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J签证费用。2014; (90): 51653.
2014年8月12日在线发布。 数字对象标识：10.3791/51653
预防性维修识别码：PMC4356350磅
PMID：25145470

利用可水解交联腺病毒载体从金属支架表面转移血管基因

伊利亚·菲什宾,1 斯科特·福布斯,1 理查德·阿达莫,1 迈克尔·乔尼,1 罗伯特·J·利维,1和伊万·阿尔弗雷耶夫1
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

原位再狭窄是广泛用于重建冠状动脉和外周动脉严重狭窄段血流的支架重建术的主要并发症。血管内支架能够调节释放具有抗再狭窄活性的基因，可能是目前使用的药物洗脱支架的替代策略。为了实现临床转化，基因溶解支架必须表现出可预测的支架固定化基因载体释放动力学和血管系统的定点转导，同时避免与用于载体物理包埋的聚合物涂层典型相关的过度炎症反应。本文描述了一种将腺病毒基因载体无涂层连接到支架上的详细方法，该方法基于腺病毒颗粒通过可水解交联剂（HC）与聚烯丙基胺二磷酸盐（PABT）修饰的不锈钢表面的可逆结合。具有平均t的双官能团（胺和硫醇反应）HC家族1/2链内酯水解时间为5至50天，用于将载体与支架连接。载体固定程序通常在9小时内进行，包括几个步骤：1）在PABT水溶液中培养金属样品（4小时）；2） 用三（2-羧乙基）膦对PABT中的硫醇基团进行脱保护（20分钟）；3） 通过样品与吡啶二硫代（PDT）衍生的聚乙烯亚胺反应，扩大金属表面的硫醇反应能力（2小时）；4） 用二硫苏糖醇将PDT基团转化为硫醇（10分钟）；5） 用HC修饰腺病毒（1小时）；6） 通过大小排阻柱色谱纯化修饰腺病毒颗粒（15min）和7）将巯基反应性腺病毒颗粒固定在硫化钢表面（1hr）。通过促进生物假体设备的表面工程，通过将底物介导的基因传递到与植入的异物界面相连的细胞来增强其生物相容性，该技术在支架之外具有广泛的潜在适用性。

关键词：医学，第90期，基因治疗，生物结合，腺病毒载体，支架，局部基因传递，平滑肌细胞，内皮细胞，生物发光成像

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介绍

基因治疗载体的靶向性较差，阻碍了基因治疗作为一种治疗方式的有效性1,2缺乏适当的靶向性导致转基因在靶位的亚治疗水平表达，并导致载体广泛传播到非靶器官三包括那些对载体和编码治疗产品产生免疫反应的人4,5一种抵消转导混乱和促进靶向性的潜在方法是在所需位置引入基因载体，以阻止其通过血液和淋巴自由传播。通常，这种努力依赖于局部注射给药系统，该系统由病毒载体或非病毒载体与纤维蛋白、胶原或透明质酸水凝胶基质混合而成6-10通过将基因载体物理包裹在聚合物网络中，能够在注射部位暂时维持基因载体。

另一种普遍接受的局部基因治疗模式是在植入的假体表面固定基因载体11,12.永久性医用植入物（血管内、支气管、泌尿和胃肠支架、起搏器、人工关节、手术和妇科网片等）每年用于数千万患者13虽然这些设备通常是有效的，但容易出现当前医疗实践无法充分控制的并发症14-17植入式假体设备提供了一个独特的机会，可以作为局部基因治疗的代理平台。从药代动力学角度来看，基因载体输入剂量相对较低的医用植入物的表面衍生化导致植入物/组织界面上的基因载体局部浓度较高，并减缓其从该位置消除的动力学。由于目标细胞群的长期驻留和吸收增强，载体固定化将基因载体的传播降至最低。因此，减少了非靶组织的无意接种。

基因载体在可植入生物材料上的表面系留（也称为基质介导的基因传递或固相基因传递）已在细胞培养和动物实验中使用特异性（抗原抗体）实现18-20，鸟苷-生物素21,22)和非特定23-26（电荷，范德华）相互作用。载体与植入装置表面的共价连接先前被认为是非功能性的，因为与表面的过度紧密结合阻止了靶细胞对载体的内化。最近有研究表明，通过使用可自发水解的交联剂作为支架修饰金属表面和腺病毒载体衣壳蛋白之间的系链，可以克服这一限制27,28此外，载体释放率和转基因表达的时间进程在体外和体内可以使用具有不同水解动力学的可水解交联剂进行调节28.

