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血管药理学。作者手稿；PMC 2015年3月26日提供。
以最终编辑形式发布为：
血管药理学。2010年5月-6月；52(0): 175–181.
2010年1月11日在线发布。 数字对象标识：10.1016/j.vph.2009.12.009
预防性维修识别码：项目经理4374552
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院191561
PMID：20060932

人肺微血管内皮细胞的采集、鉴定及屏障功能

约翰·D·卡特拉瓦斯,1,2,* 康妮·斯奈德,1 克里斯蒂安娜·迪米特罗普洛,2 Albert，S.Y.Chang先生,三 鲁道夫·卢卡斯,1,2 亚历山大·维林,1,4和斯蒂芬·M·布莱克1,5
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

内皮屏障功能障碍是急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）发病机制的重要因素。尽管明确需要以预防和修复内皮屏障功能障碍为目标的方法，但我们对肺微血管内皮通透性的分子调控的理解仍不完整。培养的肺微血管内皮细胞是研究屏障功能的一个有吸引力的范例。在这里，我们描述了一种采集、鉴定和培养人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）的方法。由此获得的HLMVEC生长为单层，表现出接触抑制作用，并具有典型的鹅卵石外观。它们表达内皮蛋白，如血管性血友病因子和内皮型一氧化氮合酶，并摄取乙酰化的低密度脂蛋白。此外，HLMVEC对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌产物、凝血酶、血管内皮生长因子和微管破坏剂的屏障破坏作用具有可预测性和较高的敏感性。这些HLMVEC为研究导致ALI和ARDS的机制提供了一种替代商业上可获得的人类细胞的室内衍生替代品。

简介

急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）代表了在没有左心衰竭的情况下进行性呼吸衰竭的连续性。ARDS患者代表ALI患者的一个子集，以更严重程度区分。在ALI/ARDS中，毛细血管屏障的完整性受到损害，导致血管通透性增加和肺泡淹水。革兰氏阴性败血症（间接损伤）是目前为止ALI最常见的原因(哈德逊等。1995). 脓毒症代表对感染的全身炎症反应三, (雅各比2002). 肺部是导致ALI和ARDS的严重脓毒症中最常见的受累器官(马丁等。2003). 从1979年到2000年，脓毒症的发病率增加了8.7%(马丁等。2003)死亡率为30-50%(Rangel-Frausto公司等。1995;安古斯等。2000;安娜等。2000). 针对炎症介质的临床试验表明无生存益处(费希尔等。1994;麦克洛斯基等。1994;亚伯拉罕等。1998;戴诺等。1998;Fink 1998年;亚伯拉罕等。2001)除使用重组活化蛋白C能提高存活率外，其他策略均未能降低与严重脓毒症相关的发病率(伯纳德等。2001).

尽管明确需要以预防和修复内皮屏障功能障碍为目标的方法，但我们对肺微血管内皮通透性的分子调控的理解仍不完整。培养的肺微血管内皮细胞是研究屏障功能的一个很有吸引力的范例。然而，动物源性内皮细胞并不一定反映人类内皮细胞的复杂生物学特性。此外，人类内皮细胞虽然在商业上可以买到，但价格昂贵，质量往往不稳定。本文介绍了一种人肺微血管内皮细胞的采集、鉴定和培养方法。我们进一步提供的数据表明，这些细胞表现出强大的基线屏障功能，并对常见的去磁剂作出可预测的反应。

材料和方法

1.材料

Tosyl活化的Dynabeads和Prolong Gold来自Invitrogen；eNOS抗体来自Becton Dickinson；vWF抗体来自Sigma；山羊抗鼠IgG和Cy3山羊抗兔IgG来自Jackson实验室。胎牛血清（FBS）来自Hyclone。所有其他试剂均来自西格玛化学公司（密苏里州圣路易斯）。八个阵列来自应用生物物理（纽约州奥尔巴尼）。

