PI3-激酶调节亚基与X-box结合蛋白-1相互作用调节未折叠蛋白反应

p85α促进XBP-1的稳定和核积累

XBP-1的降解涉及泛素依赖和独立机制，导致XBP-1u和XBP-1s蛋白的半衰期均较短³⁶为了确定p85α是否改变了XBP-1的稳定性，将XBP-1单独或与p85α联合瞬时转染细胞(图1c). XBP-1与p85α的共表达分别导致细胞质和细胞核中XBP-1u和XBP-1的水平显著增加。

与XBP-1u相反，XBP-1主要定位于细胞核。XBP-1s的N末端缺失的表达导致了对细胞质和细胞核的重新分布，这表明XBP-1的这一区域控制着其核分布^36,37确定了p85α和XBP-1相互作用，并且相互作用发生在p85α的N末端部分和能够指导核定位的XBP-1共享N末端片段之间，我们检查了p85β是否能够改变XBP-1的细胞分布。为此，我们在缺乏或存在越来越多HA-p85α的情况下，用FLAG-XBP-1瞬时转染细胞，并用抗FLAG抗体对细胞质和核部分进行免疫印迹(图1d). 有趣的是，HA-p85α的剂量依赖性增加导致XBP-1的核转位平行增加。因此，增加p85α水平可稳定XBP-1并增强XBP-1的核质穿梭。

p85α缺陷的成纤维细胞对内质网应激的反应减弱

基于XBP-1作为UPR中心介质的作用，我们试图确定p85α和XBP-1之间的相互作用是否在控制细胞对内质网应激的反应中发挥作用。为此，不朽的控制(像素3r1^+/+)和p85α缺乏(像素3r1^−/−)用载体或衣霉素处理棕色前脂肪细胞系，并评估细胞质或核室中BiP和XBP-1s蛋白的表达(图2a)³¹如预期的那样，用衣霉素处理对照前脂肪细胞4小时后出现BiP，对核裂解物进行的免疫印迹显示XBP-1的时间依赖性积累(图2a). 相比之下，当像素3r1^−/−用衣霉素处理细胞，与对照组相比，BiP诱导减少了50%，3小时时XBP-1s的核累积显著减少，而4小时后XBP-1的核累积减少了40%，5小时后没有进一步增加(补充图S2). 因此，p85α的缺失改变了细胞对内质网应激的反应，XBP-1s的核积累减少，BiP的表达减少。

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图2

p85α缺陷成纤维细胞内质网应激和UPR信号动力学的评估。a） 对细胞质和核蛋白组分进行免疫印迹，以评估在衣霉素（2μg ml）作用一段时间后BiP或XBP-1s蛋白的诱导作用⁻¹)治疗。b） （顶部）控制和像素3r1^−/−用指定浓度的衣霉素处理成纤维细胞5小时，并在全细胞裂解物上进行抗BiP免疫印迹。进行抗肌动蛋白免疫印迹以确保负载均匀。b） （底部）对来源于对照的cDNA进行定量RT-PCR像素3r1^−/−用指定浓度的衣霉素处理成纤维细胞5小时。c） 控制和像素3r1^−/−成纤维细胞用载体或衣霉素（2μg ml）处理⁻¹)5小时后，使用IRE1α、pIRE1β和PERK特异性抗体对整个裂解物进行免疫印迹。进行抗肌动蛋白免疫印迹以确认蛋白质载量相等。d） 控制和像素3r1^−/−用衣霉素（2μg ml）处理成纤维细胞⁻¹)在指定的时间段内。使用XPB-1、ATF6和CHOP抗体对核裂解物进行免疫印迹分析。进行抗lamin A/C免疫印迹以确认等负荷。数据以平均值±SEM表示，星号表示学生t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05, **第页<0.001，n.s.：无显著性）

