肝星状细胞有助于祖细胞和肝再生

HSC移植（2AAF/部分肝切除模型）。

从雄性eGFP中新鲜分离的HSC⁺通过部分肝切除术（PHX），在肝损伤后立即通过尾静脉注射将联合密度梯度离心和维甲酸依赖性FACS获得的大鼠移植到雌性野生型（WT）大鼠体内。用2AAF预处理宿主动物7天，以抑制成熟肝细胞的增殖并诱导以干细胞为基础的肝再生。我们研究了移植eGFP的定位⁺肝再生7天和14天后，通过eGFP免疫荧光检测宿主肝中的HSC。我们在WT对照肝脏中未发现明显的eGFP染色（图​（图2A），2A） 而eGFP表达细胞主要在接受eGFP的受损大鼠肝脏（2AAF/PHX模型）的门静脉区检测到⁺HSC（图​（图2，2、B和C）。我们评估了eGFP的丰度⁺男性特异性性别决定区Y的定量PCR分析(斯里)DNA和电子GFPmRNA（图​（图2，2、D和E）。大约60%的宿主动物接受了eGFP⁺HSC表现出可测量性斯里DNA或电子GFPmRNA水平。星形细胞移植的女性宿主肝脏显示，约10%至14%的肝细胞来源于移植的男性eGFP⁺再生7天和14天后的HSC，而通过qPCR在宿主肝脏中检测不到HSC植入（图​（图2，2移植后1天，D和E）和肺（未显示）(n个= 5). 传统的半定量逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）显示eGFP的存在⁺移植后1天宿主肝脏中的HSC（未显示）。这个电子GFP不同动物间WT宿主肝脏中的mRNA水平在6%至22%（7-14天）之间变化(n个=10）当应用qPCR时。增加斯里DNA和电子GFP第一周内的数量表明移植的HSC在宿主肝脏中增殖（图​（图2，2、D和E），而不提高纤维组织炎相关标记物（如胶原1α2链）的表达(第1a2列),第4a1列，或学报2与在受伤对照肝脏（2AAF/PHX模型）中观察到的表达水平进行比较，如在第1天、第7天和第14天通过qPCR进行的研究（图中所示为第14天​图2F）。2F） ●●●●。在再生过程中，2AAF/PHX模型的肝脏中纤维化相关标志物的表达瞬时增加，在第7天左右达到最大表达（未显示）。我们还观察到移植eGFP的植入⁺WT宿主大鼠胰腺中HSC的RT-PCR和qPCR研究电子GFPmRNA。eGFP⁺HSC的丰度较低，约为0.02%（±0.01%；n个=4；7天）和0.3%（±0.09%；n个= 8; 14天）。eGFP胰腺组织⁺转基因（100%）和WT大鼠（0%）用于正常化。

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图2

移植eGFP⁺HSC位于受损的WT宿主肝脏并有助于肝脏再生（2AAF/PHX模型）。

eGFP免疫荧光（绿色）(A类)野生型对照肝和野生型宿主肝(B类)7和(C类)HSC移植后14天。的qPCR(D类)斯里DNA和(E类)电子GFP雄性eGFP移植后第1、7和14天的mRNA⁺高速列车(n个= 5). 的生平(D类)男性(n个=6）和雌性(n个=4）或(E类)转基因eGFP⁺(100%,n个=3）和WT大鼠（0%，n个=3）用于归一化。(F类)的qPCR第1a2列链条，第4a1列链条，以及学报2在2AAF/PHX模型的大鼠肝脏中(n个=5）和无（控制，n个=8）第14天移植HSC。(G公司和H（H）)HSC移植1天后WT宿主肝脏eGFP（棕色）的DAB免疫组化。(G公司)电子绿色荧光蛋白⁺通过结蛋白免疫荧光（黄色；2区）鉴定HSC。(H（H）)胆管内（黑色箭头）或与胆管相关（白色箭头）的HSC衍生细胞（1区）。(我)WT对照肝无eGFP的DAB免疫组化。(J型–M（M）)eGFP移植后14天，eGFP（棕色）的DAB染色⁺HSC。(J型)胆管中K19表达细胞（黄色）(J型和K（K）)eGFP用箭头表示（1区）。电子GFP⁺肝细胞（棕色；箭头）通过HNF4α免疫荧光鉴定（黄色）(L（左）)在1区和(M（M）)区域3。(N个)eGFP快速红染色⁺含HNF4的（红色）肝细胞一（黄色；箭头；区域1）。(O（运行）)WT对照肝eGFP快速红染色。比例尺：200μm(A类–C类,我、和O（运行）); 50微米(G公司和J型–N个); 20微米(H（H）).

