ER和HER2之间的交叉对话调节芳香化酶抑制剂耐药乳腺癌细胞中c-MYC介导的谷氨酰胺代谢

2.2. 抗体和试剂

抗人MYC（#5605）、p-MAPK（#9101）、MAPK（#9102）、p-AKT（Ser473）（#9271）、AKT（#9272）、p-ER（Ser167）（#5587）、GAPDH（#2118）抗体均来自细胞信号技术。抗人HER2（#06-562）和p-ERα（Ser118）（ab32396）抗体来自Abcam Inc.。抗人ERα（HC-20）抗体（sc-543）来自Santa Cruz Biotechnology。ER拮抗剂fulvestrant（#14409）和SLC1A5抑制剂L-谷氨酸γ-（对硝基苯胺）（GPNA）（G6133）均来自Sigma-Aldrich。谷氨酰胺酶抑制剂化合物968（#352010）来自EMD Millipore。AKT抑制剂MK-2206（S1078）来自Selleck Chemicals。非靶向对照siRNA（sc-37007）和MYC siRNA（sc-29226）来自圣克鲁斯生物技术公司。HER2 siRNA（L-003126-00）来自Dharmacon。p44/42 MAPK siRNA（#6560）来自细胞信号技术。

2.3. 实时PCR

使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA，并使用纳米滴分光光度计进行定量。用SuperScript VILO cDNA合成试剂盒（Invitrogen）从2.5μg总RNA进行反转录。用iQ5多色实时PCR检测系统（Bio-Rad）进行实时PCR。人类MYC公司使用正向引物5′-GGCTCTGGCAAAAGGTCA-3′和反向引物5’-CTGGCGTAGGTGCTGATGT-3′（PrimerBank ID 239582723c1）扩增基因[25]. 人类SLC1A5型使用正向引物5′-GAGCTTGCTTATCCCTTTC-3′和反向引物5’-GGGGCGTACACATATC-3′（PrimerBank ID 223468565c1）扩增基因[25]. 人类GLS公司使用正向引物5′-AGGTCTGTACCTAGCTGTGG-3′和反向引物5’-ACGTTGCAATCGTAGATTT-3′（PrimerBank ID 373251163c1）扩增基因[25]. 这个ACTB公司用正向引物5′-CACACACTGAGACAT-3′和反向引物5’-GCACAGCTCTGGAGACAC-3′扩增β-actin基因。使用PerfeCTa SYBR Green SuperMix（Quanta Biosciences）建立实时PCR。用β-肌动蛋白作为内部对照对PCR结果进行标准化，然后与参考样品相比以相对表达的形式表达。每个实验一式三份进行。数据表示为平均值±SE。

2.4. 转染

根据制造商的方案，使用siPORT NeoFX转染剂（Ambion）对MCF7aro和LTEDaro进行对照siRNA或siRNA对MYC、HER2或MAPK的转染。对于免疫印迹，在60-mm培养皿中进行转染。对于MTT分析，使用96个平板。简单地说，细胞被胰蛋白酶化并在培养基中稀释为1×10⁵分别在OPTI-MEM I培养基（Invitrogen）中稀释cells/ml.siPORT NeoFX转染剂和siRNA。混合并培养10分钟后，将siRNA和转染剂的混合物分散到培养板或培养皿中。细胞悬液（1×10⁵细胞/ml）覆盖在转染复合物上。siRNA的最终浓度为30 nM。

2.5. 蛋白质印迹

如前所述进行蛋白质印迹[26]. 简而言之，细胞在冰上的RIPA缓冲液（细胞信号）中溶解5 min，然后超声60 s。蛋白质浓度由蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad）测定，样品由10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离。用一级抗体检测后，用辣根过氧化物酶偶联二级抗体孵育膜。最后；信号强度通过SuperSignal West Pico化学发光（Thermo Scientific）基底可视化测定。蛋白质的相对表达按照内部对照GAPDH标准化。

2.6. 细胞增殖试验

细胞增殖通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）分析测定。在指定的时间，从细胞中取出96个平板的每个孔中的培养基，并用含有0.5 mg/mL MTT的0.1 mL新鲜无酚红培养基替换，然后在37°C下培养细胞1小时。丢弃培养基后，将捕获在活细胞中的formazan染料溶解在0.1 mL二甲基亚砜中，并使用SpectraMax M5平板读取器（分子器件）在570 nm处测量吸光度。每个实验至少使用五个重复进行。数据表示为平均值±SE。