2.人肺微血管内皮细胞的采集、培养和鉴定。（HLMVEC）

从乔治亚医学院医院接受肺叶切除术或肺切除术的患者中获取外周肺标本。这些患者中绝大多数正在接受肺癌的治疗性手术。所有组织均取自解剖切除标本，这些标本取自原发肿瘤，肿瘤边缘不存在问题。我们没有使用肺楔形切除标本，因为可以获得的组织很少。患有已知潜在肺病（如肺结核、肺纤维化或间质性肺病）的患者和患有已知系统性疾病（如艾滋病毒）的患者未被纳入研究。所有标本均取自70岁或以下的受试者。我们观察到供体的年龄是内皮细胞分离质量的主要决定因素。将不同大小（5-15g）的样本置于装有培养基的50ml无菌试管中的冰上，并在切除后一小时内运送至实验室进行处理。HLMVEC的分离和培养是通过改进Hewett和Murray的方法进行的(Hewett&Murray 1993年)和Burg等人(伯格等。2002). 简单地说，HLMVEC的分离如下：胸膜下肺组织用剪刀剪成小碎片。通过40µm尼龙网去除碎片和红细胞后，用dispase处理网中收集的组织（1 U/ml，4°C，18小时）。通过100µm尼龙网过滤后，滤液在37°C下以15ml M199、15%FBS、1mg dispase/ml的体积处理1h，然后再进行100µm.净过滤。滤液中的细胞团在M199中反复悬浮，并通过40µm网过滤，然后以1000rpm离心10min，再在M199和20%FBS中重新悬浮。HLMVEC的阳性选择是通过细胞悬浮液与涂有欧洲乌莱克斯一号根据Jackson等人的方法(杰克逊等。1990). 细胞在补充有20%FBS、100单位/ml肝素、150µg/ml ECGF、1µg/ml氢化可的松、292mg/l l-谷氨酰胺和110mg/l丙酮酸钠的M199中培养。由此收集的细胞通过其1）作为接触抑制单层生长被鉴定为HLMVEC；2） 鹅卵石般外观的展示；3） 1,1-二十八烷基-1,3,3_，3_四甲基吲哚花青素乙酰化低密度脂蛋白（Dil-Ac-LDL）的摄取，4）内皮型一氧化氮合酶（eNOS或NOS3）的表达和5）血管性血友病因子（vWF）的表达，如下所述。使用标准技术以1:3的比例对细胞进行亚培养。

为了进行鉴定，细胞生长在玻璃盖玻片上，并在37°C的Dil-Ac-LDL（10µg/ml培养基）中培养4h。细胞用PBS洗涤三次，在4%中性缓冲福尔马林中固定15分钟，用PBS清洗三次，并用Prolong Gold将其安装在显微镜载玻片上。为了进行免疫染色，细胞生长在盖玻片上，在PBS中洗涤三次，在−20°C的丙酮：甲醇（1:1）中固定10分钟，在PBS中洗涤三遍，并在PBS的1%BSA中封闭1小时。然后将细胞在4°C的一级抗体中培养过夜，eNOS封闭缓冲液中的稀释度为1:1000，vWF封闭缓冲液为1:200。然后在封闭缓冲液中清洗细胞三次，然后在二级抗体中在室温下孵育1小时：用于eNOS的1:1000 Cy3结合山羊抗鼠IgG抗体或用于vWF的1:1000 Ny3山羊抗兔IgG。细胞在PBS中清洗三次，并用ProLong Gold安装在显微镜载玻片上。使用Axio Observer D1显微镜（蔡司）和罗丹明滤镜观察Dil-Ac-LDL摄取和eNOS及vWF表达。

3.内皮单层跨内皮电阻（TER）的测量

细胞生长在特殊的孔中（0.8 cm2)播种密度为1.25×105细胞/厘米2，正如我们之前报告的那样(安东诺夫等。2008;查特吉等。2008). 在使用应用生物物理电细胞基底阻抗传感系统（纽约州奥尔巴尼市应用生物物理）进行治疗的过程中，连续监测电阻。该系统可以同时监测16口井，包括实时计算和显示血管内皮阻力。在每个阱的底部都有一个金膜电极。当电池覆盖电极时，阻抗会发生变化，因为电池会阻挡电流。对阻抗的主要贡献是由于细胞下方和细胞间连接处的狭窄空间。当细胞改变其形态或四处移动时，这些通道会发生变化，从而引起电阻抗的变化。根据阻抗的变化，可以确定电池的屏障功能(蒂鲁帕蒂等。1992).

