PGC-1α调节骨骼肌失神经诱导的有丝分裂

组织学和横截面积

如前所述，在趾长肌（EDL）和胫骨前肌（TA）的10μm横截面上进行细胞色素氧化酶（COX）和琥珀酸脱氢酶（SDH）染色[23]. 使用Image J软件（NIH，Bethesda，MD，USA）由一名盲法研究人员测定单个肌肉纤维的纤维横截面积（CSA）。纤维尺寸以微米平方表示。

COX活性

COX酶活性的测定如前所述[24]通过测定完全还原的细胞色素的最大氧化速率c（c），使用微孔板读取器（Bio-Tek Synergy HT，BioTek Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA）评估为550nm处的吸光度变化。

电子显微镜

如前所述，进行电子显微镜（EM）的组织准备[25]. 简单地说，WT和KO动物的EDL肌肉切片在3.0%戊二醛中固定1小时，然后在室温下在0.1%碳酸钠稀释的1%四氧化锇中固定1 h。肌肉切片脱水后包埋在Epon树脂中，切片成超薄（60nm）切片，并用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。电子显微照片是使用飞利浦EM201电子显微镜获得的（荷兰阿姆斯特丹飞利浦）。

基因表达分析

定量实时PCR检测mRNA表达水平。使用TRIzol试剂分离总RNA（Invitrogen，15596-026，Life Technologies，Grand Island，NY，USA）。根据制造商说明，使用Superscript III第一链合成试剂盒（Invitrogen，18080-044）将RNA反向转录成cDNA。用于基因表达分析的引物在附加文件中列出1：表S1和根据GenBank中可用的序列设计(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/enterz/query.fcgi). 使用SYBR®绿色化学（PerfeC）进行分析_T型a SYBR®Green Supermix，ROX，Quanta BioSeciences，95055-500；美国马里兰州盖瑟斯堡的Quanta BioSeciences Inc.）使用StepOnePlus™实时PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特城的Applied Biosystems Inc.）。Gapdh公司和Actb公司作为家政基因组合使用。

免疫印迹法

TA冷冻切片的蛋白质提取物[26]用SDS-PAGE分离分离的线粒体或核提取物，转移到硝化纤维素膜上，然后用5%脱脂牛奶或5%BSA溶液封闭硝化纤维素膜。将膜与适当浓度的一级抗体在4°C下孵育过夜（见附加文件1：抗体完整列表见表S2）。随后在室温下清洗膜并与合适的HRP结合二级抗体孵育1小时，并用增强的化学发光进行可视化。使用Image J Software（NIH，Bethesda，MD，USA）进行量化，并将数值标准化为适当的负荷控制。

单纤维免疫荧光

对分离的固定EDL纤维进行免疫荧光染色[27]并使用共焦显微镜成像。简单地说，将新鲜切除的EDL肌肉固定在两端，并在室温下用2%多聚甲醛在磷酸盐缓冲液中固定1小时。然后用PBS清洗肌肉，将其保存在4°C下50%的甘油中过夜，然后转移到−20°C并保存，直至再次使用。通过降低甘油浓度，肌肉逐渐过渡，然后在含有0.04%皂苷的水坑中机械地将单个纤维分开。将纤维安装在玻璃载玻片上，并用0.2%Triton X-100在10%山羊血清中的PBS封闭溶液中渗透。然后将纤维与适当的一级抗体在4°C下共同孵育过夜（附加文件1：表S2）在封闭溶液中稀释。用PBS清洗纤维，然后在室温下与合适的荧光二级抗体共同孵育2小时。随后用PBS洗涤纤维三次，并在第一次洗涤中加入浓度为0.5μg/ml的DAPI，以观察肌细胞核。使用DPX Mountant将玻璃盖玻片安装在载玻片上进行组织学检查（Fluka，44581；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）并密封。使用配备有×60物镜的奥林巴斯Fluoview共焦显微镜采集图像（日本东京新宿奥林巴斯公司）。