本文提供了腺病毒载体与活性金属表面可逆共价连接的详细方案，并介绍了一种用于研究后续转导事件的有用实验装置在体外在培养的平滑肌和内皮细胞中，以及体内在大鼠颈动脉支架成形术模型中。

协议

1.用于释放实验的Cy3标记腺病毒的制备

  1. 悬挂2 x 1012广告颗粒空的（约2 x 1011感染单位）。
  2. 溶解1小瓶（0.2 mg）胺反应荧光染料（Cy3（NHS））的含量2)加入1 ml CBB至最终浓度0.2 mg/ml。
  3. 将100µl染料溶液添加到病毒悬浮液中，涡流5秒，并在28°C下摇晃培养1小时（100-200 rpm）。
  4. 用PBS平衡20 ml Sepharose 6B柱。向凝胶床中心滴加750µl Cy3-标记的Ad悬浮液。
  5. 病毒悬浮液渗透树脂后，加入5毫升PBS。丢弃洗脱液。
  6. 添加0.5 ml PBS，并将洗脱液收集在带标签的玻璃容器中。重复此步骤10次，共收集10个0.5 ml的组分。
  7. 通过分光光度法（260和280 nm）分析收集的组分中的病毒DNA含量。
  8. 将含有超过总（F1至F10之和）光密度（OD）10%的部分聚集在260 nm处。注：通常将分数F3、F4、F5和F6混合在一起。
  9. 通过分光光度法（260和280 nm）和荧光测定法（550前任/570相对长度单位nm）分别用于病毒DNA含量和Cy3标记衣壳蛋白。注：A Cy3（NHS）2覆盖10的校准曲线-9-10-13制备mol/L范围，并在与混合组分相同的平板上进行荧光分析。
  10. 计算标记病毒产量和标记密度。假设1.19 x 1012病毒颗粒/ml相当于1 cm路径长度的1 OD单位29使用公式：屈服=[（OD260纳米/1.19)*1012*V/输入广告量]*100，其中，OD260纳米是合并制剂在260nm处的光密度，V是合并制剂的体积（ml）以计算Ad回收率（%）。使用公式：标签密度=C*6.02*1023/（外径260纳米/1.19)*1012式中，C是混合配方的Cy3浓度（摩尔/毫升）和OD260纳米是合并制剂在260nm处的光密度，以计算平均Cy3标记密度。注：标记病毒的典型回收率大于输入剂量的70%。标记密度为每个病毒颗粒600-800个荧光分子。
  11. Aliquot Cy3-标签广告空的分成较小的部分（通常为5 x 1011颗粒）适用于单独的释放实验。注：当前协议规定仅在释放实验中使用Cy3-标记的Ad。所有的转导研究都是用非标记载体进行的。

2.金属样品的活化

  1. 在55°C下，在异丙醇（5 min x 2）和氯仿（5 min x 2）中，摇晃（100 rpm），连续清洗不锈钢网片或不锈钢支架。清除溶剂。
  2. 在200°C下加热样品30分钟。
  3. 溶解含有潜在硫醇基团（PABT）的聚烯丙胺二膦酸盐27,28,30)在72°C的水中（1-2%w/v），摇晃（100 rpm）。用KHCO调节pH至4.5-5三.
  4. 将金属样品在PABT溶液中在72°C下摇晃培养2-4小时（100-200 rpm）。注意：此过程可能会暂停。样品在4°C下稳定3天。
  5. 用双蒸馏水（DDW）冲洗样品三次。
  6. 将样品在28°C下暴露于三（2-羧乙基）膦（TCEP；0.1M醋酸缓冲液中的15 mg/ml）中15分钟，并摇晃（100-200 rpm）。
  7. 在脱气DDW中冲洗5次。
  8. 将样品暴露于含有吡啶二硫代基团（PEI）的2%聚乙烯亚胺中PDT（PDT）27,28,30)在28°C的氩气气氛中，在脱气DDW中摇晃2小时（100-200 rpm）。注意：此过程可能会暂停。样品在4°C下稳定2周。
  9. 用DDW冲洗样品三次。
  10. 将样品暴露于10 mg/ml二硫苏糖醇/DDW中，以将吡啶二硫基团转化为硫醇。
  11. 在脱气DDW中再次冲洗5次。