4.数据分析

所有TER测量均一式三或四份，每个实验至少重复三次。数值表示为来自一个代表性实验的平均值±SEM。各组间的差异通过重复测量的双向方差分析（ANOVA）和Neuman-Keuls检验进行检验，结果显著（P<0.05）。

结果

人肺微血管内皮细胞的鉴定

方法中概述的采集程序始终能够产生无其他细胞污染的内皮细胞。我们称这些细胞为微血管，因为我们利用胸膜下肺段，没有可见的大血管，并将切下的组织连续两次过滤100µm。此外，由于几个原因，这些细胞是内皮细胞。如所示图1,左上面板它们体积小，形成接触抑制单层，呈现内皮细胞特有的鹅卵石外观，高度均质。这些细胞还具有血管内皮细胞的特性和表达蛋白质。因此，如所示图1,右上面板，它们吸收乙酰化低密度脂蛋白（Ac-LDL），而图1证明这些细胞广泛表达在内皮细胞中发现的两种蛋白质：血管性血友病因子（vWF）和内皮（3型）一氧化氮合酶（eNOS）。中描述的HLMVEC图1属于通道3；在HLMVEC第4-10代中观察到类似的结果。除了第10段之外，我们还没有研究HLMVEC。

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左上面板：HLMVEC的相衬显微照片（第3段）；其他三个面板显示了所有内皮细胞的既定特征，即乙酰化低密度脂蛋白的摄取（Ac-LDL：右上面板）、血管性血友病因子的表达（vWF；左下面板）和内皮细胞（或3型）一氧化氮合酶的表达（eNOS；右下面板）。请参见材料和方法详细信息。

人肺微血管内皮细胞的屏障特性

将HLMVEC接种在8孔阵列上24到48小时后，为测量内皮细胞间电阻（TER）做准备，HLMVEC显示出一层致密的单层，具有极好的电阻（~1000MΩ）。为了证明HLMVEC的屏障特性，我们测试了六种已知可增加肺内皮通透性的物质（一种革兰氏阴性和两种革兰素阳性细菌产物、两种受体作用剂和一种细胞骨架破坏剂）。

图2表明革兰氏阴性菌壁的产物脂多糖（LPS），大肠杆菌导致HLMVEC TER的时间和浓度依赖性下降。LPS在1到10 EU（内毒素单位）/ml的浓度范围内降低了TER。在测试的最低浓度为1 EU/ml时，LPS在添加后一小时就降低了TER，并在3-4小时内达到了TER降低45%的最低点。

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LPS引起的HLMVEC内皮电阻（TER）的时间和浓度依赖性降低。8个阵列接种了HLMVEC（10万）；48小时后，观察到融合单层表现出~900MΩ的电阻。在箭头所示的时间添加LPS或载体（15µl），并在接下来的18小时内以20秒的间隔连续记录TER值。所示数据为四个重复的平均值±SEM。*：与赋形剂组相比P＜0.05。

图3结果表明，革兰氏阳性细菌产物李斯特菌溶素（LLO；顶面板）和肺活素（PLY；底面板）也以时间和浓度依赖的方式降低了HLMVEC的TER，但具有不同的特征。当LLO在250–500 ng/ml的浓度下对TER产生20–40%的抑制作用时，PLY在62.5–250 ng/ml低得多的浓度下产生40–70%的抑制作用；此外，PLY的作用比LLO快得多：PLY诱导的TER降低的最低点发生在约40分钟，而LLO的最低点发生在约12-14小时。

