分子细胞生物学。2004年7月；24(14): 6393–6402.
体内蛋白质与色素动态相互作用的全球性质：染色蛋白的三维基因组扫描和动态相互作用网络
,1 ,2 ,2 ,3 ,4 ,4 ,5 ,2 ,2和2,*
罗伯特·D·菲尔
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
保拉·斯卡菲迪
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
塞姆·埃尔比
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
贾罗米拉·维塞罗娃
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
阿努普·戴伊
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
小泽惠子
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
大卫·T·布朗
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
戈登·海格
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，邮编：20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
迈克尔·巴斯廷
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
汤姆·米斯特利
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
国家癌症研究所，2马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所，邮编：20892，4生物信息服务，马里兰州罗克维尔，20854，1捷克共和国科学院实验医学研究所和捷克共和国布拉格第一医学院，3密西西比州杰克逊市密西西比大学医学中心392165
收到日期：2004年3月17日；2004年4月18日修订；2004年5月2日接受。
摘要
基因组结构和基因表达依赖于大量染色质结合蛋白。这些蛋白质与完整细胞中天然染色质的结合特性基本上未知。在这里，我们描述了一种基于活体光漂白显微镜和动力学模型的方法，以全面分析染色质相关蛋白在活细胞中的结合动力学。我们已经定量测定了体内多种功能的染色质蛋白质的基本生物物理性质，如失速常数、停留时间和结合分数。我们证明，大多数染色质蛋白质在染色质上具有较高的周转率，停留时间约为秒，每个蛋白质的主要部分在稳定状态下与染色质结合，瞬时结合是染色质相关蛋白质的一个常见特性。我们的结果表明，染色质结合蛋白通过基因组空间的三维扫描找到其结合位点，我们的数据与染色质相关蛋白在体内形成动态相互作用网络的模型一致。我们认为这些特性对于基因组表达的高可塑性至关重要。
将DNA组织成高级染色质结构有助于将基因组容纳在细胞核的空间范围内，并作为一种重要的调节机制(22,36,46,60). 全局和局部染色质状态的建立、维持和改变受多种染色质结合蛋白的联合作用调节。含有组蛋白的核小体作为结构支架和调节机制的入口点(60,63). 非组蛋白，包括HMG蛋白，进一步有助于染色质区域的结构维持和调节(6,61). 在异染色质中，HP1等特定因子可能通过影响高阶染色质结构来传递转录抑制状态(19,27). 组蛋白修饰酶，如组蛋白乙酰转移酶和甲基转移酶，有助于在染色质域上产生表观遗传标记(60). 染色质重塑因子作用于特定位点，以促进对调控DNA元素的获取。一旦可获得，转录激活物将特定序列结合在DNA上，并招募基础转录机制(37,44,46). 所有这些步骤都涉及蛋白质与染色质的结合。
