酶C（PKC）磷酸化的主要位点。体外激酶分析和放射性代谢标记实验证实PKC直接磷酸化S940，从而快速增强KCC2细胞表面稳定性并增加离子转运。利用S940磷酸特异性抗体进行的独立肽定位研究和分析证实，PKC依赖性磷酸化的主要位点是S940[35,58]. 将S940突变为一种非磷酸化丙氨酸（S940A）可以减缓KCC2的内化速度，并阻止PKC依赖性的K–Cl通量增加[58].

使用HC切片支持PKC依赖的KCC2功能调节的生理相关性。Gramicidin穿孔斑贴灯显示，I组代谢型谷氨酸受体（mGluR1s）的强直激活通过下游激活CA3锥体细胞中PKC依赖通路调节抑制性突触强度[66]. PKC的药理学激活被显示为模拟DHPG的作用，DHPG是一种特异的I组mGluR激动剂，导致E_GABA公司通过添加Ca而逆转²⁺-依赖性PKC抑制剂，Gö6976。总之，这些数据表明PKC介导的途径调节E_GABA公司I组mGluR下游。应用KCC2（和NKCC1）阻滞剂速尿导致E去极化偏移_GABA公司而mGluR1拮抗剂PHCCC没有额外作用[66]. 相反，用NKCC1抑制剂布美他尼治疗对E无影响_GABA公司表明E中mGluR依赖的超极化偏移_GABA公司是由于KCC2的功能表达[66]. 总之，这些数据表明，在基础条件下的CA3锥体细胞中，I组mGluRs调节KCC2功能和Cl⁻挤压，可以在几分钟内调节。

众所周知，调节身体对应激反应的下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴主要由促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）神经元的GABA能输入调节。萨尔卡等。证明成年小鼠急性应激后下丘脑室旁核（PVN）S940处KCC2的去磷酸化发生。这导致KCC2功能表达降低，并与GABA对CRH释放神经元的兴奋作用的出现以及随后HPA轴的激活有关[67]（另请参阅[68]). 这些发现表明，S940处KCC2的磷调节在控制身体激素应激反应中起作用。这可能成为与HPA轴超兴奋性相关疾病（例如库欣综合征和神经精神疾病，例如焦虑、抑郁症和创伤后应激障碍）的新治疗靶点，囊性纤维变性. [69,70]).

NMDA受体依赖性KCC2丝氨酸940去磷酸化对癫痫发作的影响

李等。使用分离的HC神经元证明，NMDA受体（NMDAR）激活的增加，通过升高环境谷氨酸盐的实验诱导，触发Ca²⁺-S940依赖性KCC2去磷酸化和下调KCC2的表面表达和功能。这两种事件都对蛋白磷酸酶1（PP1）抑制剂冈田酸敏感，冈田酸可防止谷氨酸暴露引起的超极化GABA能抑制的丧失[35]. 因此，S940依赖PKC的磷酸化增强[58]而PP1介导的S940去磷酸化似乎抑制KCC2[35]. 李等。提出KCC2功能受S940磷酸化状态的强烈影响，而S940的磷酸化状态又受PKC和PP1的相对活性控制[35] (图2). 考虑到在与KCC2功能表达减少相关的许多病理生理状态下，中枢神经系统中谷氨酸信号升高，这些结果是令人信服的[38]. 李等。[35]还强调了NMDAR拮抗剂对限制氯离子损伤的治疗潜力⁻神经元损伤急性期的稳态机制。在这种情况下，最近报道的钙离子对KCC2的C末端截断和功能失活的可能性不大²⁺-HC和脊髓神经元中观察到NMDAR持续激活引发的依赖性半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶[50,51]由KCC2磷酸化状态依赖机制调节(图2B). 例如，GlyR和GABA_A类R scaf-折叠蛋白凝胶蛋白[71]和典型钙蛋白酶底物谱蛋白[72]是以钙蛋白酶介导的裂解为靶点的底物磷酸化状态依赖性的显著例子。