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革兰氏阳性菌产物溶菌酶（LLO；A）和溶血素（PLY；B）引起的HLMVEC跨内皮细胞阻力（TER）的时间和浓度依赖性降低。8个阵列接种了HLMVEC（10万）；48小时后，观察到汇合单层表现出约900MΩ的电阻。在箭头所示的时间添加LPS或载体（15µl），并在接下来的18小时（A）或150分钟（B）内以20秒的间隔连续记录TER值。所示数据为四个重复的平均值±SEM。*：相应车辆组P<0.05。

为了研究HLMVEC对两种特性良好的受体作用去磁剂的反应，我们研究了HLMVEC对于凝血酶引起的TER变化的时间和浓度依赖性反应(图4)和血管内皮生长因子(图5). 正如预期的那样，凝血酶和VEGF均诱导了TER的深度、时间和浓度依赖性下降。凝血酶浓度在0.0625和1 U/ml之间时，在几分钟内使TER快速下降5–15%，在两种较高浓度下，TER部分恢复，但至少持续抑制三小时。相反，VEGF浓度在10–50 ng/ml之间时，TER缓慢但持续降低10–30%，持续降低至少11小时。

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凝血酶引起HLMVEC跨内皮电阻（TER）的时间和浓度依赖性降低；48小时后，观察到汇合单层表现出约900MΩ的电阻。在箭头所示的时间添加凝血酶或溶媒（15µl），并在接下来的160分钟内以20秒的间隔连续记录TER值。所示数据代表了三个具有可比结果的独立实验。

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血管内皮生长因子（VEGF）对HLMVEC跨内皮阻力（TER）的时间和浓度依赖性降低。8个阵列接种了HLMVEC（10万）；48小时后，观察到汇合单层表现出约900MΩ的电阻。在箭头所示的时间添加VEGF或载体（15µl），并在接下来的11小时内以20秒的间隔连续记录TER值。所示数据为四个重复的平均值±SEM。*：车辆组P<0.05。

微管是细胞旁内皮通透性的重要细胞骨架调节器。我们将HLMVEC暴露于微管解聚剂诺卡唑(图6). 在0.05至2µM的浓度下，诺卡唑使TER快速下降5–35%，持续至少30分钟。

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微管解聚剂诺卡唑对HLMVEC跨内皮细胞阻力（TER）的时间和浓度依赖性降低。8个阵列接种了HLMVEC（10万）；48小时后，观察到汇合单层表现出约900MΩ的电阻。在箭头指示的时间添加诺可唑或载体（15µl），并在接下来的30分钟内以20秒的间隔连续记录TER值。所示数据代表了三个具有可比结果的独立实验。

讨论

维持血液和组织之间的屏障是血管内皮非常重要的功能。肺微血管内皮尤其如此，因为未能维持健康的屏障可能导致气体交换受损、血氧合降低、酸碱紊乱、急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。在过去三十年中，培养的内皮细胞被频繁用作研究内皮屏障完整性调节机制的模型。这些研究大多使用了牛和其他动物内皮细胞或人脐静脉内皮细胞，尽管最近许多研究人员使用了市售的人肺动脉内皮细胞，其中一些研究人员使用了人肺微血管内皮细胞。由于市面上可买到的内皮细胞既昂贵又质量不稳定，因此我们开发了一种常规和大规模室内采集和培养人肺微血管内皮细胞（HLMVEC）的方法。如相位对比显微镜所示，这种方法产生了持续优质的HLMVEC(图1). 重要的是，它们表达内皮细胞特有的蛋白质。因此，HLMVEC强烈表达vWF和eNOS，这两种蛋白几乎完全由内皮细胞表达。vWF是一种参与止血的糖蛋白，包含在内皮细胞核周Weibel-Palade小体中(杰菲等。1974;瓦格纳等。1982). 除血小板外，内皮细胞是唯一表达vWF的细胞；因为中显示的单元格图1它们不是血小板，vWF的广泛表达强烈表明它们是内皮细胞，未检测到非内皮污染。同样，即使血小板和肺泡上皮细胞都表达内皮型一氧化氮合酶(Muruganandam&Mutus 1994年;Vyas读取等。2007)eNOS和vWF在我们的细胞中的同时表达证实了它们作为内皮细胞的身份。