由于其功能重要性，染色质相关蛋白已被广泛表征，主要通过生化提取和体外结合试验。关于染色质蛋白如何与活细胞中天然染色质的靶位点结合的动力学，目前知之甚少。体内显微镜技术为研究活细胞中的染色质蛋白提供了新的工具(32,39,41,50). 光漂白实验的定性分析揭示了染色质相关蛋白的广泛动态行为。大部分核心组蛋白在DNA上是不动的，而连接体组蛋白H1和TATA-结合蛋白相对稳定但动态地相关(10,16,34,38,43). 另一方面，复制和修复因子在未激活状态下具有高度的流动性，但在绑定到其作用位置时会暂时固定(31,57). 几种转录激活因子和阻遏因子具有高迁移率，意味着与染色质的短暂结合(3,17,30,31,40,47,49,59). 然而，这些研究大多是定性的，只有少数情况下从体内显微镜数据中提取了定量参数，如结合率或停留时间。此外，由于所分析的蛋白质数量有限，尚不清楚染色质相关蛋白质的瞬时结合概念的普遍适用性。
在本报告中，我们描述了一种计算显微镜方法，用于定量测定完整细胞的天然染色质中染色质相关蛋白的结合特性。通过分析广泛的染色质蛋白，包括结构蛋白、重塑因子、转录辅活化因子以及基础和特异转录因子，我们证明瞬时结合是染色质相关蛋白的一个普遍特性。我们的结果表明，染色质结合蛋白主要通过基因组空间的三维扫描找到其结合位点，我们推测动态相互作用网络在控制基因表达中起着关键作用。
材料和方法
细胞培养和生长速度。
BHK、HeLa、NIH 3T3和CHO细胞在添加10%胎牛血清、100-U/ml青霉素、100-μg/ml链霉素和2mM我-在富含5%CO的大气中37°C下的谷氨酰胺2Hepa-1细胞在补充有7%胎牛血清（HyClone Labs）的α-最低必需培养基（Gibco BRL）中生长，以防止AhR的核移位。细胞常规保存在含有5%CO的37°C培养箱中2用配体2,3,7,8-四氯二苯处理细胞-第页-在所有实验中，二恶英（TCDD）在10 nM下持续1小时。细胞通过电穿孔转染，BTX方波脉冲为650V，99μs。转染后14小时观察瞬时转染细胞。表达H1的稳定细胞系0-绿色荧光蛋白（GFP）的产生和生长如前所述(28).
融合蛋白。
本研究中使用的融合蛋白的详细信息见表中引用的参考文献Myc、Mad、Max、BRG、PCAF和NF1位于pEGFP-C1载体中。
表1。
| 蛋白质 | 功能 | GFP融合的功能一 | 单元格类型b条 | 来源或参考 |
|---|
| GFP公司 | 荧光标记 | 不适用 | a、 b、c | 9 |
| | | a、 b、c | |
| 过氧化氢 | 核心组蛋白 | 体内核小体组装 | a、 b条 | 33 |
| H1° | Linker组蛋白 | 体外结合 | c（c） | 43 |
| H1°ΔC | Linker组蛋白 | 体外结合 | c（c） | 43 |
| HMGB1标准 | 质结构 | 体内结合 | a、 b条 | 54 |
| HMGN1号机组 | 质结构 | 体外结合 | a、 b、c | 51 |
| HMGN1-E22，-E24 | 质结构 | 体外结合 | a、 b、c | 51 |
| HP1β | 异染色质形成 | 体外结合 | a、 d日 | 13 |
| | 体内互补 | | 23 |
| BRG1公司 | 染色质重塑 | 第二次 | 一 | 第二次 |
| PCAF公司 | 组蛋白修饰剂 | 第二次 | 一 | 第二次 |
| 阿赫勒 | 受体 | 体内激活 | e（电子） | 20 |
| | 体内互补 | | |
| ARNT公司 | 辅活化剂 | 体内激活 | e（电子） | 20 |
| | 体内互补 | | |
| C/EBP公司 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | 56 |
| NF1型 | 转录因子 | 第二次 | 一 | 第二次 |
| 六月 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | T.科波拉c（c） |