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图2

丝氨酸940（去）磷酸化和KCC2功能。(A类)在控制条件下，KCC2的组成膜再循环部分取决于丝氨酸940（S940）的相对磷酸化状态，丝氨酸940S940被蛋白激酶C（PKC）磷酸化，被蛋白磷酸酶1（PP1）去磷酸化。S940的磷酸化限制了适配器蛋白2（AP2）介导的KCC2分子的内吞作用，从而导致稳定的膜定位KCC2群体。(B类)在特定的病理生理条件下（例如癫痫发作和神经性疼痛），长时间接触谷氨酸会导致NMDA受体活性（NMDAR）增加，从而触发Ca²⁺-依赖性级联有利于S940的PP1依赖性去磷酸化和KCC2的内吞，导致KCC2转运活性的功能性下调[35]. KCC2磷酸化状态的这种NMDAR依赖性变化可能调节KCC2的靶向性，以通过钙蛋白酶进行活性依赖性切割[50,51,71].

5-HT对KCC2的PKC依赖性激活_2安培受体信号：脊髓损伤相关痉挛的意义

最近一项对脊髓损伤小鼠模型的研究表明，PKC介导的KCC2调控，很可能涉及丝氨酸磷酸化的主要位点S940(囊性纤维变性. [35,58])可能与痉挛有关，痉挛是一种神经衰弱状态，通常出现在脑和脊髓外伤后的患者身上[73]. Bos公司等。[74]最近证明，延长2,5-二甲氧基-4-碘安非他明（DOI）的使用时间_2A/2B/2C型受体激动剂导致抑制性突触后电位（IPSP）逆转电位（E_IPSP公司)新生大鼠脊髓运动神经元的价值。值得注意的是，KCC2在早期脊髓中表达[75,76]. 重要的是，经历脊髓损伤（SCI）的幼鼠表现出明显更多的去极化E_IPSP公司与年龄匹配的对照大鼠相比，它们运动神经元的值。急性5-HT_2A/2B/2C型与DOI的受体拮抗导致E超极化偏移_IPSP公司在SCI动物中，DOI对这些动物的慢性治疗恢复了E_IPSP公司与未经治疗的非SCI大鼠的值相当。免疫组织化学分析显示，脊髓损伤大鼠腰骶运动神经元体脂细胞表面KCC2定位降低。DOI慢性治疗使KCC2表达恢复到对照动物的水平。使用特异性5-HT的组合_2A/2B/2C型激动剂和拮抗剂，作者得出结论，DOI效应是通过5-HT介导的_2安培受体[74].

进一步分析培养的运动神经元发现5-HT_2安培高亲和力激动剂TCB-2超极化E_IPSP公司并增加KCC2的质膜表达。最近发现的KCC2抑制剂VU0240551的应用[77]去极化E_格莱并阻断TCB-2的作用。然而，由于KCC2抑制化合物已被证明具有严重的非靶向作用，包括抑制几个G蛋白偶联受体和Ca²⁺通道[78,79]，应谨慎解释这些结果。应用Gö6976发现5HT下游的作用_2安培部分由钙介导²⁺-独立PKC亚型。在完整的脊髓准备中，TCB-2显著加速了单突触反应的速率依赖性抑制，并降低了多突触反应，而这被KCC2抑制所阻断。在截瘫痉挛性成年大鼠（SCI后）腹腔内注射TCB-2可降低高频刺激时的霍夫曼波振幅。这些数据令人信服地表明，痉挛性脊髓中抑制性传递受损是由于Cl的扰动所致⁻体内平衡和受损的KCC2功能表达，可以通过5-HT促进PKC依赖的KCC2磷酸化来修复_2安培受体激活。鉴于缺乏有效的药物治疗这种虚弱和常见的疾病，这一研究领域有望实现快速临床翻译。

总之，上述研究表明，S940处KCC2的PKC依赖性磷酸化对GABA强度的调节很重要_A类R和GlyR介导的突触抑制。S940磷酸化的降低可能是KCC2在与增强的网络兴奋性或增加的HPA轴激活相关的疾病状态下调节改变的基础，包括癫痫发作、局部缺血以及一般形式的脑和脊髓损伤。S940磷酸化如何引起KCC2活性变化的确切机制目前尚不清楚；也许磷酸化决定了协同转运位点对调节元件（如内吞机制）的可及性（或不可及性），或者诱导特定的结构配置，从而能够结合或释放其他调节蛋白，特别是激酶、磷酸酶和/或蛋白酶，如钙蛋白酶。