使用这种方法，不可能也不打算分离动脉和静脉微血管细胞。可以合理地预期，这些文化包含这两者的混合。同样，我们无法确定这些细胞起源的确切血管大小，即使没有标本包含可见大小的血管。

为了研究HLMVEC的屏障功能，我们测试了一些渗透诱导剂。革兰氏阴性细菌产物LPS引起HLMVEC通透性的强烈增加。这与许多文献报道一致。例如，在BPAEC中，LPS通过对hsp90抑制剂敏感的机制降低内皮电阻(安东诺夫等。2008), (查特吉等。2007). 脂多糖诱导的高渗透性的一个重要手段是刺激内皮收缩机制和抑制Rho激酶，有效防止脂多糖引起的内皮收缩，并减少脓毒性炎症期间水肿的形成(埃斯勒等。2000;田阪等。2005). 一般来说，Rho A被认为对炎症刺激（如凝血酶、肿瘤坏死因子-α和LPS）引起的内皮通透性增加很重要(埃斯勒等。1998;范尼乌·阿梅隆根等。2000;Wojciak-Stothard&Ridley 2002年;鲍默等。2008). LPS诱导的肺水肿也被1-磷酸鞘氨醇阻断，1-磷酸鞘磷脂是已知的Rac 1激活剂(彭等。2004)cAMP也通过激活Rac 1稳定内皮屏障功能(沃伊西亚克·斯托塔（Wojciak-Stothard）等。2001;比鲁科娃等。2007;比鲁科娃等。2008). 众所周知，内皮屏障的特性严格依赖于内皮粘附物和紧密连接的完整性(Bazzoni和Dejana 2004年). LPS还通过VE-cadherin、p120连环蛋白和[γ]-catenin的酪氨酸磷酸化增加人肺微血管EC的细胞旁通透性(龚等。2008)，以及通过抑制NADPH氧化酶活性(陈等。2008). 在这些研究中，绝大多数人肺内皮细胞（动脉或微血管）来自商业来源(陈等。2008;龚等。2008;蒂鲁帕蒂等。2008). 我们的HLMVEC与商业上可获得的相比具有优势和更高的灵敏度。因此，Tiruppathi等人(蒂鲁帕蒂等。2008)据报道，高达4µg/ml（~120000U/ml）的LPS浓度不会改变商业获得的HLMVEC中的静息TER，而在1 U/ml时，LPS使我们自己的HLMVEC中的TER降低了45%。同样，在我们的实验室中，我们的HLMVEC对1U/ml LPS的TER反应相当于我们内部采集的牛肺动脉内皮细胞（BPAE）对1000EU/ml的TER响应(查特吉等。2008).

我们的研究结果表明，肺溶血素（PLY）和肺炎链球菌和李斯特菌溶素（LLO）单核细胞增生李斯特菌，HLMVEC中TER的显著降低与已发表的研究一致。PLY和LLO所属的胆固醇依赖性成孔毒素家族可快速增加细胞内钙2+和二酰甘油水平(代表H 2002)并与严重的肺过度渗透有关(阿南思拉曼A 1983), (Witzenrath M 2006年). 相互作用单核细胞增生李斯特菌与内皮细胞结合是李斯特菌病发病机制中的关键一步。野生型人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养单核细胞增生李斯特菌激发强烈、即时的NO合成，归因于LLO，并可通过纯化的LLO进行复制(玫瑰F 2001). 此外，HUVEC与LLO的孵育是持续上调促炎细胞因子（IL-6、IL-8和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）的有力刺激物(玫瑰F 2001). LLO诱导的跨膜钙2+内皮细胞的流动导致磷脂酶激活，生成二酰甘油、神经酰胺和NF-κB，这可能导致严重李斯特菌感染和败血症的致病性后遗症。最近，血管内PLO剂量依赖性增加肺血管阻力和肺微血管通透性。在这些研究中，PLY主要在肺动脉内皮细胞中检测到。PLY还增加了HUVEC单层的渗透性(Witzenrath M 2006年). 此外，在神经母细胞瘤细胞中，PLY诱导胆固醇、Rho和Rac GTPase依赖的肌动蛋白重塑，导致肌动蛋白应激纤维、丝状伪足和跛足的形成(伊利耶夫AI 2007). 目前尚不清楚为什么PLY在HLMVEC中的TER下降速度比LLO快得多（1h vs.12h）。我们尚未研究HLMVEC中LLO和PLY之间钙内流的时间进程以及上述促炎途径的刺激是否存在类似差异。