3.腺病毒活化和金属表面固定化

  1. 悬挂5 x 1011任一Ad的粒子电子GFP或广告吕克（约5 x 1010感染单位）在487.5-495µl碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液（CBB；pH 9.3）中。注：对于发布研究，使用5 x 1011Cy3的Ad标签空的颗粒（使用CBB将体积调节至487.5-495µl）。
  2. 以不同的水解速度溶解HC28[（迅速（t1/2=5 d），中间（t1/2=12 d），缓慢（t1/2=50天）HC，即RHC、IHC或SHC；图1]或非水解交联剂（NHC），20 mM CBB中的磺化LC-SPDP。
  3. 立即向病毒悬浮液中添加5-12.5µl交联剂溶液，总体积为500µl（200-500µM交联剂最终浓度），涡流并在28°C下摇晃培养1小时（100-200 rpm）。
  4. 用脱气的5mM EDTA/PBS（EPBS）平衡20ml Sepharose 6B柱。向树脂床中心逐滴添加500µl交联改性Ad悬浮液。
  5. 添加5 ml脱气EPBS。丢弃洗脱液。
  6. 添加0.5 ml脱气EPBS，并将洗脱液收集在贴有标签的玻璃容器中。重复此步骤10次，共收集10个0.5 ml的馏分。
  7. 在260 nm和280 nm处使用分光光度法测定收集部分的OD，并将OD转换为病毒滴度（1.19 x 1012/ml对应于1 OD）29.
  8. 将含有>10%洗脱病毒的组分混合（注：通常为F3-F6组分）。对混合悬浮液重复分光光度滴定分析。
  9. 将病毒悬液转移到带有活性金属样品的小瓶中（按照2.11）。在28°C的氩气环境中培养1小时，摇晃（100-200 rpm）。注：本步骤中获得的Ad-tethered金属样品将进一步用于方案第5-7节所述的后续释放和转导实验。

4.用PCR定量分析表面相关Ad载体

  1. 制备表面固定化Ad配制的网格电子GFP如第2节和第3节所述，通过NHC、SHC、IHC和RHC栓系（每种类型n=3）。
  2. 使用QIAamp DNA Micro试剂盒分离病毒DNA。将网格分别放入含有200µl混合物的1.5 ml塑料管中，混合物由180µl ATL缓冲液和20µl蛋白酶K组成（均来自试剂盒）。添加已知数量的广告电子GFP颗粒（作为校准曲线的标准）进入含有相同混合物的单独管中。在56°C下培养过夜，不要摇晃。
  3. 加入200µl AL缓冲液（来自试剂盒），通过涡流混合，加入200µl 100%乙醇，并在室温下孵育5分钟。
  4. 将每个试管中的混合物转移到单独的MinElite色谱柱上（从试剂盒中），以8000 rpm的转速旋转1分钟。用180µl新鲜ALT缓冲液冲洗含有网孔的试管，添加到各自的色谱柱上，以8000转/分的转速旋转一分钟。丢弃洗脱液。
  5. 向色谱柱中添加500µl AW1缓冲液（来自试剂盒），并以8000 rpm的转速旋转1分钟。丢弃洗脱液。
  6. 向色谱柱中添加500µl AW2缓冲液（来自试剂盒），并以8000 rpm的转速旋转1分钟。
  7. 丢弃洗脱液。
  8. 以14000 rpm的转速再旋转3分钟，直到柱完全干燥。丢弃洗脱液。
  9. 向柱中加入50µl MilliQ级水。以14000 rpm的转速旋转5分钟。从每个柱中收集50µl洗脱液到单独的收集管中（从试剂盒中）。
  10. 通过组合以下物质的倍数制备PCR主混合液（12.5µl Power Sybr Green PCR主混合，0.63µl 10µM eGFP感测引物[5'-ACG TAA ACC GCC ACA AGT TC-3']，0.63¦Μl 10微米eGFP防感引物[5’-AAG TCG TGC TTC ATG TG-3']和6.3µl MilliQ级水）。将这些体积乘以计划反应的数量，包括“无DNA”对照。
  11. 加载5µl Ad电子GFPDNA（来自步骤4.8）和20µl PCR Master Mix放入MicroAmp光学96 well反应板的三个孔中。用MicroAmp光学胶膜密封板。以1000 rpm旋转板1分钟，以消除气泡。
  12. 将板放入7500 Real-Time PCR引擎的插座中。在7500系统SDS软件（v1.4或更高版本）的主菜单中，选择“创建新实验”。单击“下一步”。在“新建实验向导”屏幕中，从向下滚动菜单中选择Sybr Green，然后单击“添加”。单击“下一步”以获得板的布局。突出显示要分析的所有井，选择Sybr Green。连续强调无DNA控制井，Ad电子GFPDNA标准和未知数，并使用滚动菜单中的相应名称进行标记。
  13. 切换到仪器选项卡。选择“添加离解相”，将微孔体积从默认的50µl更改为25µl。单击开始。
  14. 检查QC总结中的异常值和其他异常情况后，使用PCR结果进行分析。