细胞分馏

如前所述，通过差速离心分离富集的线粒体和核细胞亚组分[24]. 简单地说，将肌肉切碎在冰上，使用特氟隆杵和研钵均质，并悬浮在线粒体隔离缓冲液（MIB；250 mM蔗糖，20 mM HEPES，10 mM KCl，1.5 mM MgCl）中₂1 mM EDTA，1 mM EGTA）添加蛋白酶（Complete，Roche，1169749801；Roche Diagnostics，Basel，Switzerland）和磷酸酶抑制剂鸡尾酒（鸡尾酒2和3，Sigma，P5726和P0044）。然后在1000℃下离心匀浆克在4°C下放置10分钟，使细胞核颗粒化，同时上清液中含有线粒体和细胞溶质部分。上清液部分在16000℃重新离心克在4°C下持续20分钟以使线粒体颗粒化。将线粒体颗粒洗涤两次，并在一倍稀释的MIB中重新悬浮。随后对线粒体进行3×3s的超声处理，以获得丰富的线粒体部分。将含有细胞核的颗粒重新悬浮在核溶解缓冲液中（1.5 mM MgCl₂，0.2 mM EDTA，20 mM HEPES，0.5 M NaCl，20%甘油，1%Triton-X-100），在冰上培养30分钟，然后超声3×10 s，最后在16000下离心15分钟克.收集上清液以获得浓缩的核部分。使用Bradford方法测定样品中的蛋白质浓度。通过western blot分析测定组分纯度（附加文件1：图S3）。

缺乏PGC-1α的小鼠自噬信号减弱，溶酶体丰度降低，失神经诱导的自噬流量降低

接下来，我们开始评估协同激活物在关键自噬基因转录调控和自噬信号传导中的作用，包括基础和失神经反应。失神经导致参与自噬和有丝分裂多种方面的各种基因表达增加。显著增加公园2,平方米1,地图3b,附件7,灯2、和中央电视台失神经反应中的mRNA表达（图2A） 观察到。我们没有发现WT和KO动物之间自噬因子的mRNA表达有显著差异，除了去神经支配减弱引起的附件7。我们还使用western blot分析评估了自噬信号。根据我们的mRNA数据，我们发现在失神经反应中自噬蛋白显著增加（图2B） ●●●●。Beclin1、Atg7、组织蛋白酶D和溶酶体相关膜蛋白2（Lamp-2）均增加，而在WT动物中parkin趋于增加（图2B、 C、D、E、F、G）。虽然WT和KO动物的自噬蛋白含量基本上没有显著差异，但失神经诱导的KO肌肉中Beclin1和Lamp-2水平的增加显著减弱，而KO动物中组织蛋白酶D的诱导趋于降低。

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图2

缺乏PGC-1α导致失神经诱导的自噬信号减弱。（A）实时PCR检测自噬基因表达。野生型（WT）和PGC-1αKO（KO）对照（Con）和失神经（Den）之间的mRNA折叠变化。将所有组与WT Con进行比较Gapdh公司和Actb公司被用作家政基因。（B-G）对照组（C；Con）、失神经组（D；Den）WT和KO动物自噬蛋白的印迹和定量。（B）代表性斑点。量化（C）停车场，（D）贝克林1，（E）附件7，（F）组织蛋白酶D和（G）灯-2*P（P）Con和Den之间的显著差异<0.05。GAPDH被用作加载控制(n个=所有组为4至8）。AU，任意单位；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。