尽管移植了eGFP⁺移植后1天，HSC低于qPCR的检测限（图​（图2，2，D和E），RT-PCR电子GFP使用3,3′-二氨基联苯胺（DAB）对eGFP进行免疫组织化学染色，结果显示它们在窦状体内以去蛋白表达星状细胞的形式存在，并显示它们归巢于宿主肝脏（图​（图2G）。2G） ●●●●。我们还发现了eGFP⁺移植后1天，HSC整合并与宿主肝脏中的胆管相关（图​（图2H）。2H） ●●●●。WT对照肝脏（2AAF/PHX模型）未显示eGFP的DAB染色（图​（图2I）。2一） ●●●●。eGFP的DAB免疫组织化学，结合胆道标记物K19和肝细胞标记物HNF4α的免疫荧光，表明移植的HSC在肝再生14天后有助于胆管和肝细胞的形成（图​（图2，2，J–M）。我们在两个门脉周围（1区；图​图2L）2五十） 和中央周围（3区；图​图2M）2M） 区域。还通过eGFP的快红免疫组织化学和HNF4α的免疫荧光研究了HSC向肝细胞的分化（图​（图2N）。2N） ●●●●。我们没有在WT对照肝脏中观察到eGFP的快速红免疫组化阳性（2AAF/PHX模型）（图​（图2O）。2O） ●●●●。当HSC克隆（来源于单个eGFP）时，我们发现再生肝脏（2AAF/PHX）中存在类似的分化潜能⁺HSC通过克隆扩增进行移植。如qPCR分析所示电子GFPmRNA，不同HSC克隆重建约16%（±5%；范围3%-28%；n个=4）（补充图1，A–C）。我们通过雄性特异性Y染色体的荧光原位杂交（FISH）研究了雄性HSC克隆在雌性宿主肝脏内分化为上皮细胞。当添加HNF4α或角蛋白（pan keratin，panK）的免疫荧光时，FISH分析显示肝细胞和胆管细胞中存在HSC衍生的Y染色体（补充图1、B和C）。我们验证了Y染色体探针在男性（阳性对照）和女性（阴性对照）肝脏切片上的特异性（图​（图3，三以及通过男性对照肝切片细胞核中每条染色体的不同信号结合Y和X染色体探针（图​（图3C）。三C） ●●●●。FACS分类的雄性大鼠原代HSC移植后，用FISH检测HNF4α中Y染色体⁺和panK⁺雌性宿主肝内的细胞（2AAF/PHX模型），表明雌性宿主肝中HSC衍生的肝细胞和胆管细胞（图​（图3，三、D和E）。Y和X染色体的同步FISH显示正常的二倍体和四倍体肝细胞，这些肝细胞来源于移植的雄性HSC，没有与先前存在的雌性肝细胞融合（图​（图3F）。三F） ●●●●。移植的HSC能够恢复由于外显子4突变而缺乏尿苷5′-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）活性的纯合子GUNN大鼠的肝功能。UGT1A1酶在肝细胞中表达，是胆红素葡萄糖醛酸化（结合）所必需的酶，能够排出胆红素。由于Ugt1a1型缺乏，与正常大鼠相比，纯合子GUNN大鼠的血清胆红素水平较高。我们核实了Ugt1a1型通过酶切（BstNI）移植HSC后纯合GUNN大鼠肝脏中无突变的转录物Ugt1a1型PCR产物，产生与杂合GUNN或正常大鼠获得的PCR产物类似的额外PCR产物。相反，变异Ugt1a1型保持未分离状态，并以465 bp的单个PCR产物出现（图​（图3G）。三G） ●●●●。与此相一致，在移植正常大鼠的HSC后4周内，纯合子GUNN大鼠的血清结合（直接）胆红素水平增加了2倍Ugt1a1型与未移植HSC的GUNN大鼠的血清水平进行比较（图​（图3H）。三H） ●●●●。这表明通过将移植的HSC分化为肝细胞，GUNN大鼠的胆红素处理缺陷得到了部分纠正，尽管未结合（间接）胆红素的量尚未发生显著改变（图​（图3H）。三H） ●●●●。白蛋白血清浓度保持不变（图​（图3三一） ●●●●。