通过苏氨酸906和1007去磷酸化激活KCC2：对神经元发育的影响

卡勒等。首次证明了KCC2（和NKCC1）活性的强效激酶依赖性可逆切换在体外使用活性和显性阴性形式的WNK3，这是一种对细胞体积变化敏感的丝氨酸-苏氨酸激酶[57] (图3). WNK3在爪蟾卵母细胞增加氯离子⁻通过NKCC1流入，但抑制了Cl⁻在等张条件下通过KCC2流出，从而增加[Cl⁻]_我[57]. 相比之下，WNK3的一种激酶活性变体具有相反的作用，抑制NKCC1，并在PP1依赖性途径中强烈激活KCC2以降低[Cl]⁻]_我[55,57]. 然而，值得注意的是，在卵母细胞中观察到PP1抑制对KCC2的功能作用[55,57]与在培养的海马神经元中观察到的情况相反[35]. WNK3的作用是通过改变其靶点的磷酸化和表面表达来实现的，这表明WNK2可以调节细胞内Cl水平⁻通过对摄取和挤压途径的相反作用[80]. 莱因哈特等。被WNKs调节以改变转运蛋白活性的KCC中确定的残基[56]. 如HEK-293细胞所示，相关KCC3共转运体（T991和T1048）中的两个苏氨酸残基在低渗（细胞肿胀）条件下迅速去磷酸化，同时转运活性增加。KCC3中这些位点的丙氨酸替换导致了在通常对KCC3具有抑制作用的条件下强健、组成活性的K–Cl共转运[56]. 同源苏氨酸在所有人类KCC中都被保存和磷酸化，包括KCC2（T906和T1007）(图4). 有趣的是，KCC2上的这些残基在新生鼠大脑中被部分磷酸化，并在大脑成熟的同时被去磷酸化[56].

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图3

WNK3激酶相互调节NKCC1和KCC2活性。(A类)使用评估⁸⁶卢比⁺卵母细胞中的通量测量，NKCC1通常在低渗条件下（180 mOsm）活性最低，在等渗条件下部分活性（200 mOsm.）。在这两种情况下，活性WNK3最大限度地增加NKCC1活性。相反，激酶激活的WNK3强烈抑制NKCC1活性（*，P（P）<0.0001与NKCC1单独比较）。(B类)与NKCC1相比，KCC2在等渗条件下（如大脑中所见）部分活性，并在卵母细胞的低渗条件下诱导。在两种条件下，活性WNK3的表达均抑制KCC2。相比之下，激酶激活的WNK3（kin⁻)在低张和等张条件下强烈激活KCC2（*，P（P）<0.0001与KCC2单独）PHAII’表示对WNK3活性无影响的点突变。经许可，转载自[57].

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图4

苏氨酸906和1007去磷酸化激活KCC2。莱因哈特等。在K–Cl共转运体中确定了受细胞肿胀调节且依赖于HEK-293细胞中WNK1激酶活性的调节性磷酸三烯[56]. 在KCC2中，T906和T1007是关键的同源苏氨酸残基。两个残基的同时磷酸化抑制KCC2活性，并且在等渗条件下这些残基的去磷酸化激活KCC2。在新生鼠脑中，T906部分磷酸化，但在成年鼠脑中主要去磷酸化，同时激活KCC2[56]. (A类)自动射线图显示⁸⁶卢比⁺HEK-293细胞中的通量增加⁸⁶卢比⁺与转染空载体（EV）的对照组相比，野生型（WT）KCC2-转染细胞的通量以及⁸⁶卢比⁺转染KCC2 T906A/T1007A的细胞中相对于野生型KCC2的通量，其双丙氨酸突变模拟这些位点的去磷酸化。(B类)第个结果，共个⁸⁶卢比⁺对每个指定转染构建物进行通量分析。注意，野生型KCC2在等张条件下表现出低活性（由ISO结构域介导[90]，囊性纤维变性.至其他无等渗活性的KCC[104])而KCC2 T906A/T1007A在相同条件下相对于野生型KCC2表现出强大的活化[56]; (P（P）<0.0001). (C类)同源磷酸三烯在所有人类KCC中都是保守的和磷酸化的。所有人类KCC的C末端和NKCC1的N末端的同源区域[人类（h）、小鼠（m）和鲨鱼（s）]对齐。星号（*）表示所有SLC12A CCC，以红色突出显示保守的磷酸化运动（YXRT^P（P）). 值得注意的是，NKCC1（人类）中的T212是NKCC1激活所必需的，并且在WNK/SPAK（OSR1）激酶信号通路下游磷酸化[85,105——107]. 鉴于KCC2 T906与NKCC1 T212的同源性，WNK/SPAK激酶下游的一种双向磷酸化机制，同时刺激NKCC1和抑制KCC2（激活时促进苏氨酸磷酸化），但抑制NKCC1并刺激KCC2（被抑制时促进苏呤去磷酸化）可能对神经元Cl的动态调节很重要⁻体内平衡[56,57,62,80]. 经许可，转载自[56].