2.7. 谷氨酰胺和氨的测量

使用BioProfile 100 Plus分析仪（Nova Biomedical）测量谷氨酰胺和氨浓度。简单地说，将细胞接种过夜，并按照充满培养基中的指示进行处理。对照组用相同体积的无细胞培养基培养，培养方式与含细胞培养板相同。立即收集培养基样品进行分析，或在−20°C下储存，直至进行分析。对每个样品测定谷氨酰胺和氨的浓度（以毫摩尔/升为单位测量）。通过从培养基对照浓度中减去样品浓度来计算谷氨酰胺消耗量。通过从样品浓度中减去培养基对照浓度来计算氨产量。数据表示为平均值±SE。

2.8. RNA测序和数据分析

将LTEDaro细胞接种过夜，然后在含有10%木炭/右旋糖酐处理的不含谷氨酰胺的FBS、2mM L-谷氨酰胺或2mM L-谷酰胺+100nM fulvestrant的无酚无红DMEM培养基中培养24小时。每个治疗组一式三份。使用TRIzol试剂（Invitrogen）从细胞中提取总RNA。按照制造商的协议，使用Illumina HiSeq 2000系统在我们的综合基因组核心中制备转录组文库、选择大小、凝胶纯化并测序（Illuminia Inc.）。

使用TopHat将读数与人类基因组（构建hg19）对齐[27]. RPKM（每千字节读取数/百万映射读取数[28])为RefSeq计算[29]在Partek®Genomics SuiteTM（6.6版，Partek，Inc.，St.Louis，MO）中使用期望最大化算法的基因，该算法基于Xing等人的方法[30]. 在添加0.1的比例因子后，通过log2变换进一步规范化RPKM值[31]. 根据最小二乘平均值在线性尺度上计算折变值，使用归一化RPKM值计算单因素方差分析（ANOVA），使用Benjamini和Hochberg方法计算错误发现率（FDR）值[32]. 如果基因的fold-change|值大于1.5且FDR<0.05，则将其定义为差异表达。

3.2. ER和HER2对AI耐药乳腺癌细胞MYC的上调

ER和HER2信号通路之间的相互作用与内分泌治疗抵抗有关[三-5]. 我们发现MYC在AI耐药乳腺癌细胞中上调，并且MYC上调与LTEDaro细胞中ERα和HER2的表达水平相关(图2A)。在同一组实验中，与MCF7aro细胞相比，LTEDaro细胞中MAPK和AKT的磷酸化显著增加(图2A)证实HER2信号在AI耐药乳腺癌细胞中上调，与MYC表达增加有关。

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图2

ER和HER2在AI耐药乳腺癌细胞中上调c-MYC的交叉实验

A.对正常培养基中培养的MCF7aro和LTEDaro细胞中c-MYC、ER和HER2的表达以及MAPK和AKT的磷酸化进行Western blotting分析。c-MYC、p-MAPK、MAPK的定量标准化为负荷控制GAPDH，并计算与MCF7aro细胞表达相关的数值。

转染非靶向对照（Ctrl）siRNA或靶向HER2的siRNA 72小时后，LTEDaro细胞全细胞裂解物中的B.c-MYC蛋白水平。c-MYC、p-MAPK、MAPK的定量标准化为GAPDH，并计算与对照siRNA处理的LTEDaro细胞的表达相关的数值。

转染非靶向对照（Ctrl）siRNA或靶向MAPK的siRNA 72小时后，LTEDaro细胞全细胞裂解物中的C-MYC蛋白水平。C-MYC、p-MAPK和MAPK的定量标准化为GAPDH，并计算与对照siRNA处理的LTEDaro细胞的表达相关的值。

用二甲基亚砜或AKT抑制剂MK-2206（1μM）处理24小时的LTEDaro细胞全细胞裂解物中的D.c-MYC蛋白水平。c-MYC的定量标准化为GAPDH，并计算与用二甲基亚砜处理的LTEDaro细胞的表达相关的值。

为了测试HER2信号是否有助于MYC的上调，我们确定了siRNA减少HER2表达是否会降低MYC表达。我们发现HER2的敲除显著降低了LTEDaro细胞中MYC的表达(图2B)，支持HER2上调AI抗性乳腺癌细胞中的MYC。