5.模型钢网中可水解交联矢量颗粒的释放动力学

  1. 通过RHC、IHC、SHC和NHC（根据3.9）在1%BSA/PBS（1小时x 3）中摇晃（100-200 rpm），清洗用Cy3-标记的Ad衍生的网格样品。
  2. 使用无菌细镊子，将网格放入预先填充200µl洗脱缓冲液（0.1%BSA/0.1%吐温-20/PBS）的96 well板的各个孔中。
  3. 拍摄每个网格中心部分的荧光图像。记录用于图像采集的显微镜和CCD相机的设置。
  4. 用荧光法分析平板（550前任/570相对长度单位)在井扫描模式下，最大限度地减少。使用具有非衍生网格的井作为背景控制。
  5. 在37°C下摇晃培养皿（50 rpm）。
  6. 在预定时间（1-30天范围内）抽吸洗脱缓冲液而不干扰筛孔，并添加200µl新鲜洗脱缓冲溶液。更换缓冲器后，重复步骤4.3-4.5。

6.通过网状物固定的Ad载体对培养细胞的转导

  1. 清洗广告电子GFP-或广告吕克-衍生网格用无菌PBS三次摇晃5分钟（100 rpm）。
  2. 使用精细的无菌镊子逐个取出网片，并将其分别放入96个板的孔中，板上的细胞类型与生长对数期的相关。
  3. 在37°C、5%CO中培养细胞24小时2.
  4. 使用各自的非终点测定法（荧光显微镜、eGFP荧光测定法或萤光素酶生物发光成像法）来确定孔中基因表达的程度和空间分布。
  5. 或者，如果预期eGFP表达较低，用PBS替代培养基以提高荧光分析的灵敏度（485/535 nm）。注：如果荧光计配备良好扫描功能，则以良好扫描模式读取平板，以评估表达eGFP的细胞在微孔中的空间分布。完成荧光测定后，将PBS换成培养基。
  6. 用Ad成像微孔中的转导细胞电子GFP-使用FITC过滤器组洗脱网格（网格下方和外围）。以40-200倍的放大倍数拍摄代表性图像。记录用于采集图像的荧光显微镜和CCD相机的精确设置。
  7. 直接向含Ad的孔中添加5µl PBS中的荧光素储备（10 mg/ml）吕克-洗脱网孔至最终浓度500µg/ml，并在37°C和5%CO下培养2在生物发光成像之前持续10分钟。抽吸培养基，成像后用无荧光素培养基替换。
  8. 在预定时间（最多2周）重复终点检测，以研究底物介导的基因转移后报告基因表达的动力学。

7.延迟时间点保留转导能力的验证

  1. 准备广告电子GFP使用RHC、IHC、SHC和NHC衍生网格用于载体系留（根据2.1-2.11和3.1-3.9），并将网格单独放置在含有60-80%汇合牛主动脉内皮细胞（BAEC）的96 well板孔中。
  2. 用网状固定化Ad分析培养BAEC的转导电子GFP在网格放置后1天和2天，使用荧光显微镜和荧光测定法（按照6.4-6.5）。
  3. 转导开始后48小时，用PBS冲洗两次含网孔。
  4. 向每个孔中添加200µl 0.25%胰蛋白酶/EDTA，并在37°C下摇晃培养15分钟（100 rpm）。用PBS清洗3次。
  5. 使用荧光显微镜和荧光测定法确定与网格相关的所有eGFP阳性细胞是否完全去除。
  6. 以60-80%初始播种密度（2-2.7 x 104细胞/孔）。
  7. 在37°C和5%CO下培养平板2在通过荧光显微镜和荧光测定法评估“新”转导事件之前的预定时间段（1-10天）。