目前，残基T906/T1007处KCC2（去）磷酸化的功能意义尚不清楚；然而，我们认为它是GABA的一个重要决定因素_A类通过改变神经元发出信号⁻]_我在发育过程中，小鼠大脑中从第P0天到第P20天出现抑制性T906磷酸化的强烈下调[56]. 在这方面，有趣的是，内源性牛磺酸似乎通过触发WNK1的磷酸化（和活化[81]. 胚胎脑和新生儿脑中SPAK磷酸化也升高，并且对牛磺酸转运蛋白抑制敏感体内[81]. 重要的是，哺乳动物KCC2基因是N末端剪接的，产生两种神经元特异性亚型，即KCC2a和KCC2b，在HEK细胞中表达时具有类似的共转运特性[82]. KCC2b是主要的亚型，约占小鼠皮层KCC2总蛋白的90%[82,83]. KCC2a的N末端含有一个在KCC2b中不存在的Ste20型激酶SPAK/OSR1的结合基序，这表明两种KCC2亚型的磷酸调节的不同机制[82,83].

在人脑中，WNK激酶家族成员WNK1–4中，与KCC2表达相比，WNK3的mRNA在发育过程中受到双向调节(图5;囊性纤维变性. [84]). 这个引人注目的表达谱，加上已知的激酶依赖性KCC2活性抑制[57]表明较高水平的WNK3活性在一定程度上决定了KCC2 T906磷酸化抑制水平的升高以及发育早期KCC2功能表达的相关降低。目前尚不清楚WNK3（或其他WNK激酶）是否在T906/T1007直接磷酸化KCC2；WNK可能以类似于NKCC1上WNK/SPAK通路的调节方式调节其他激酶，如SPAK或OSR1，它们充当直接的KCC2磷酸化子[85]. 考虑到KCC2磷酸基序（包括T906）与NKCC1的关键N末端调控区（已知通过WNK/SPAK途径磷酸化）的同源性，我们提出在特定磷酸化位点存在相互磷酸化机制，WNK/SPAK下游，增加NKCC1活性并降低KCC2活性，从而有利于[Cl的积累⁻]. 考虑到他们的表达水平(图5)以及对CCC的已知影响在体外（例如[54])，其他WNK也可能通过CCC调节性磷酸化在中枢神经系统中发挥主要作用。事实上，WNK1和WNK2 mRNA在人类新皮质和HC的整个发育过程中持续表达，而WNK4的mRNA似乎在低水平表达(图5;囊性纤维变性[84]). 有趣的是，WNK1/HSN2亚型在HC和脊髓背角表达最高[86]，在孟德尔综合征中突变，表现为先天性对疼痛不敏感[87]. 未来工作中一个有趣的问题是WNK1/HSN2是否通过调节背角KCC2功能参与痛觉调节[88]. 考虑到WNK家族不同成员之间的物理和催化相互作用[89]冗余和补偿问题可能会使淘汰（KO）模型的分析复杂化。

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图5

WNK3号机组人类海马（HIP）和新皮质（NCX）中的转录表达是以与KCC2公司在WNK1-4中，尤其是WNK1和WNK3的mRNA水平在人脑中高水平表达。然而，WNK3 mRNA在KCC2强烈上调的阶段受到下调。数据采集和开发周期见[84]. 经许可，使用来自人脑转录组数据库的数据进行改编，如[84]可在以下位置访问http://hbatlas.org.