为了确定PGC-1α对自噬通量的影响，我们用微管去稳定药物秋水仙碱治疗动物，此前报道秋水仙素可以有效阻止自噬降解[22]（图三). 失神经导致WT肌肉中LC3B-II、p62和Nix（Bnip3l）蛋白的积累增加。秋水仙碱治疗导致失神经WT肌肉中LC3B-II和p62进一步积聚，表明药物成功阻止了自噬降解（图三A、 B、C）。相比之下，PGC-1αKO动物在基础和失神经反应中均表现出LC3B-脂蛋白的减少和丝裂原特异性受体Nix的表达（图三A、 B、D）。基因型之间p62表达基本上没有观察到显著差异，并且在接受Den或Col治疗的KO动物中p62水平没有变化（图三C） ●●●●。重要的是，KO动物的基础和失神经诱导的p62和LC3B-II流量均较低，这可以通过秋水仙素治疗的KO动物中LC3BII和p62的少量积累来证明（图三E、 F）。我们使用共焦显微镜进一步检测了KO和WT动物的溶酶体丰度和自噬通量（图三G） ●●●●。我们通过从固定EDL肌肉中分离单个纤维并对其进行LC3B和Lamp-2联合免疫染色来实现这一目的。KO动物溶酶体丰度较低，红色荧光的强度和频率降低，这在失神经后尤为明显（图三G和附加文件1：图S2）。我们还注意到自噬体和溶酶体的共定位（黄色）增加，以及它们在失神经WT肌核周区的聚集（图三G、 合并）。这在失神经的KO肌肉中并没有得到证实，因为黄色荧光减弱。综上所述，这些结果表明，PGC-1α的缺乏导致溶酶体丰度降低，并减少对失神经反应的自噬通量。

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图3

缺乏PGC-1α导致溶酶体丰度降低和失神经诱导的自噬通量。（A-C）对照（Con）、去神经（Den）WT和PGC-1αKO（KO）动物自噬蛋白的印迹和定量；用溶媒（水）或0.4mg/kg/天秋水仙碱（col）处理4天。（A）代表性斑点。量化（B）LC3BII和（C）第62页，（D）Nix的代表性印迹和定量，（E）基础自噬通量，以及（F）失神经诱导的自噬通量，（G）LC3（绿色）和溶酶体Lamp-2（红色）免疫染色和共定位的固定单纤维的共聚焦图像显示为黄色（Merge），代表溶酶体内的自噬体。细胞核为蓝色（DAPI）*P（P）<0.05 Con和Den.之间的显著差异†P（P）<0.05基因型显著影响。GAPDH被用作加载控制(n个=所有组为3至5）。AU，任意单位；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；KO，击倒；WT，野生型。

PGC-1α缺乏的肌肉中的线粒体功能减弱

由于PGC-1α是一种在线粒体内稳态中起关键作用的主要代谢调节因子，我们有兴趣阐明这种共激活物在线粒体吞噬去除中的作用。在去神经支配期间，骨骼肌内的线粒体池会大幅减少（33%至42%，图1B） ●●●●。为了确定PGC-1α在有丝分裂中的参与程度，我们从用载体或秋水仙碱治疗的WT和KO动物的失神经和控制腓肠肌中分离线粒体（图4). 失神经导致LC3BII、p62和parkin在线粒体中的定位增加，以及线粒体底物的整体泛素化升高（图4A、 B、C、D、E），最终导致有丝分裂通量增加（图4H） 。这些发现表明，有丝分裂参与了肌肉基底部和失神经期间线粒体的去除。KO动物的这种反应减少（图4G、 H、I）。KO动物的肌肉显示出与线粒体相似的自噬蛋白的基础定位（图4A、 B、C、D、E、F），但失神经后这些蛋白质的线粒体定位增加减弱。重要的是，KO动物表现出较低的基础和失神经诱导的有丝分裂流量（图4G、 H）。为了进一步研究有丝分裂流，我们用线粒体细胞色素c（Cyto c；绿色）和Lamp-2（红色）对分离的单个EDL纤维进行共染色，并用共焦显微镜评估它们的共定位（Merge；黄色）（图4一） ●●●●。图像表明，与WT动物相比，失神经KO动物的线粒体与溶酶体的共定位减少，进一步支持了失神经后KO动物线粒体吞噬通量的减少。