8.在支架血管成形术大鼠颈动脉模型中部署黏附支架

  1. 本方案中描述的所有动物程序均符合联邦实验室动物使用规定，并经费城儿童医院IACUC批准。为了遵守无菌手术条件，所有器械都经过高压灭菌。为了确保连续无菌，在连续使用五只动物的仪器之间使用珠状消毒器。
  2. 准备广告吕克-符合2.1-2.11和3.1-3.9的洗脱支架。使用前，将病毒衍生支架存放在4°C的无菌PBS中不超过24小时。
  3. 用IP注射氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（5 mg/kg）麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠（400-450 g）。通过爪子夹持反应和肌肉张力确定麻醉深度。使用眼科兽医软膏，防止角膜和巩膜干燥。注：4%和2%异氟烷（1L/min）的吸入麻醉分别用于诱导和维持麻醉是可能的，但会阻碍动物颈部的自由进入，因此不建议经验不足的使用者使用。
  4. 通过捏脚趾重新评估麻醉深度。剃掉颈部和上胸部区域的毛发并进行无菌处理。服用抗生素（头孢唑林；20 mg/kg；IM）、止痛药（美洛昔康；0.5 mg/kg；SC）和生理盐水（10 ml/kg；SC。用24G导管引导尾静脉，并注射肝素（200 IU/kg；静脉注射）。注：可使用10 mg/kg（IM）恩诺沙星（拜有利）代替头孢唑林。避免使用对革兰氏阳性菌缺乏明显活性的抗生素。可使用10-15 mg/kg卡普洛芬（利马威）代替美洛昔康作为先发制人的止痛药。麻醉性镇痛药(例如吗啡、丁丙诺啡）应避免使用，因为它们具有呼吸抑制作用。
  5. 通过皮肤和颈部筋膜进行中线切口。使用钝性解剖技术分离左颈外动脉。在最远端可接近的部位结扎颈外动脉。在颈内动脉起始处应用滑动式临时结扎。
  6. 在左侧颈外动脉做一个2毫米的动脉切开切口。
  7. 通过颈外动脉的切口，将2个法式Fogarty导管插入颈总动脉。用生理盐水对导管尖端充气，并从主动脉弓向颈动脉分叉处通3次，以剥除内皮。
  8. 将一根管子（外径1.04 mm，内径0.99 mm）滑到Fogarty导管上，进入颈总动脉。拔出Fogarty导管。
  9. 安装并压接广告吕克-直径为1.5mm的血管成形术导管气球上的衍生支架。将支架穿过特氟隆管插入颈总动脉中段。避免支架与管道或血管壁摩擦。
  10. 在12大气压下放置支架30秒，然后拔出血管成形术导管。
  11. 结扎动脉切开部位近端的颈外动脉，松开颈内动脉上的临时结扎。
  12. 用4.0 Vicryl缝合线分层修复手术伤口，并缝合皮肤。
  13. 将动物放在保温垫上，直到走动，然后放回隔离的笼子。虽然术后动物在手术后的前12小时内通常没有疼痛或不适的迹象，但考虑延长美洛昔康治疗72小时（0.5 mg/kg，SC每日）。

9.动脉基因表达的生物发光成像

  1. 在颈总动脉内植入基因溶解支架后的预定时间点（1天到3周），使用异氟醚吸入麻醉（2-4%异氟醚氧气）麻醉大鼠。
  2. 取出手术钉，无菌地准备好手术部位并重新打开手术伤口。使用钝性解剖，重新进入左颈总动脉，并将其与迷走神经和邻近结缔组织分离。
  3. 制备PBS中50 mg/ml荧光素和PBS中25%Pluronic F-127的混合物（1:4 v/v），并将其储存在冰上。注：该配方在4°C下呈粘性溶液，在37°C下与组织接触后立即变成凝胶。
  4. 将200µl冷冻的荧光素/Pluronic混合物直接涂敷于颈总动脉暴露段，并验证凝胶的坚固性。
  5. 将动物置于IVIS-Spectrum仪器成像室中的仰卧位，并用面罩维持异氟醚麻醉。
  6. 在采集控制面板窗口（实时图像，4.2版或更高版本）中，分别从名为“视野”和“装箱”的下拉菜单中选择位置“B”（6.6厘米相机到物体的距离）和装箱系数“中等”。在主体高度框中键入“2.5 cm”。在“曝光时间”框中选择“min”作为时间单位，并选择数值“2”。
  7. 使用Luciferin/Pluronic凝胶三分钟后，点击屏幕上的“采集”按钮开始图像采集。注：根据预期的信号强度，图像采集时间可能从1分钟到6分钟不等。
  8. 获取图像后，用生理盐水洗掉凝胶，并用无菌纱布和棉花涂抹器轻拍动脉周围间隙。
  9. 用Vicryl缝合线缝合伤口并缝合皮肤。
  10. 找回动物并返回笼子。在随后的时间点重复成像，以研究支架固定化Ad载体引起的动脉表达的时间进程。
  11. 或者，在全身注射荧光素后进行成像。按照9.1-9.2对动物进行麻醉和准备。用24G导管引导尾静脉，用手术胶带固定导管。
  12. 在PBS中制备荧光素溶液（50 mg/ml），并每隔10秒通过导管注入1 ml溶液。注射后一分钟，按照9.7-9.8开始图像采集。注：更快的注射速度（＜10秒）会引起癫痫发作和呼吸停止。如果在成像过程中出现癫痫发作或呼吸停止，必须对动物实施安乐死。
  13. 遵循步骤9.10。