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图3

通过性别特异性染色体FISH和GUNN大鼠（2AAF/PHX模型）研究移植的雄性HSC形成胆管细胞和功能性肝细胞。

(A类)用男性肝脏切片上Y染色体（红色）的FISH作为阳性对照。(B类)Y染色体FISH阳性的女性肝脏。(C类)雄性肝脏中Y（红色）和X（绿色）染色体的FISH。的成本(D类)HNF4α（绿色）和(E类)在雄性HSC移植后的雌性宿主肝脏中用Y染色体（红色）的FISH进行panK。箭头表示HSC衍生(D类)肝细胞和(E类)具有Y染色体的胆管细胞。(F类)雌性宿主肝脏Y（红色）和X（绿色）染色体的检测。箭头表示二倍体和四倍体HSC衍生的雄性肝细胞没有细胞融合。在受伤肝脏的门脉区（1区）拍摄显微图像。(G公司–我)将HSC移植到在2AAF存在下接受PHX的GUNN大鼠体内。(G公司)通过RT-PCR分析纯合GUNN大鼠移植HSC衍生的肝细胞的存在Ugt1a1型mRNA，然后酶切（BstNI）突变位点。(H（H）)4周后测定直接胆红素（红条）和间接胆红素（黄条）的血清浓度，并与GUNN大鼠（对照组）和正常大鼠的血清浓度进行比较，GUNN大鼠以类似的方式治疗，但没有移植HSC(n个= 3–6; *P（P）< 0.05). (我)测定正常大鼠以及有和无移植HSC的GUNN大鼠血清中的白蛋白浓度(n个= 3–6). 比例尺：50μm(A类–D类和F类); 20微米(E类).

移植HSC和导管反应（2AAF/PHX模型）。

导管反应被认为是干/祖细胞对严重肝损伤的反应，由K19形成⁺祖细胞和周围的间充质细胞。这些导管在2AAF/PHX模型中短暂出现，并在PHX后第7天到第14天在再生肝脏中发现（图​（图4）。4). 间充质标记蛋白，如波形蛋白和结蛋白在伴有导管反应的肝组织中高度表达（图​（图4，4、A和B）。表达中胚层蛋白波形蛋白和上皮标记物K19的前体细胞构成了导管的核心（图​（图4，4，C–F）被表达星形细胞标记结蛋白的细胞包围（图​（图4G）4G） 和nestin（未显示）。我们验证了K19中存在波形蛋白⁺通过免疫荧光和ELYRA超分辨显微镜（Zeiss）观察这些导管样结构中的细胞（图​（图4，4、E和F）。尽管结蛋白和K19表达细胞在这些结构中似乎有明显区别（图​（图4G），4G） ，超分辨显微镜显示K19中存在结蛋白残基⁺单元格（图​（图4，4，H和I），表明肝的假定祖细胞中存在间充质细胞和上皮细胞的中间状态。我们发现移植的eGFP⁺如eGFP的DAB免疫组织化学所示，在肝脏再生的第7天，宿主肝脏中导管反应区域的HSC（2AAF/PHX模型）。eGFP与祖细胞标记物K19和α-甲胎蛋白同时免疫组化染色表明移植的eGFP⁺HSC促进了推测的上皮祖细胞形成导管样结构（图​（图4，4，J–L）。虽然我们发现HSC-衍生eGFP⁺和K19⁺导管细胞间的细胞，eGFP的大多数⁺导管周围的细胞似乎是间充质组织（图​（图4，4、J和K）。