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图4

PGC-1α的缺乏导致线粒体自噬流量减弱。（A-D）对照组（Con）、失神经组（Den）WT和PGC-1αKO（KO）动物用0.4mg/kg/天载体（水）或秋水仙碱（col）处理4天后，分离线粒体部分中自噬蛋白的印迹和定量。（A）代表性斑点。量化（B）LC3BII和（C）第62页。（D）代表性斑点。线粒体定量（E）泛素，（F）停车场，（G）基础有丝分裂通量，以及（H）失神经诱导的有丝分裂流量。（一）对细胞色素c（作为线粒体标记，绿色）和溶酶体Lamp-2（红色）进行免疫染色的固定单纤维的共焦图像；它们的共定位（黄色）代表溶酶体内的线粒体*P（P）<0.05 Con和Den.之间的显著差异†P（P）<0.05基因型显著影响。VDAC用作加载控制(n个=所有组为3至5）。AU，任意单位；KO，击倒；VDAC，电压依赖性阴离子通道；WT，野生型。

TFEB蛋白水平由失神经诱导，可能介导PGC-1α对自噬的作用

为了研究PGC-1α在自噬基因表达中的作用，我们检测了TFEB，即自噬溶酶体系统的主要转录调节因子，因为最近的几项研究表明这两个因子之间存在相互作用[16,17,28,29]. WT动物的TFEB蛋白水平随着失神经而增加（图5A、 B，C），这往往会影响细胞核中TFEB的水平。在KO动物中，TFEB水平和核定位在基础条件下较低(P（P） < 0.05），并且在失神经后没有变化（图5A、 B、C）。

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图5

缺乏PGC-1α导致TFEB蛋白水平降低和核定位。（A-C）野生型（WT）和PGC-1αKO（KO）对照（Con）和去神经化（Den）之间的印迹和定量TFEB蛋白水平。（A）代表性斑点。量化（B）全肌肉TFEB蛋白。（C）TFEB在TA肌肉中的核定位*P（P）<0.05 Con和Den.之间的显著差异†P（P）<0.05基因型显著影响。用GAPDH作为整个肌肉的负荷控制，用组蛋白2B（H2B）作为核负荷控制(n个=所有组为4至8）。GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；编号。H2B，核组蛋白2B；编号。TFEB，核转录因子EB；TFEB，核转录因子EB。

PGC-1α的过度表达导致线粒体含量增加，并对去神经诱导的线粒体丢失和肌肉萎缩具有保护作用

由于我们的结果表明PGC-1α在调节失神经反应中的自噬流量方面具有潜在作用，因此我们研究了PGC-1β单独是否足以诱导自噬。因此，我们将WT与肌肉特异性PGC-1α过度表达动物（Tg）进行了比较。Tg动物的TA肌肉表现出更多的氧化表型（图6C、 D），它们受到保护，免受失神经诱导的肌肉萎缩（图6A） ●●●●。我们通过PGC-1α免疫印迹法证实了PGC-1在Tg动物中的过度表达（图6B） 和COXIV（图6C） ，一个协同激活物的下游靶点，以及SDH的组织化学染色（图6D） ●●●●。Tg动物的TA肌肉中线粒体明显丰富，表现出失神经后线粒体含量减少，如COXIV蛋白增加所示（图6C） 和较深的SDH染色（图6D） 与WT控件相比。

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图6

过表达PGC-1α的动物具有较高的线粒体含量，可以防止失神经诱导的肌肉萎缩。（A）TA肌肉质量经体重校正。（B）PGC-1α印迹证实TA肌肉过度表达。（C）COXIV作为线粒体含量标记物的代表性印迹和量化。（D）Con、Den WT和Tg动物TA肌肉SDH染色的代表性图像*P（P）<0.05，失神经效果显著。†P（P）<0.05，基因型影响显著(n个=所有组为3至5）。控制；Den，失神经；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；PGC-1α，过氧化物酶体增殖物协同激活物1α；TA，胫骨前；Tg，转基因；WT，野生型。