具有代表性的结果

媒介释放实验

将腺病毒载体粘贴到植入物表面，包括血管内支架等介入设备，使载体接近疾病部位，部分避免了载体缺乏物理靶向性。然而，为了通过靶组织的转导达到治疗效果，载体必须从表面释放出来(图2). 假设使用可水解交联剂可使载体有效附着到聚二膦酸盐修饰的硫醇安装金属植入物上，以及2）通过交联剂水解介导的持续释放。

Ad的基因组拷贝数电子GFP衍生程序结束时与网片相关的载体通过使用eGFP特异性引物对病毒DNA进行PCR来确定(图3). 根据使用的特定交联剂，结合Ad载体的量应在3.5 x 10之间变化9和5.7 x 109颗粒/网格。该金额与估计的最大容量（2.5 x 109)总面积为0.25 cm的单网格圆盘2以单层排列容纳100-nm Ad颗粒。由于交联剂改性步骤中Ad载体的起始量为5 x 1011粒子，只有约1%的修饰载体最终固定在PABT/PEI上PDT（PDT）-衍生不锈钢表面。

链内酯水解速率和载体与生物材料之间的链接数预计都会影响Ad载体从表面释放的整体动力学。

为了促进释放实验，在交联剂修饰和表面固定化（方案；第3节）之前，可以用Cy3荧光团预标记腺病毒颗粒（方案；第1节）。荧光测定法同时评估表面相关荧光随时间的减少(图4A)和荧光显微镜(图4B)然后可以作为一种间接方法来监测载体释放到生理缓冲液中。通过RHC和IHC链接连接的广告载体的释放速度应明显快于SHC和NHC连接的载体。在给定的例子中，到第30天，用RHC和IHC系留的载体分别观察到45%和39%的表面相关载体损失，而在SHC和NHC固定的样品中观察到只有不到20%的系留载体被释放(图4A).

此外，通过使用不同浓度的相同HC固定化的Ad载体，因此可能载体和金属基质之间的系链数量不同，载体释放动力学也不同。事实上，使用0.1 mM RHC进行载体修饰后，释放速率明显快于使用0.5 mM RHC-固定的载体(图4A). 荧光显微镜数据(图4B)与基于荧光测定法的定量载体释放分析有很好的相关性，表明使用IHC-、RHC-和特别是低浓度RHC-系留载体配制的网状样品与NHC-和SHC-系带对应物相比，表面相关荧光的降低更快、更深入。

体外 网状固定广告载体的转导

通过与定量表达分析（荧光测定）和空间观察（荧光显微镜）兼容，Ad电子GFP是监测用游离和网状固定化Ad载体处理的SMC和内皮细胞培养物中转导的首选报告载体。RHC对Ad衣壳的化学修饰(图5)以及浓度超过75µM的其他交联剂（未显示）显著损害非固定化载体的转导效率在体外最有可能是由于Ad利用纤维结域的掩蔽和重新配置，通过柯萨奇腺病毒受体（CAR）与细胞结合。然而，knob-CAR相互作用的作用对于与底物固定载体的转导不太重要，因为载体通过与底物的系留留在靶细胞附近。在细胞培养实验中，无论HC类型如何，网状相关Ad载体始终能够在空间上限制对距离网状边界300-500µm内的细胞的转导事件(图6A和6摄氏度). 通常，在植入Ad后3-5天达到转基因表达的峰值电子GFP-将网格加载到SMC中(图6A和6亿)或BAEC(图6C和第6天)文化。在相同载体负载下，eGFP的峰值表达水平按以下顺序增加：NHC-、SHC-、IHC-和RHC-系留载体，反映了它们各自释放动力学曲线的差异(图4). 此外，与使用RHC配方的对应物处理的细胞相比，使用IHC配方的网格处理的细胞中观察到更持久的转基因表达(图6D).