排除在像素3r1^−/−由于细胞对UPR激活的敏感性降低，因此进行了衣霉素剂量反应。正如预期的那样，像素3r1^+/+0.1-5μg ml处理后，细胞BiP表达呈剂量依赖性增加⁻¹衣霉素(图2b; 顶部）。在像素3r1^−/−经衣霉素处理的细胞，BiP蛋白表达呈剂量依赖性增加，然而，在所有衣霉素浓度下，BiP水平均降低50–60%。同样，在对照细胞中，膜霉素处理后，BiP和CHOP mRNA水平呈剂量依赖性增加10至20倍，而p85α缺陷细胞在所有浓度下都显示出BiP和CHOP mRNA减少50至60%(图2b，底部）。当使用thapsigargin激活UPR时，在mRNA和蛋白质水平上观察到UPR靶点BiP和CHOP的类似减少(补充图S2,第3章,数据未显示). 这些作用独立于PI 3-激酶酶活性：使用LY294002对PI 3-激酶的药物抑制对衣霉素或他吡加金治疗后BiP表达的诱导没有影响(补充图S4).

p85α缺乏的成纤维细胞中多条UPR通路改变

从上面可以清楚地看出，p85α-缺乏严重损害了细胞对内质网应激的反应，BiP的表达减少，XBP-1s的核积累对UPR激活的反应。p85α缺乏也与IRE1α和ATF6α依赖信号通路的改变有关。因此，虽然对照细胞对衣霉素治疗的反应是IRE1α蛋白显著上调，IRE1β磷酸化增强，像素3r1^−/−细胞在基础状态和被膜霉素处理后IRE1α的表达减少了约20–40%，IRE1的α磷酸化也相应减少(图2c). 有趣的是，虽然很容易观察到IRE1α活化的改变，但对照组和对照组之间的PERK水平或活化没有差异像素3r1^−/−通过PERK流动性或磷酸化变化评估细胞(图2c，数据未显示）。通过对核裂解物中ATF6α处理形式的免疫印迹分析评估，ATF6β的活化在像素3r1^−/−细胞在3小时和5小时的时间点，并在核XBP-1的积累和CHOP的诱导中平行出现钝化反应(图2d). 因此，p85α缺乏通过多种机制减弱细胞对内质网应激的反应，包括改变XBP-1的诱导和激活IRE1α和ATF6依赖性通路。

p85α缺陷成纤维细胞中XBP-1剪接和UPR靶基因表达的改变

检测IRE1α通路的改变是否导致XBP-1剪接能力的降低像素3r1^−/−成纤维细胞，我们进行了XBP-1剪接分析。正如预期的那样，未经处理的对照成纤维细胞主要产生XBP-1u转录物，只有少量XBP-1以预期的剪接转录物大小迁移(补充图5a). 用衣霉素处理这些细胞后，XBP-1u显著降低，XBP-1转录水平随之升高。相反，像素3r1^−/−经衣霉素处理后，细胞在基础状态下XBP-1u转录物减少，剪接XBP-1转录物相对适度增加。qPCR分析显示，对照细胞经衣霉素处理后，总XBP-1转录物增加了2.5倍(补充图5b，左侧面板，第页< 0.05). 在p85α缺陷细胞中，与对照组相比，总XBP-1转录物在基础状态下减少了50%，并且显著减弱，膜霉素依赖性增加。同样，在对照细胞中，衣霉素在XBP-1s中产生了约30倍的显著增加（100±2.45 vs.3067±778），并且在p85α缺陷细胞中这种反应明显减弱（91±29 vs.1181±193）(补充图5b，右侧面板）。因此，p85α缺失降低了IRE1α依赖性XBP-1剪接对内质网应激的响应。

接下来，我们试图确定IRE1α蛋白和磷酸化缺陷以及XBP-1 mRNA转录和剪接减少的程度像素3r1^−/−细胞改变了UPR靶基因的诱导。经衣霉素处理5小时的对照成纤维细胞分析显示，多个UPR靶基因增加50-60%，包括BiP、Grp94、CHOP、p58^IPK公司、IRE1α、ATF4和TRB3(图3a). 相比之下像素3r1^−/−细胞可分为两类。第一组包含BiP、CHOP和ATF4等基因，这些基因被衣霉素上调，但水平远低于对照细胞。第二组包括Grp94，p58^IPK公司和IRE1α和TRB3在ER应激诱导后在对照细胞中显著升高，但在像素3r1^−/−用衣霉素处理后的细胞。