此外，研究T906/T1007磷酸化基序与KCC2 C末端ISO结构域之间的关系将是未来工作的一个有趣主题，KCC2 C端ISO结构域是等张条件下KCC2活性和GABA对成年神经元超极化抑制所必需的[90]. 有趣的是，当KCC2缺少ISO域时(方框2)，它仍然保持其膨胀激活的传输特性[90]这表明神经元中等渗和膨胀诱导的K–Cl共转运存在不同的分子决定因素。

神经元氯离子潜在操纵的一条令人兴奋的途径⁻梯度和GABA_A类或GlyR信号是通过靶向上游磷调节因子间接调节NKCC1和/或KCC2活性[80]. 正如所讨论的，NKCC1的刺激和KCC2的抑制都是通过位于转运蛋白N或C末端的同源基序的苏氨酸磷酸化介导的，这表明共同的级联以相互的方式调节NKCC1和KCC2。NKCC1和KCC2中这些位点的磷酸化依赖于WNK1激酶在体外表明抑制神经系统WNK亚型的激酶抑制剂是治疗干预的特别有吸引力的靶点。例如，抑制WNK3的激酶活性可能是降低神经元[Cl⁻]_我通过同时抑制NKCC1活性和通过关键调节残基转运蛋白磷酸化的变化促进KCC2活性[55,57].

然而，在解释这些初步发现时应谨慎，还需要进一步的实验证据。为了进一步研究这些假设，需要开发强有力的工具，如磷酸特异性抗体，以便能够识别癫痫、神经性疼痛和其他疾病状态的啮齿动物模型中这些残基的磷酸化状态变化。由于目前用于监测KCC2磷酸化的技术已经利用了全脑，因此在大脑和脊髓发育过程中，对这些残基在不同区域的磷酸化状态进行深入研究也是必要的[56].

KCC2酪氨酸1087磷酸化：对发育和神经元应激的影响

凯尔施等。首次提出酪氨酸磷酸化对KCC2的动态激活是神经元Cl增加所必需的⁻开发期间的挤压能力[91]（尽管请参见[92]). Stein后期作品等。表明在P3和P30之间，小鼠皮层中酪氨酸磷酸化KCC2的数量增加[76]. 有趣的是，淡水河谷等。观察到KCC2蛋白在耳蜗核的P1和P40神经元中均高表达（另见[93,94])而磷酸酪氨酸水平在出生时几乎不存在，在P40时显著升高[95].

抑制酪氨酸激酶活性可以改变KCC2的表面分布模式，从点状分布到弥散分布[60]. 类似地，酪氨酸激酶抑制已被证明可触发E_GABA公司KCC2酪氨酸磷酸化在几分钟内可逆。KCC2 Y1087D突变体表现出更为弥散的染色模式和更为去极化的E_GABA公司值[60]尽管尚不清楚这种突变是否会刺激该特定位点的磷酸化或去磷酸化增加。此外，酪氨酸磷酸酶活性的抑制增加了神经元中KCC2与脂筏的联系[60]. 这个结果虽然有争议，但很有意思，因为与膜筏的联系被认为可以灭活KCC2并激活NKCC1[96]. 总之，这些结果表明酪氨酸激酶活性对KCC2在膜中的聚集和相关的转运蛋白活性具有快速和可逆的影响。

唤醒等。检测细胞应激对培养HC神经元KCC2酪氨酸磷酸化的生化和功能影响[59]. 使用非特异性磷酸酪氨酸抗体，短时间（<2 h）暴露于h后，磷酸酪氨酸KCC2与总KCC2的比率显著降低₂O（运行）₂，脑源性神经营养因子（BDNF），或0-Mg²⁺条件。这些影响发生在KCC2总水平降低之前。H（H）₂O（运行）₂暴露也导致E的逐渐去极化偏移_GABA公司如使用革兰氏针穿孔贴片灯测量。虽然从这些实验中还不清楚哪个酪氨酸残基被磷酸化，但作者提出，神经元应激会导致KCC2的酪氨酸磷酸化丢失，这与KCC2的内化和转运体活性降低有关[59].