| 福斯 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | T.科波拉c（c） |
| Myc公司 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | 64 |
| 马克斯 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | 64 |
| 疯狂 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | 64 |
| 固定基地计划 | 转录因子 | 体外结合 | 一 | 第29页; D.杠杆c（c） |
| XBP公司 | 转录因子 | 体内互补 | 一 | 30 |
| 巴西雷亚尔4 | 染色质结合 | 体外结合 | 一 | 15 |
成像。
在显微镜下，转染细胞在LabTek II室（Nalgene）中进行电镀和观察。在蔡司510共聚焦显微镜上使用488nm的Ar激光（标称输出，40mW；样品处的光束宽度，0.2μm）进行活细胞显微镜检查。所有实验均在37°C下进行，成像采用X 100物镜，NA 1.3。使用5倍变焦，针孔为1 Airy单位，以尽可能高的速度进行双向扫描。漂白的激光功率最大。对于成像，激光功率被衰减到漂白强度的0.1%。对于光漂白后的荧光恢复（FRAP）实验，采集了五张单次预漂白图像，然后分别进行两次223 ms的迭代漂白脉冲。然后以534-ms的间隔收集60秒的单节图像。漂白区信号的恢复和未漂白区的信号损失作为至少50%漂白区或未漂白区区域的平均强度信号进行测量。该测量区域的大小在所有实验中都是相同的。恢复期的信号损失小于初始荧光信号的5%。通过检查固定细胞的图像堆栈，确认三维（3D）漂白的完整性。所有恢复和损失曲线均由背景提取图像生成。在感兴趣区域测量的荧光信号被单独归一化为感兴趣区域的预漂白信号：
哪里我o个是预漂白期间感兴趣区域的平均强度，我t吨是时间点感兴趣区域的平均强度t吨、和我背景是在细胞核外部区域确定的背景信号。
动力学建模。
半FRAP数据的定量分析如前所述，采用经典的分区方法进行(48). 每个光漂白数据集都符合指数总和，表明系统偏差无法用较少的结合位点消除，而额外位点的添加导致了一个无法识别的系统，其参数值具有不可接受的变异系数。所分析的大多数蛋白质显示出双相行为，动力学建模过程描述了具有两种不同类型结合事件的模型。
利用标准化学动力学原理，生成了一个常微分方程组，该方程组具有常系数（速率常数），描述了结合、解结合和（活性时）光漂白过程(52). 由于每个蛋白质及其结合位点的绝对丰度通常未知，通过将未知的稳态结合位点丰度与相应的二级速率常数相结合，将二级结合过程转换为伪一级过程，以产生一级结合速率常数。这还有一个额外的优点，就是将非线性微分方程组转换为线性系统。所得方程式为
在这些方程式中，CP代表染色质相关蛋白；下标DNA1和DNA2表示两类结合位点；下标漂白和未漂白表示暴露于和未暴露于漂白激光脉冲的区域；（f）漂白的和（f）未漂白的是核面积的相应分数；下标核质表示核质中染色质相关蛋白的自由库；k个打开1和k个打开2分别是染色质相关蛋白与位点1和2结合的有效一级速率常数；k个关闭1和k个关闭2分别是来自位点1和2的染色质相关蛋白解绑的速率常数；和k个漂白剂是表征光漂白过程的速率常数。
漂白和未漂白区域中相应过程的速率常数被限制为相等，并且假设核的漂白部分与未漂白部分中的结合位点的比例与被漂白和未漂白的感兴趣区域占据的观察到的核焦点平面的比例相同。我们进一步假设，单个共焦切片的分析不受切片上方和下方核区域标记分子的丢失或增加的影响。
因为很难解决k个在仅从半FRAP数据来看，我们实施了额外的限制。基于我们的知识，即在这个时间尺度上扩散很快，我们假设在未漂白区域，所有蛋白质的自由池和结合池在收集第一张漂白后图像时均未漂白。这允许估计结合蛋白的比例，进而对k个打开1和k个打开2相对于k个关闭1和k个关闭2.