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图4

移植eGFP⁺HSC参与导管反应（2AAF/PHX模型）。

(A类–我)2AAF存在下PHX后肝脏导管反应期间间充质（波形蛋白和结蛋白）和上皮（K19）标记蛋白的免疫荧光。同时检测门脉野导管结构中的波形蛋白（绿色）和结蛋白（红色）(A类)低和(B类)高倍率。K19（红色）和波形蛋白（绿色）的联合免疫荧光(C类)低和(D类)高倍放大。超分辨显微镜(E类)波形蛋白（绿色），显示波形蛋白残留物(F类)在K19中⁺导管样结构中心的细胞（红色）。(G公司)门区内导管结构K19（红色）和结蛋白（绿色）的免疫荧光。(H（H）和我)导管反应的结蛋白免疫荧光（绿色）通过超分辨显微镜和(H（H）)显示结蛋白残留(我)在K19中⁺导管样结构中心的细胞（红色）。(J型–L（左）)移植eGFP的WT宿主肝eGFP（棕色）的DAB免疫组化研究⁺HSC。(J型)导管反应的上皮细胞由(J型)K19和(L（左）)甲胎蛋白免疫荧光（黄色）。HSC衍生eGFP⁺包含的单元格(K（K）)K19（未显示免疫荧光J型)或(L（左）)α-甲胎蛋白用箭头表示。所有显微图像均在受伤肝脏的门静脉区（1区）拍摄。比例尺：200μm(A类和C类); 50微米(B类,D类,G公司、和J型–L（左）); 10微米(E类,F类,H（H）、和我).

HSC的再移植（2AAF/PHX模型）。

除了在肝脏中存在外，我们还发现移植的HSC植入（1%–2%；n个=5；图​图5，5和HSC克隆（1%；n个= 5; （未显示）在通过qPCR研究的宿主大鼠BM中斯里DNA和电子GFP尾静脉注射后7-14天，mRNA表达。由于BM细胞可以在没有酶的情况下从长骨中轻轻分离出来，所以我们将此来源用于星状细胞的再移植实验。FACS分类eGFP⁺HSC首先用CellTracker Red染色，然后在PHX后立即在2AAF存在下移植到WT大鼠体内。移植后第1天，采集并培养宿主骨髓细胞。新分离的HSC显示出强烈的CellTracker荧光（图​（图5C），5C） ，用于寻找移植的HSC-衍生eGFP⁺WT-BM电池之间的电池（图​（图5，5，D–F），在培养过程中最终转化为肌纤维母细胞样细胞（未显示）。培养期间HSC衍生细胞中eGFP的表达保持不变（图​（图5G）5G） 并用于分析移植到新宿主大鼠（2AAF/PHX模型）14天后它们在肝脏和骨髓中的植入情况（图​（图5，5、H和I）。重新移植的eGFP⁺HSC衍生细胞能够重建约17%（±5%；n个=3）通过qPCR研究的受损宿主肝脏电子GFPmRNA。eGFP的百分比⁺宿主肝脏不同区域的细胞不同（补充表1）。

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图5

移植eGFP的雕刻⁺WT宿主动物BM中的HSC及其再移植（2AAF/PHX模型）。

的qPCR(A类)斯里DNA和(B类)电子GFPHSC移植后14天内的mRNA(n个= 5). 亲属斯里男性或eGFP BM样本的DNA或mRNA数量⁺大鼠（100%，n个=4）和雌性或WT大鼠（0%，n个＝4）用于标准化。(C类)分离HSC的荧光CellTracker（红色）染色。通过维生素A荧光（蓝色）验证HSC身份。(D类–F类)电子GFP⁺将CellTracker染色的HSC注射到WT大鼠（2AAF/PHX模型）中，并在移植后1天从BM中分离。(D类)透射光显微镜和融合荧光(E类)eGFP和(F类)BM培养物的CellTracker（红色）染色。箭头表示eGFP⁺和CellTracker⁺HSC衍生细胞。(G公司)具有eGFP的骨髓细胞⁺HSC衍生细胞在培养中扩增，并且存在电子GFP14天后通过RT-PCR验证mRNA(n个= 3). eGFP的BM⁺WT大鼠作为eGFP表达的阳性和阴性对照。(H（H）)电子GFP⁺骨髓细胞培养中的HSC衍生细胞（如G公司)再次植入3只不同的WT大鼠（2AAF/PHX模型），并在(H（H）)肝脏和(我)14天后通过RT-PCR检测所有宿主动物的BM电子GFPmRNA。Hprt1（小时）mRNA用于证明所有样本中的mRNA数量相等。比例尺：100μm(C类–F类).