与文献报道一致，我们的HLMVEC对凝血酶的反应是以浓度依赖的方式降低TER。凝血酶诱导肺内皮单层屏障功能障碍，这与细胞骨架重组、肌动球蛋白收缩激活和缝隙形成有关(比鲁科娃等。2004年b). 凝血酶诱导的BPAEC肌动蛋白重组需要激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和蛋白激酶C（PKC）(Zhao&Davis，1996年). 凝血酶诱导的内皮细胞高渗透性与钙动员和PKC激活有关(勒姆等。1993), (勒姆等。1992). 与LPS一样，凝血酶对内皮细胞细胞骨架重排和TER的影响被hsp90抑制剂抑制(安东诺夫等。2008). 与LPS一样，凝血酶诱导的屏障功能障碍需要RhoA(Vouret-Cravari公司等。1998;希彭斯蒂尔等。2000;Woo&Kim 2002年)以及超氧化物的诱导(荷兰等。1998;锂等。2002;潘迪安等。2005). 凝血酶的这些作用通过G蛋白介导，G蛋白将凝血酶受体与几个关键的生理反应耦合。

VEGF通过至少两种不同的途径增加通透性：一种途径涉及Raf-1、MEK和ERK-1/2；另一种涉及NOS PKC，通过增加NO生成增加渗透性(黄和袁1997)是VEGF诱导的ERK-1/2磷酸化和高渗透性的介体(布雷斯林等。2003).体外研究表明，VEGF导致牛肺大血管和微血管内皮细胞单层原代培养物的蛋白质通透性增加，这与VE和E-钙粘蛋白磷酸化以及肌动蛋白应激纤维的形成有关。应激蛋白反应的激活阻止了VEGF介导的跨EC单层蛋白通透性的变化，降低了VE-和E-钙粘蛋白的磷酸化，以及肌动蛋白应激纤维的形成(戈德齐奇等。2006). 血管内皮细胞通透性的VEGF增加被hsp90抑制剂阻止和逆转(安东诺夫等。2008). HLMVEC对VEGF的敏感性与BPAEC相当：在这两种细胞类型中，50ng/ml的VEGF诱导TER降低约30%。(安东诺夫等。2008)

内皮细胞骨架在内皮屏障功能的调节中起着关键作用(杜德克和加西亚2001). 包括诺卡唑在内的各种药物对微管的分解导致高渗透内皮单层(Verin公司等。2001;比鲁科娃等。2004年a;比鲁科娃等。2005). 我们在HLMVEC中证实了这一观察结果。诺卡唑在HLMVEC TER中产生浓度依赖性降低，与之前在BPAE中观察到的结果相当(安东诺夫等。2008).

总之，我们提出了一种室内采集、鉴定和培养人肺微血管内皮细胞的方法，并提供证据证明这些细胞具有可预测的屏障功能。肺微血管内皮屏障功能改变是急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的一个特征，40多年来死亡率几乎保持不变。在实验研究中，人体组织是动物组织的最佳替代品；此外，与商业化的内皮细胞相比，室内采集的人内皮细胞可以提供更经济、质量更好的替代品。

鸣谢

我们感谢Chakraborty博士为我们提供了纯化的李斯特菌溶素和肺炎球菌溶素。由美国心脏协会、东南联盟和美国国立卫生研究院支持，HL070214。这项工作还得到了佐治亚医学院心血管研究所颁发的项目开发奖（SMB、JDC、DF、RL和ADV）的支持。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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