PGC-1α过度表达增加溶酶体和有丝分裂受体的表达

我们检测了PGC-1α过表达对自噬基因和蛋白质水平的影响，这些基因和蛋白质在基础上以及对去神经支配的反应。实时PCR分析证实，失神经7天导致各种自噬和有丝分裂基因的表达增加，如公园2,平方米1,地图3b,附件7、和中央电视台（图7A） 与我们早期的结果一致（图2A） ●●●●。我们发现减少了(P（P） < 0.05）的基础表达平方米1,Bnip3l公司、和附件7在Tg动物中。此外，我们还观察到失神经减弱诱导的平方米1,地图3b、和附件7。我们还通过western blot分析评估了自噬信号。WT和Tg动物的Parkin、Beclin1和Atg7蛋白水平在基础和失神经反应方面相似（图7B、 C、D、E）。然而，与WT动物相比，Tg中溶酶体蛋白Cathepsin D和Lamp-2的水平显著高于WT动物，并且在失神经的Tg肌肉中显著增加（图7F、 G）。与WT对照组相比，Tg组动物的LC3I和II水平也显著升高，与WT组动物相比，失神经后LC3I水平和II水平更高（图8A、 B、C）。同样，与WT动物相比，Tg中的Nix蛋白含量在基础和失神经反应方面都较高（图8D） 而两种基因型的p62水平相似（图8E） ●●●●。综上所述，这些数据表明PGC-1α选择性诱导特异性自噬和溶酶体蛋白的表达。

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图7

PGC-1α的过度表达导致失神经诱导的溶酶体蛋白表达增强。（A）自噬基因表达。野生型（WT）和PGC-1αTg（Tg）对照（Con）和失神经（Den）之间的mRNA折叠变化。将所有组与WT con进行比较，Gapdh公司和Actb公司被用作家政基因。（B-G）Con、Den WT和Tg动物自噬蛋白的印迹和定量。（B）代表性斑点。量化（C）帕金，（D）贝克林1，（E）附件7，（F）组织蛋白酶D，以及（G）灯-2*P（P）<0.05 Con和Den.之间的显著差异†P（P）<0.05，基因型效应显著。GAPDH被用作加载控制(n个=所有组为3至5）。AU，任意单位；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。

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图8

PGC-1α升高导致基础和失神经诱导的自噬蛋白表达增加。（A-E）对照（Con）、去神经（Den）WT和PGC-1αTg（Tg）动物自噬蛋白的印迹和定量。（A）代表性斑点。量化（B）LC3BI，（C）LC3BII、，（D）镍，以及（E）第62页*P（P）<0.05 Con和Den.之间的显著差异†P（P）<0.05基因型显著影响。GAPDH被用作加载控制(n个=所有组为3至5）。AU，任意单位；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。

PGC-1α过度表达导致线粒体亚组分自噬标记物减少

由于我们发现失神经后PGC-1α过度表达对线粒体的保护作用（图6)，我们想研究是否影响了细胞分裂。我们的结果表明，PGC-1α过度表达导致LC3BII和p62在Tg肌线粒体部分的定位降低，无论是在基础上还是在失神经反应中（图9A、 B、C）。

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图9

PGC-1αTg动物在分离的线粒体中表现出较低的自噬标记。（A-C）对照组（Con）、失神经组（Den）WT和PGC-1αTg（Tg）分离线粒体上自噬蛋白的印迹和定量。（A）代表性斑点。量化（B）LC3BII和（C）第62页†P（P）<0.05基因型显著影响。VDAC用作加载控制(n个=所有组为3）。AU，任意单位；VDAC，电压依赖性阴离子通道。

这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）对D.A.Hood的资助。D.A.Hood还是加拿大细胞生理学研究主席。A.Vainshtein是NSERC-加拿大研究生奖学金和迈克尔·史密斯外国研究补遗的获得者。E.M Desjardins是NSERC本科生研究奖的获得者。