HER2激活的两条主要细胞内途径是RAS-MAPK和PI3K-AKT途径[34]. 为了测试哪种途径负责上调MYC，我们用抗MAPK的siRNA和AKT抑制剂（MK-2206）处理LTEDaro细胞。我们发现MAPK siRNA处理显著降低了MYC的表达以及ERα（Ser118）和总ERα的磷酸化(图2C)。相反，尽管AKT（Ser473）和ERα（Ser167）的磷酸化降低，AKT抑制剂（MK-2206）并没有降低MYC的表达(图2D)。这些发现表明HER2通过MAPK和ER的组成型激活来调节MYC的表达。

3.3. 谷氨酰胺的摄入与雌激素无关，但需要AI耐药乳腺癌细胞的ER

致癌转录因子MYC在乳腺癌内分泌抵抗中起作用[15,16]与人类癌症中的谷氨酰胺代谢有关[22,23]. 因为谷氨酰胺是氮的来源，也是为增殖细胞中TCA循环生物合成提供代谢物的关键来源[19]，我们测定了MCF7aro或LTEDaro细胞在有无睾酮的情况下对谷氨酰胺和葡萄糖缺乏的细胞生长反应。两种细胞系的生长均受到谷氨酰胺的刺激，但葡萄糖的刺激程度适中(图3A)表明谷氨酰胺成瘾存在于AI敏感和耐药乳腺癌细胞中。然而，在缺乏睾酮的情况下，MCF7aro细胞的生长完全减弱，而LTEDaro细胞则不受影响(图3A)表明AI耐药乳腺癌细胞中雌激素依赖性谷氨酰胺代谢。

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图3

谷氨酰胺的消耗不依赖于雌激素，但在AI抗性乳腺癌细胞中需要ER

A.MCF7aro细胞（激素去除72小时）在有或无睾酮的情况下对谷氨酰胺或葡萄糖缺乏的细胞生长反应。在第6天测量MTT。数据为平均值±SE（n=6）。

B.在存在或不存在睾酮的情况下，LTEDaro细胞对谷氨酰胺或葡萄糖缺乏的细胞生长反应。在第6天测量MTT。数据为平均值±SE（n=6）。

C.用二甲基亚砜、睾酮（1nM）、睾丸酮（1nM）加来曲唑（200nM）或睾酮（1 nM）加富尔维斯特（100nM）处理的MCF7aro细胞（激素去除72小时）的细胞生长、谷氨酰胺消耗和氨生成。在第3天测量细胞数量、谷氨酰胺和氨浓度。通过从培养基对照浓度中减去样品浓度来计算谷氨酰胺消耗量。通过从样品浓度中减去培养基对照浓度来计算氨产量。数据为平均值±SE。

D.用二甲基亚砜、睾酮（1nM）、睾酮和来曲唑（200nM）或睾酮和富尔维斯特（100nM）处理的LTEDaro细胞的细胞生长、谷氨酰胺消耗和氨生成。在第3天测量细胞数量、谷氨酰胺和氨浓度。通过从培养基对照浓度中减去样品浓度来计算谷氨酰胺消耗量。通过从样品浓度中减去培养基对照浓度来计算氨产量。数据为平均值±SE。

已发现雌激素刺激可增加MCF7乳腺癌细胞中谷氨酰胺的消耗[21].为了测试雌激素对乳腺癌细胞谷氨酰胺代谢的作用，我们测定了睾酮、来曲唑和富尔维斯特对MCF7aro和LTEDaro细胞谷氨酰胺消耗和氨生成的影响。治疗72小时后，我们测量了细胞数量、谷氨酰胺和氨浓度。我们发现，睾酮显著促进MCF7aro细胞生长并增加谷氨酰胺消耗，而来曲唑和富尔维斯特均阻断了睾酮治疗的效果(图3B)表明雌激素通过雌激素受体刺激AI敏感性乳腺癌细胞中谷氨酰胺的消耗。谷氨酰胺是细胞中产生氨的主要氮供体[35]. 与谷氨酰胺消耗量的变化一致，睾酮治疗后氨水平升高，而来曲唑阻断了MCF7aro细胞中氨的生成(图3B)。相反，睾酮和来曲唑对LTEDaro细胞的生长、谷氨酰胺的消耗或氨的产生没有影响，而富尔维斯坦治疗会降低细胞生长和谷氨酰胺的摄入(图3C)这表明谷氨酰胺的摄入与雌激素无关，但仍需要AI耐药乳腺癌细胞中组成性激活的ER。