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图3

评估XBP-1靶基因转录、UPR依赖性基因表达和凋亡。a） 进行定量PCR以确定UPR靶基因在像素3r1^+/+或像素3r1^−/−用载体或衣霉素处理细胞5小时。b） 细胞生长到汇合处，并在添加或不添加衣霉素（2μg ml⁻¹)或塞普西格金（100 nM）24小时。收集漂浮和附着的细胞，将其与膜联蛋白V PE和碘化丙啶（PI）混合培养15分钟。然后进行FACS分析。测定凋亡细胞（PI阴性，膜联蛋白-PE阳性细胞）的百分比。数据是来自3个独立实验的平均值±S.E。c） 使用p85α特异性引物对对照和shp85α细胞系进行定量PCR。d） 使用由shGFP和经载体或衣霉素（2μg ml）处理的shp85α细胞系制备的全细胞裂解物进行免疫印迹分析⁻¹)持续五个小时。e） 在用衣霉素（2μg ml）处理shGFP和shp85α细胞系之前或之后，进行定量PCR以量化BiP、Erdj4和Grp94 mRNA的表达⁻¹)持续五个小时。数据以平均值±SEM表示，星号表示通过学生的t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05; **第页< 0.001; n.s.=不重要）

最后，为了评估p85α缺陷细胞中钝性UPR激活的结果，在对照组和像素3r1^−/−衣霉素和thapsigargin治疗后的前脂肪细胞(图3b和补充图6). 如预期像素3r1^+/+与在正常培养基中生长的细胞相比，p85α缺陷细胞与衣霉素或thapsigargin联用24小时后，细胞凋亡率增加。有趣的是，在使用衣霉素（13.1±3.7%）和他司加净（5.8±.9%）治疗后，p85α缺陷细胞凋亡的比例较高（分别为21.6±3.5%和18.2±3.0%）。因此，根据所有标准，p85α缺陷细胞无法正常激活UPR并解决内质网应激。这会导致有害后果，包括进入凋亡程序的倾向。

人肝癌细胞系p85α表达减少改变内质网应激反应

慢病毒介导的shRNA敲低p85αmRNA后，在人Huh7肝癌细胞中也观察到p85α缺乏的类似影响。使用这种方法，与表达shGFP的对照细胞相比，p85α的mRNA水平降低了78%(图3c)使用抗p85α抗体的免疫印迹分析证实了这一点(图3d，顶部）。暴露于衣霉素的对照细胞也显示XBP-1s蛋白显著增加，而p85α敲除后细胞中未检测到XBP-1。此外，p85α缺陷细胞中PDI的增加减弱。同样，与对照组相比，用衣霉素处理shGFP细胞可导致XBP-1u转录物向XBP-1s转录物的强烈转变，而衣霉素后的XBP-1转录物剪接在shp85α细胞中减少，这反映在XBP-1的转录物水平较低以及XBP-1umRNA的相关增加(补充图5c). 因此，与对照组相比，shp85α细胞中UPR靶基因ERdj4和BiP的衣霉素依赖性诱导减弱(图3e). 因此，p85α-缺乏改变细胞对内质网应激的反应，与细胞类型或刺激无关，这表明p85α和XBP-1之间的相互作用在内质网胁迫诱导和UPR中起着重要作用。

在p85α肝脏特异性缺失的小鼠中观察到钝化的UPR

确定是否观察到影响在体外将被重述体内，我们使用了p85α基因（L-像素3r1^−/−). 在两个月大时，雄性小鼠服用载体或膜霉素（2.5μg/g B.W.），72小时后，对小鼠实施安乐死，并收集肝脏进行分析。免疫印迹证实了载体和经衣霉素处理的L-像素3r1^−/−动物(图4a). 正如预期的那样，载体处理的p85α中PERK和IRE1α磷酸化水平较低^{液氧/液氧}动物，但服用衣霉素后急剧增加(图4a，左）。相反，来自L-像素3r1^−/−小鼠未检测到IRE1α磷酸化的基础和显著降低的衣霉素依赖性增加，而PERK通路的激活无明显改变(图4a，右侧）。对照动物的总IRE1α和BiP蛋白水平也显著增加，且依赖膜霉素，这些反应在L-像素3r1^−/−老鼠。服用衣霉素18小时后，UPR也发生类似的钝化，ATF6α通路的激活减少(补充图S7). 同样，与对照组相比，早在服用衣霉素后4小时，p85α缺陷肝脏中BiP蛋白的增加就显著减弱，尽管PERK通路正常激活(图4b). 因此，p85α缺陷小鼠肝脏中IRE1α和ATF6α通路的激活以及内质网应激反应通路受损。体内，这与XBP-1剪接的改变无关(图4c).