所使用的细胞培养系统提供了一种方便的装置，用于研究在放置网格后48小时或之后从金属表面释放的载体颗粒所引起的延迟转导事件。在本申请中，在转导开始后48小时通过荧光测定法和荧光显微镜测定eGFP表达后，对BAEC进行胰蛋白酶化并从微孔中抽吸出来，而不干扰网孔。然后在部分释放的网格上重新镀上刚通过的非转导BAEC。然后通过荧光显微镜和荧光测定法评估2天时间点后从网状载体释放的病毒颗粒引起的“新”转导事件(图7A和7亿). 在这些“新”文化中，通常可以观察到稳健的eGFP表达，表明网格区域的特征空间限制(图7)，证实即使在37°C的完整细胞培养基中暴露48小时后，网状Ad载体的转导能力仍保持良好。

体内 研究

为了研究使用不同HC对动脉转导的潜在影响，动物植入Ad吕克-用RHC-、IHC-、SHC-和NHC修饰载体制备的洗脱支架在支架部署后1天和8天进行生物发光成像(图8). 在血管周围局部注射荧光素（2 mg）与Pluronic凝胶共同配制后进行成像。这种配方在冰上冷冻时是一种粘性流体，但在37°C下与组织接触时，会立即发生凝胶相变。初步实验（未显示）表明，血管周围释放荧光素可在Ad中产生更稳定和可重复的发光信号吕克-与全身（腹腔内或静脉注射）荧光素给药相比，转导的血管组织。

如果病毒附着在支架上和支架置入手术在技术上是合理的，则会发出并记录与大鼠颈动脉支架段相对应的明确信号。支架植入后一天，动物接受RHC配方的Ad治疗吕克支架通常显示出最高的发光信号，其次是接受IHC和SHC配方支架的大鼠(图8A和8B类). 在植入NHC-栓系Ad制备支架的大鼠组中未观察到明显信号吕克，强调了支架无阻碍释放载体对血管组织有效转导的重要性(图8A和8B类). 到第8天，RHC支架的荧光素酶平均表达强度下降了几倍，而IHC和SHC支架的平均表达强度分别增加了1.4倍和1.8倍(图8A和8B类). 这一发现与基因溶解支架更持久的血管转导假说相一致，基因溶解支架从支架表面释放载体的动力学较慢。

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图1。所述研究中使用的交联剂（NHC、SHC、IHC和RHC）的结构公式（经许可修改28).

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图2。一种表示连接到PABT/PEI的Ad矢量的方案PDT（PDT）-通过HC对不锈钢表面进行改性，然后在交联剂水解后释放载体（经许可修改28).

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图3。基于PCR的Ad定量电子GFPPABT/PEI表面交联剂固定化PDT（PDT）-改良不锈钢网。不锈钢网采用Ad电子GFP通过RHC、IHC、SHC或NHC固定（每种情况n=3）。蛋白酶K处理后，用MinElute柱洗脱和纯化病毒DNA。使用eGFP特异性引物在7500实时PCR引擎中扩增病毒DNA，并用Sybr Green检测。数据标准化基于使用已知量的非固定化Ad制备的校准曲线电子GFP（经许可修改28).

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图4。含HC的金属基质上Ad载体的释放动力学。不锈钢网格衍生为~2 x 109粘附在PABT/PEI上的Cy3-标记的Ad颗粒PDT（PDT）-使用500µM NHC、SHC、IHC、RHC和100µM RHC（指定为RHC-L）改性后的改性表面。在指定的时间点，通过以下方法研究荧光标记Ad颗粒的释放(A类)550/570nm的阱扫描荧光测定法和(B类)荧光显微镜（罗丹明滤镜组；原始放大200倍）。荧光测定结果以平均值±SEM表示，n个= 8-10; NHC和SHC与IHC、RHC和RHC-L组之间的所有比较p<0.001由Anova通过事后Tukey测试（经允许修改）确定28).

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图5。非固定化Ad的转导效率电子GFP使用RHC进行以下修改。在MOI为1000时用未修饰的Ad转导大鼠胚胎主动脉衍生SMC（A10系）电子GFP或用RHC修改的矢量，如图所示。转导后48小时用荧光法（485/535 nm）测定报告基因的表达（经允许修改）27).