3.4. Fulvestrant抑制AI耐药乳腺癌细胞中谷氨酰胺介导的细胞增殖和脂糖代谢基因的表达

由于我们的研究结果表明，尽管在AI抗性乳腺癌细胞中雌激素不依赖，但ER在谷氨酰胺代谢中发挥作用，我们在不含谷氨酰胺（Gln--）、含谷氨酰胺（Gln+）或含谷氨酰胺和富维司琼（Gln/fulvestrant）的培养基中培养LTEDaro细胞24小时，并进行RNA测序，以确定ER在LTEDaro细胞谷氨酰胺代谢中的作用。

我们使用Ingenuity软件分析了基因签名的分子和细胞功能。前五大分子和细胞功能列表P（P）-值如所示表1在Gln+组和Gln−组之间的比较中，“脂质代谢”是变化最大的功能，在Gln+vs.Gln-组和Gln/Fulvestrant vs.Gln+的比较中“细胞生长和增殖”和“细胞死亡和存活”均位于变化功能的前五位列表中。

与Gln−组相比，我们观察到Gln+组中增殖和细胞周期的基因表达增加。Gln/Fulvestrant组增殖和细胞周期的基因表达谱接近Gln−组(图4A)。这些结果表明，组成性激活的ER在谷氨酰胺介导的细胞增殖中起着重要作用。我们通过MTT法证实了对细胞增殖的影响。我们发现谷氨酰胺促进细胞增殖，而富尔维斯特兰降低谷氨酰胺介导的细胞增殖(图4B).

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图4

Fulvestrant抑制AI耐药乳腺癌细胞中谷氨酰胺介导的细胞增殖和脂糖代谢基因的表达

A.树状图和热图显示了在不含谷氨酰胺、含谷氨酰胺或含谷氨酰胺和fulvestrant培养基中培养24小时的LTEDaro细胞基因表达数据的层次聚类分析。基因表达谱是从RNA测序数据中获得的。分析了三组基因：细胞增殖、细胞周期和脂质生物合成。列表示单个基因，行表示单个样本。矩阵中的每个细胞代表单个样本中基因的表达水平。比例尺指示表达式的级别；红色表示高表达水平，蓝色表示低表达水平。

B.在不含谷氨酰胺、含谷氨酰胺或同时含有谷氨酰胺和富尔维斯坦的培养基中培养的LTEDaro细胞的细胞增殖。在第7天测量MTT。数据为平均值±SE（n=6）。星号（*）表示P（P）<0.05（t检验）。

C.热图显示了在不含谷氨酰胺（Gln−）、含有谷氨酰胺（Gln+）或同时含有谷氨酰胺和fulvestrant（Gln/fulvestrant）的培养基中培养24小时的LTEDaro细胞数据的基因表达分析。基因表达谱是从RNA测序数据中获得的。列代表参与葡萄糖代谢的单个基因，行代表Gln/Fulvestrant与Gln+（左）或Gln+与Gln-−（右）的倍数变化。比例尺指示表达式的级别；红色表示高表达水平，蓝色表示低表达水平。

谷氨酰胺可以作为碳和氮的来源，用于合成脂质、蛋白质和核苷酸[20]. 在RNA测序数据中，与Gln−组相比，我们在Gln+组中观察到一个强大的转录脂质生物合成基因特征。Fulvestrant治疗对脂质生物合成中基因表达的影响较小(图4A)这表明组成性激活的ER对谷氨酰胺促进的脂质生物合成可能不是必需的。

虽然谷氨酰胺刺激脂质生物合成的发现很重要，但我们对谷氨酰胺促进糖酵解感到特别兴奋(表2和图4C)。后一个观察结果支持我们的结果图3葡萄糖不足以驱动细胞增殖，细胞利用葡萄糖需要谷氨酰胺。此外，通过比较Gln+组和Gln/Fuvestrant组中这些基因的水平，发现葡萄糖的利用受雌激素调节(图4C)以及Chen等人的审查[36].

作者感谢希望之城综合基因组学中心的吴锡伟博士和王金辉博士对RNA测序的帮助。该研究得到了国家卫生研究院（R01 ES08258 to SC）和熊猫慈善基金会（SC）的支持。