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图4

对照组和L组肝脏UPR的评价-像素3r1^−/−老鼠。八周大时，雄性像素3r1^{液氧/液氧}或L-像素3r1^−/−小鼠通过腹腔注射给药载体或衣霉素（2.5μg/g B.W.）。a） 之后72(n个=4个/组）或b）短时间服用衣霉素，收集肝脏并制备组织裂解物。在通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF后，使用所示抗体进行免疫印迹。进行肌动蛋白免疫印迹以确认蛋白质载量相等。c） 通过对来自对照组和L-像素3r1^−/−小鼠用载药或衣霉素治疗4、8或12小时。引物被设计成侧翼从XBP-1转录本中切除的26 nt内含子。结果PCR产物用Pst I限制性内切酶消化并用琼脂糖凝胶电泳解析。

从L-像素3r1^−/−小鼠伴有UPR依赖性靶基因表达的改变。在对照小鼠的肝脏中，BiP mRNA在衣霉素治疗后增加了5倍（100±8.2 vs.579±131），而在L-像素3r1^−/−小鼠，BiP的增加减少了约50%，没有达到统计学意义(图5a). 同样，在对照动物中，衣霉素诱导p58增加3倍^IPK公司mRNA（100±10.1对288±39.6，第页<0.001），并且这种反应在L-像素3r1^−/−小鼠（88.2±5.2 vs.187±39，第页< 0.05).

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图5

肝组织中基因表达、XBP-1剪接和XBP-1稳定性分析像素3r1^{液氧/液氧}和L-像素3r1^−/−小鼠接受载药或衣霉素治疗72小时。(n个=5个/组）a）通过对来自像素3r1^{液氧/液氧}和L-像素3r1^−/−使用基因特异性引物的肝脏。b） 基于PCR的分析用于评估XBP-1剪接。c） 如前所述，通过定量PCR评估生理盐水和衣霉素处理（2.5μg/g BW）小鼠肝脏中的XBP-1剪接。d） 核裂解物像素3r1^{液氧/液氧}和L-像素3r1^−/−膜霉素（2.5μg/g BW）处理18小时后的小鼠通过SDS-PAGE分辨，并用XBP-1特异性抗体进行免疫印迹（上图）。使用Image J软件通过密度测定实现核XBP-1s蛋白的定量。数据以平均值±SEM表示，星号表示通过学生的t检验确定的统计显著性(*第页< 0.05; **第页<0.001)

在以下方面观察到一些差异体内和在体外研究。因此，在体内，PERK和Gadd34 mRNA水平在L-像素3r1^{液氧/液氧}和L-像素3r1^−/−衣霉素治疗后的小鼠。此外，衣霉素给药体内导致对照组和L组的XBP-1剪接增加-像素3r1^−/−老鼠(图5b、c). 另一方面，作为在体外在对照组中观察到，在衣霉素治疗后，细胞核XBP-1s蛋白增加17倍（100±39.4 vs.1749±74.4），在L-像素3r1^−/−老鼠(图5d). 因此，p85α的缺失并不平等地影响所有UPR依赖的通路，通路参与的程度可以受到细胞环境的其他方面的影响。

抗体

兔抗BiP、抗磷酸化-PERK（pPERK）、抗calnexin、抗IRE1α、抗PDI和抗Grp94来自Cell Signaling Technologies。兔抗钙网蛋白和抗PERK来自Abcam。兔多克隆抗磷酸IRE1α（S724）来自Novus Biologicals。兔多克隆抗XBP-1 CT来自Biolegend。单克隆抗ATF6来自Imgenex。单克隆抗-FLAG M2抗体来自Sigma Aldrich。HRP结合的抗肌动蛋白来自Santa Cruz Biotechnology，Inc。

哺乳动物组织培养、转染和样品制备

培养小鼠棕色前脂肪细胞、Huh7肝癌细胞和人胚胎肾293T（HEK 293T）细胞（37°C和5%CO）₂)并保存在添加链霉素/青霉素和10%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM）中。FAO细胞在相同条件下在添加链霉素/青霉素的Coon改良Ham’s F12培养基中培养。如制造商（Mirus Bio.）所述，使用Transit-Express在HEK293T细胞上进行80%的瞬时转染。处理后，将细胞在冰冷的PBS（pH 7.4）中洗涤两次，通过以2500rpm离心5分钟收集，并重悬于补充有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液（50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl，2mM EDTA，1%NP-40，0.1%SDS，0.1%Triton X-100）中。细胞提取物以14000 rpm在4°下旋转10分钟，以去除不溶性物质。