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图6。用含HC的不锈钢网固定Ad载体转导培养的SMC和BAEC。网格衍生为~2 x 109广告电子GFP通过NHC、SHC、IHC和RHC添加的颗粒。然后将网格单独放置在亚汇合A10的顶部(A类,B类)和BAEC(C类,天)单层。通过荧光显微镜评估经Ad载体栓系网处理的细胞的转导（表达为eGFP表达水平）(A类,C类; FITC过滤器组；原始放大100倍）和良好扫描荧光测定(B类,天). 荧光测定结果以平均值±SEM表示，n个=4（经许可修改28).请单击此处查看此图的放大版本。

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图7。底物固定化Ad载体在延迟时间点的转导能力。广告电子GFP通过NHC、SHC、IHC或RHC系索固定在钢网上。将网格放置在次流BAEC单层上。放置两天后，对BAEC进行胰蛋白酶处理，并在不干扰网孔的情况下将其取出。然后在网格上播种新的、未转染的BAEC。广告电子GFP用荧光显微镜通过eGFP的表达测定转导能力(A类; FITC过滤器组；原始放大100倍）和荧光测定(B类). 在指定的天数进行测量，使用代表性图像，荧光测定结果为平均值±SEM，n个=4（经许可从修改28).请单击此处查看此图的放大版本。

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图8。支架固定化Ad的转导效率吕克体内.广告吕克（1.3 x 1010颗粒）通过NHC、SHC、IHC或RHC固定在血管内支架上（所有组均为3-4个）。广告的传播效率吕克支架置入后1天和8天通过生物发光成像（IVIS光谱）测量支架的洗脱(A类)，并使用对数刻度绘制(B类)（经许可从修改28).请单击此处查看此图的放大版本。

讨论

本方案描述了一种通过将腺病毒载体可逆附着到无涂层不锈钢表面来实现底物介导基因传递的操作方法。虽然该技术是为血管再狭窄的支架基因治疗的特定目的而开发的，但在生物材料、生物医学植入物和基因治疗领域有着更广泛的应用。

尽管目前的研究仅使用不锈钢作为典型的金属基底，但PABT以类似的亲和力结合其他金属合金，如钴/铬和镍钛醇（未发表）。PABT与金属的无差别相互作用大大扩展了该技术的潜在生物医学应用数量31此外，尽管需要其他方法将巯基安装到材料表面上，但使用HC-醚化基因载体对其他类型的生物材料是可行的。

虽然Ad基因载体在许多人类细胞类型和组织中实现了强大的转导，但其临床意义受到由腺病毒科4为此，最近显示（未发表）使用HC修饰荧光素酶表达腺相关病毒载体制备的基因洗脱支架延长（4个月）动脉表达。

该方法是稳健的。与主要方案的微小偏差通常不会导致基因表达的显著改变在体外和体内然而，确定了可能影响结果的几个关键问题。

首先，顾名思义，由于链内酯的水解，可水解交联剂在与水反应时可裂解。此外，胺反应部分，N个-磺基琥珀酰亚胺基也是可水解的。交联剂应储存在-20°C的氩气气氛中，以保持其活性。出于同样的原因，在制备HC溶液（方案第3.2节）后，立即向病毒制剂中添加HC溶液。

其次，在所述生物共轭序列的几个中间步骤中，金属表面形成的硫醇基团被环境空气氧气快速氧化。为防止出现这种情况，应始终将易损金属样品浸没在脱气水中。

第三，成功的转导需要网格与井底完美对齐。搬运过程中不要弯曲网片。

第四，在支架置入过程中，避免基因溶解支架与聚四氟乙烯鞘和血管壁过度摩擦，以防止表面相关Ad载体移位。

基因载体与可植入生物材料表面的共价连接相比，具有明显的优势，可以更好地控制载体释放动力学。在从支架平台进行基因传递的情况下，大多数研究报告在支架置入后1-7天内病毒和非病毒载体完全释放32-34另一方面，通过HC固定Ad载体证明在第一个月仅释放了20-45%的载体负载(图4A和4B类). 此外，通过使用表现出不同水解动力学的不同HC或通过改变用于病毒表面修饰的HC浓度，可以部分调节释放和转导动力学。此外，载体与不同交联剂分子的同时共修饰，虽然在本研究中没有探索，但为微调载体释放和转导提供了另一个机会。

披露

本文中提出的方案制定和研究部分得到了美国心脏协会科学家发展基金（I.F.0735110N和M.C.10SDG4020003）、美国国家心脏、肺和血液研究所HL 72108（R.J.L.）和美国国家心脏肺和血液研究所T32 007915（S.P.F.）的支持。NuMED（纽约州霍普金顿）捐赠了血管成形术导管。作者谨感谢苏珊·克恩斯女士的秘书协助。

致谢

作者没有可供披露的竞争性财务利益。

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