HSC移植（逆转录酶/PHX模型）。

来自eGFP的FACS分类HSC⁺雄性大鼠也被注射到在逆转录酶存在下接受PHX治疗的WT雌性大鼠体内，逆转录酶可以阻止成熟肝细胞的增殖，从而促进移植细胞在受损肝脏中的植入。在这个模型中，移植了eGFP⁺HSC形成约6%（±2%；范围1%-14%；n个=7）宿主肝脏的qPCR研究电子GFPmRNA（图​（图6A）。6A） ●●●●。移植eGFP的雕刻⁺当应用逆转录酶/PHX模型时，qPCR可在所有宿主大鼠中检测到HSC。eGFP⁺移植后14天，HSC在宿主肝的肝窦内保持为星状细胞（逆转录酶/PHX模型），如eGFP的DAB免疫组化和结蛋白的免疫荧光联合显示（图​（图6B）。6B） ●●●●。eGFP（快红）免疫组化和肝细胞标记物HNF4α免疫荧光显示移植eGFP⁺HSC也分化为肝细胞（图​（图6C）。6C） ●●●●。Y染色体FISH结合HNF4α免疫荧光证实了雄性HSC在雌性宿主肝脏中产生肝细胞（图​（图6D）。6D） ●●●●。当Y染色体探针与panK免疫荧光结合时，我们也在胆管细胞中发现了Y染色体（图​（图6E）。6E） ●●●●。我们发现，移植的雄性HSC能够在雌性宿主肝脏中生成肝细胞，而无需细胞融合，正如Y和X染色体的FISH所确定的那样（图​（图66F） ●●●●。

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图6

移植eGFP⁺HSC有助于在逆转录酶存在下进行PHX的WT宿主大鼠的肝脏再生。

(A类)移植eGFP衍生的细胞百分比⁺通过qPCR检测肝再生后14天内雌性宿主肝脏中的雄性HSC电子GFP信使核糖核酸(n个=7）。转基因eGFP的寿命⁺(100%,n个=3）和WT大鼠（0%，n个=3）用于归一化。(B类)WT宿主肝脏（2区）eGFP（棕色）和结蛋白免疫荧光（黄色）的DAB免疫组化。(C类)用eGFP的快速红免疫组织化学（红色）结合HNF4α免疫荧光（黄色）鉴定移植eGFP衍生的肝细胞⁺HSC。Y染色体（红色）和(D类)HNF4α免疫荧光或(E类)雌性宿主肝脏（1区）中的panK（绿色）。(D类)肝细胞和(E类)箭头所示为移植的雄性HSC衍生的胆管细胞。(D类)当HNF4α（绿色）和DAPI（蓝色）同时染色时，Y染色体（红色）呈白色。(F类)FISH同时检测雌性宿主肝脏中的Y（红色）和X（绿色）染色体。箭头表示二倍体和四倍体肝细胞来源于未经细胞融合的移植雄性HSC（1区）。比例尺：50μm(B类,C类、和D类); 20微米(E类和F类).