免疫沉淀和链霉亲和素沉淀

对如前所述制备的全细胞裂解物进行免疫沉淀。在添加蛋白酶抑制剂的免疫沉淀缓冲液（10 mM HEPES pH 7.9，100 mM NaCl，5%甘油，0.5%NP-40，0.1 mM EGTA，0.1 mM-EDTA，1 mM DTT，10 mMβ-甘油磷酸，10 mM-NaF）中稀释10倍的澄清的裂解物。用HA结合琼脂糖孵育两小时后，用免疫沉淀缓冲液洗涤免疫沉淀三次，并在通过SDS-PAGE分离之前，将其重新悬浮在莱姆利样品缓冲液中，转移到PVDF中，并使用所示抗体进行免疫印迹。使用相同的方案进行链霉亲和素沉淀，但使用链霉亲和力结合琼脂糖沉淀TAP-p85α除外。

定量RT-PCR分析基因表达

使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）纯化总RNA，并加入柱上DNA酶消化。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（应用生物系统）逆转录两微克总RNA。使用SYBR绿色PCR主混合物（Applied Biosystems）在ABI Prism 7500HT仪器上用特异性引物扩增一部分稀释的cDNA。作为内部对照，计算每个基因相对于TBP的mRNA表达。通过熔解曲线分析评估每对引物的分析保真度。定量PCR所用引物的核苷酸序列可根据要求提供。

重组腺病毒

对照组GFP腺病毒购自CellBioLabs。为了构建TAP-p85α重组腺病毒，将人p85α的全长cDNA连接到pNTAP，并根据标准AdEasy（Stratgene）协议生产腺病毒。

细胞凋亡分析

细胞与单独或含有2μM衣霉素或100μg/ml的生长培养基孵育⁻¹治疗24小时。在孵育期结束时，收集含有漂浮细胞的培养基。用PBS冲洗细胞，然后将PBS添加到含有浮动细胞的培养基中。用胰蛋白酶将附着的细胞重新悬浮，并与漂浮细胞混合。通过离心收集细胞，在PBS中清洗一次，然后再悬浮在400μl的结合缓冲液中（0.1 M HEPES，pH 7.4，1.4 M NaCl，25 mM CaCl₂). 然后用5μl膜联蛋白V偶联到PE（BD Biosciences，San Jose，CA）和2.5μg/ml培养细胞⁻¹室温下碘化丙啶15分钟，并提交FACS分析。

动物

所有动物都被安置在一个12小时的光-暗循环中，并喂食标准的啮齿动物食物。Joslin糖尿病中心和哈佛医学院的动物护理使用委员会根据国家卫生研究院指南批准了所有动物使用、突尼斯霉素给药和安乐死方案。研究中使用的所有小鼠均为129Sv-C57BL/6混合遗传背景。如前所述，以2.5μg/g BW的最终剂量在生理盐水/150 mM葡萄糖溶液中通过腹腔注射给予管霉素⁶⁰.通过腹腔注射给对照动物生理盐水/150mM葡萄糖。

肝脏免疫印迹分析

在组织匀浆缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.4，10 mM Na）中制备肝蛋白_三VO（旁白）₄，100 mM氟化钠，50 mM钠₄P（P）₂O（运行）₇，10mM EGTA，10mM EDTA，1%NP-40，0.1%SDS）补充蛋白酶抑制剂。不溶性蛋白质通过55000 rpm离心清除，清除的裂解液的蛋白质浓度通过Bradford方法测定。所有蛋白表达数据均使用NIH Image J软件通过密度测定进行量化。

我们希望D.Ron（洛克菲勒）提供FLAG-XBP-1u和FLAG-XBP-1s表达质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款DK55545和美国国立卫生研究院培训拨款DK07260-30的支持，以及Joslin DERC拨款DK36836的核心实验室支持。我们还要感谢Umut Ozcan博士提供的有用建议和讨论，以及Sarah Green和Shannon Flaherty在编写这份手稿时提供的帮助。