随后的实验表明，KCC2中酪氨酸磷酸化的主要位点是残基Y903和Y1087[61]. 尽管HEK-293细胞在基础条件下没有酪氨酸磷酸化，但暴露于酪氨酸磷酸酶抑制剂Na_三VO（旁白）₄30分钟内，磷酸化酪氨酸水平显著增加，其中近75%被Y903和Y1087同时突变为苯丙氨酸而消除，导致KCC2内化和降解，而KCC2被每个酪氨酸残基的联合非磷酸化氨基酸取代所阻断。有趣的是，神经元中毒蕈碱乙酰胆碱受体（mAChRs）的长期激活增强了这些位点的KCC2酪氨酸磷酸化，并促进了其降解[61]. 毒蕈碱受体激动剂毛果芸香碱的进一步研究表明，1小时癫痫持续状态（SE）促进KCC2酪氨酸磷酸化并随后降解KCC2[61]. 据我们所知，这是药物诱导SE后对成年动物KCC2表面表达进行分析的最早时间点(囊性纤维变性. [52])尽管其他几项研究也观察到SE诱导后KCC2水平在更长时间内下降，囊性纤维变性. [37,48,97]. 重要的是，整体酪氨酸磷酸酶抑制对Lee发现的KCC2生化特征的影响等。[61]与Wake的观察结果不一致等。[59]. 这种差异可能是由于在不同的研究中观察到的磷酸化基础水平不同所致。这种差异很大程度上可归因于特定的培养条件，众所周知，这些条件差异很大（另请参阅[92]).

结束语和未来方向

最近的证据表明，KCC2细胞质羧基末端的关键丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的快速可逆磷酸化和/或去磷酸化构成了一套强有力的动态机制来调节KCC2活性。PKC依赖性S940磷酸化通过减缓转运蛋白内吞增加KCC2活性和质膜积累。相比之下，T906和T1007的WNK激酶依赖性磷酸化似乎降低了KCC2介导的离子转运的固有速率，这些残基的去磷酸化是KCC2的重要激活剂。Y1087磷酸化通过增加转运蛋白的膜插入促进KCC2活性。Y903在KCC2调节中的作用目前尚不清楚，但有趣的是，该残基位于T906附近，增加了Y903酪氨酸激酶调节对邻近苏氨酸磷酸化产生影响的可能性，反之亦然。

从上述审查的数据中可以明显看出（另请参见表1)经典模型来源于非神经元K–Cl协同转运的研究（原始研究参见例如[98])其中，“磷酸化失活”和“去磷酸化激活”K–Cl协同转运，对KCC2的功能调节没有预测价值。相反，转运体（去）磷酸化的功能效应由所述残基的身份决定。

这些残基磷酸化状态的改变在神经发育过程中和不同神经疾病模型中都会发生不同的变化。正常情况下，这些磷酸化事件的作用可能不如KCC2活性的开/关开关，而更多地是作为调节剂，根据生理信号和扰动，使KCC2活性发生定量分级变化，从而匹配神经元Cl的波动⁻负荷或新陈代谢需求增加[34]. 直接或间接地选择性调节这些磷化物可代表治疗癫痫、神经病理性疼痛和痉挛的新治疗策略，这些疾病与KCC2的功能下调（或NKCC1的功能表达增强）有关，在某些情况下，已经显示出磷酸化的改变。

未来一个重要的方向是将磷酸化产生的功能调制与KCC2的3D结构变化联系起来，KCC2具有12个跨膜结构域(图1). 不幸的是，膜蛋白的结构研究很困难，到目前为止，还没有KCC2的高分辨率结构。在不久的将来，另一个主要关注领域将是其他KCC2相关蛋白的蛋白质组学分析，包括蛋白磷酸酶。此外，上游信号元件，包括激素、肽、膜受体、支架蛋白、激酶和磷酸酶，其传递信号以影响此处所述重要残基处KCC2（去）磷酸化的变化，基本上尚不清楚。了解触发磷酸化事件以引起KCC2功能变化的正常和病理线索可能是促进或阻止这些过程以获得治疗益处的重要步骤。

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