肝损伤与HSC移植。

在进行上述PHX前7天，将含有2-乙酰氨基芴（70 mg，2AAF 14天释放；美国创新研究）的颗粒植入WT Wistar大鼠（250 g）（海因里希·海因大学动物设施）的颈部皮肤下(42,43). 电子GFP⁺来自Wistar-TgN（CAG-GFP）184岁大鼠（美国密苏里州哥伦比亚密苏里大学鼠资源与研究中心）的HSC通过密度梯度离心法富集(44)经维甲酸依赖性FACS纯化，最后在PHX后立即通过尾静脉注射移植到WT雌性Wistar大鼠体内。约700000±100000个HSC或来自男性eGFP的克隆性扩张HSC⁺将大鼠注射到每只肝损伤大鼠体内。将HSC移植到正常和突变Wistar大鼠株（GUNN-UGT1A1^j/BluHsdRrrc; 鼠资源研究中心）(45). 纯合子突变体缺乏UGT1A1酶活性，血清胆红素水平升高。Heinrich Heine大学中央医院实验室在HSC移植4周后测定大鼠血清中的直接（结合）和间接（非结合）胆红素以及白蛋白浓度。对于再移植实验，FACS分类eGFP⁺HSC用10μM CellTracker Red染色({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“C34552”，“term_id”：“2370693”，“term_text”：“C34552”}}C34552号; Invitrogen）在37°C无血清条件下悬浮45分钟。在通过重复离心去除过量染料后，在PHX后立即将约100000个双重标记的HSC移植到用2AAF处理的WT大鼠中。移植后1天采集宿主动物BM细胞，培养14天，然后移植到其他经2AAF和PHX预处理的WT大鼠体内（约1000万细胞）。在另一个损伤模型中，雌性WT Wistar大鼠（250 g）每隔14天接受2次静脉注射逆转录酶（R0382-100MG；Sigma-Aldrich）（30 mg/kg）。额外4周后，进行PHX(46)和FACS排序的eGFP⁺如上所述，移植来自雄性Wistar大鼠的HSC。

细胞分化。

50 ng/ml FGF4（100-31；PreproTech）和40 ng/ml人HGF（100-39；PreproTech）溶解在补充1%胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（ITS）（I1884；Sigma-Aldrich）的Iscove改良Dulbecco培养基（12440-046；Invitrogen）中，诱导分离的HSC、HSC克隆、BM-MSCs和UCBSC分化，来自牛血清的1%亚油酸白蛋白（L9530；Sigma-Aldrich）和1%抗生素抗真菌溶液（Invitrogen）。每隔二到三天更换一次分化培养基。对照实验中的细胞在相同的培养基中培养，但没有FGF4和HGF。每周监测细胞分化的进展。

分析细胞和组织切片。

用冰镇甲醇或4%福尔马林将肝脏的分离细胞和冰冻切片固定5分钟或10至20分钟，并与GFAP（MAB3402；Millipore）、K18（BM2275P；Acris）、K19（NB100-687；Novus Biologicals或65129；ProGen Biotechtick）、panK（CM162；Biocare Medical）、desmin（ab8592；Abcam）、，用于免疫荧光染色的vimentin（M0725；Dako）、nestin（sc-33677；Santa Cruz Biotechnology Inc.）、LGR5（GTX62071；GeneTex）和HNF4α（3113；细胞信号技术）。抗NTCP和BSEP的主要抗体由B.Stieger和P.Meier（瑞士苏黎世苏黎世大学医院）提供。合适的次级花青染料3（Cy3）或FITC标记的抗体（AP182C、AP162C、AP192F和AP182F；Millipore）和DAPI({“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“P36935”，“term_id”：“549826”，“term_text”：“P26935”}}第36935页，加长黄金；Invitrogen）分别用于标记初级抗体和细胞核。移植eGFP⁺使用单克隆（2956，D5.1 XP；细胞信号技术）和多克隆抗体（210-PS-1GFP；ImmunoKontact）在福尔马林固定和Triton X-100处理（PBS中0.1%，3051.3，Carl Roth GmbH）的肝脏冷冻切片上通过免疫组化检测HSC抗eGFP，然后用与碱性磷酸酶或HRP偶联的二级抗体标记（K5361，EnVision G|2双染色系统兔/鼠；Dako）。多克隆eGFP抗体和用于检测eGFP的二级抗体与WT大鼠的肝匀浆预先孵育至少30分钟，以防止非特异性结合。使用含有左旋咪唑的用于阻断内源性碱性磷酸酶的快速红色片（11496549001；罗氏）制备碱性磷酸酶底物溶液。用稀释苏木精溶液（蒸馏水中1:4）（1.05175；默克）在快速红色染色的肝脏切片上对细胞核进行复染。用蒸馏水和自来水清洗苏木精溶液。电子GFP⁺细胞类型通过抗HNF4α、K19或结蛋白的抗体进行鉴定，随后通过与荧光染料偶联的适当二级抗体进行标记。对于逆转录酶PCR（RT-PCR），从至少4个不同的肝叶采集组织样本，并使用RevertAid H Minus第一链cDNA合成试剂盒（K1632；Thermo Scientific）从每20μl反应体积1μg总RNA中制备第一链cDNA。根据标准方案，使用2xPCR Master Mix（K0171；Thermo Scientific）、0.8μmol/l引物（补充表6）和每25μl反应体积1或5μl模板cDNA进行PCR。最多使用20或35个周期来扩增PCR产物。根据制造商的说明，使用SensiMix SYBR No-ROX试剂盒（QT650-05；Bioline）进行实时qPCR。为了评估男性HSC移植后的植入情况，使用DNeasy Blood&Tissue Kit（69581；QIAGEN）纯化总DNA。为了扩增PCR产物，每个反应取12.5 ng cDNA或500 ng DNA和0.6μmol/l引物（补充表7）。在95°C初始变性后，在58°C下进行退火，并在72°C下使用40个循环和TOptical Cycler（Analytik Jena AG）进行伸长率。所有样品均测量了三份，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1(Hprt1（小时）分离细胞的mRNA）或β-肌动蛋白（肝组织的DNA）被用作2^–ΔΔCt方法。根据制造商的建议，通过大鼠特异性白蛋白ELISA（E110-125；Bethyl Laboratories）对培养上清液中的大鼠白蛋白进行定量。为了检测正常和GUNN大鼠肝脏中的UGT1A1酶Ugt1a1型根据制造商的说明，用BstNI限制酶（新英格兰生物实验室）切割mRNA，并用琼脂糖凝胶（3%）分离。如前所述，用Carnoy固色剂固定肝脏切片15分钟，用胃蛋白酶（10108057001；罗氏）消化组织5分钟后，使用大鼠Y（IDRR1070；IDLabs）和X（IDRF1067；IDLab）染色体的DNA探针进行FISH分析(24).

胆汁酸及其结合物的分析。

通过UHPLC-MS/MS分析HGF-和FGF4处理的细胞的培养上清液中的胆汁酸。UHPLC-MS/MS系统由UPLC-H级与Xevo TQ-S三四重质谱仪（Waters）耦合组成。在负电离模式下进行电喷雾电离。在UPLC HSS C18柱（Waters）（2.1×100 mm，1.8μm）上进行色谱分离。流动相由含有0.1%甲酸的水和5 mM醋酸铵（洗脱液A）和乙腈（洗脱剂B）组成。通过梯度洗脱分离分析物。注射体积为5μl，柱保持在40°C。在选定的反应监测（SRM）模式下检测胆汁酸及其甘氨酸和牛磺酸结合物。所有标准品以及氘化内标物（IS）物质（d4-CA、d4-GCA和d4-GCDCA）均购自Sigma-Aldrich和Steraloids。

统计学。

通过ANOVA或Mann-Whitney确定大鼠白蛋白ELISA和qPCR获得的数据的重要性单位测试，数据在P（P）小于0.05的值。至少3个独立实验的结果以百分比表示为平均值。方差指定为平均值±SEM。

作者感谢海因里希·海因大学的Claudia Rupprecht（胃肠病、肝病和传染病临床）和Katharina Raba（移植诊断和细胞治疗研究所）提供的专家技术援助。我们感谢大鼠资源与研究中心（P40OD011062）提供GUNN大鼠和eGFP表达大鼠。转基因eGFP⁺大鼠由Eiji Kobayashi（日本东京医科大学先进医疗技术开发中心）制造。这项工作得到了德国研究基金会（DFG）通过合作研究中心SFB 974（“肝脏损伤和再生期间的通信和系统相关性”，德国杜塞尔多夫）的支持。