初始条件是通过求解10个分子/s的任意合成速率和0.0005s的非常慢的降解速率常数的模型而获得的−1由于只分析了归一化荧光数据，这些稳态丰度的绝对值对模型解或此处报告的离解速率常数和平均停留时间没有影响，但它们确实允许在快速和慢速结合位点之间正确分配初始荧光。
从细胞核未漂白部分收集的数据与模型未漂白部分中快慢间隔的总和相吻合。细胞核漂白部分的数据被拟合到模型漂白部分中快慢间隔的总和。例如，归一化回收动力学适用于
其中上标ss表示稳态值。所有CP值均指相对金额。
重要的参数是平均停留时间，这是根据相应的离解速率常数计算得出的：
与fast相关的总绑定分数(1)或缓慢(2)结合位点是
动力学模型是通过使用SAAM II软件（SAAM Institute，Inc.，Seattle，Wash）实现的。在SAAM II中进行广义非线性最小二乘拟合和参数优化，变异系数直接从SAAM II统计窗口获得(4,14). 什么时候？（f）漂白的,k个关闭1,k个漂白剂,k个打开2、和k个关闭2如果允许同时调整，则在不到20次迭代中实现收敛。所报告参数估计值的变异系数分别为0.3、7、0.6、30和9%。
结果
活细胞中蛋白质-色素相互作用动力学的测量。
FRAP可用于定量测量活细胞中蛋白质与未扰动染色质的结合动力学。这种方法的基本原理是基于FRAP恢复动力学反映蛋白质整体流动性的特性(39,50). 对于不与任何细胞结构相互作用的蛋白质，FRAP动力学是其平移运动特性的直接反映(41,47,62). 相反，对于与染色质等相对固定结构结合的蛋白质，结合事件会减缓蛋白质的整体流动性(41,50,62). 由于FRAP实验中测量到的微米范围内的扩散发生在10到100毫秒内，因此即使蛋白质与染色质的短暂相互作用也会限制速率，并严重降低FRAP实验中蛋白质的整体回收率。因此，染色质相关蛋白质的实验FRAP恢复动力学主要由蛋白质的结合特性决定，并允许提取体内蛋白质-染色质相互作用的信息(50).
通过直接比较染色质相关蛋白的野生型和结合受损突变体的特征良好的对应对，实验验证了FRAP方法（图。). 为此，表达功能性GFP标记的感兴趣蛋白的细胞的一半细胞核被400毫秒的漂白脉冲漂白。通过延时显微镜同时监测漂白区域中荧光信号的恢复和未漂白区域中信号的损失，以提供互补的数据集（图。). 如前所述，GFP和连接体组蛋白H1之间稳定表达的功能性融合蛋白0荧光恢复和损失相对较慢（图。). 这个t吨50，定义为H1达到半最大恢复所需的时间0-GFP为127 s，在420 s内完全恢复和丢失(38,43). 相反，H10-Δ7-GFP，在球状结构域内包含7个点突变，在体外仅与十字形DNA弱结合(26)与相应的野生型蛋白质相比，其恢复速度和损失速度显著加快（图。).t吨50为7.3 s，在57 s内达到完全恢复（图。). 注意，实验数据仅归一化为预漂白信号，由于约50%的初始信号被漂白，信号恢复到预漂白值的～50%表示完全恢复（图。).
用于染色质结合蛋白分析的FRAP。（A） 成对野生型和DNA结合缺陷染色质蛋白H1的FRAP0和HMGN1。H10突变体在球状结构域内含有七点突变，先前已证明可减少染色质结合。HMGN1突变体包含突变S20E和S24E，它们废除核小体结合。在大约一半的核区域漂白后恢复之前和恢复期间，对融合蛋白进行成像。在漂白脉冲结束后的指定时间拍摄图像。如面板B所示，随着时间的推移，测量了漂白（开放符号）和未漂白（实心符号）区域的平均荧光强度。干扰DNA结合可显著加快突变体的恢复。棒材，5μm。（B） 野生型和突变型H1 FRAP恢复的定量分析0HMGN1或GFP-NLS作为非绑定控件。恢复和损失曲线的收敛表明不存在固定部分。数值为三个实验中至少10个细胞的平均值±标准偏差。
通过对HMGN1-GFP及其双点突变HMGN1-EE-GFP的分析，进一步证实了FRAP对染色质结合事件的敏感性，该突变在瞬时转染HeLa细胞的核小体结合域中含有S20E和S24E突变(51). HMGN1-GFP的功能性和HMGN1-EE-GFP的结合丢失已在体外和体内得到证实(51). 野生型HMGN1-GFP-wt的恢复动力学明显慢于突变型HMGN1-GFP-wd的恢复动力学（图。).t吨50野生型为17.2s，但t吨50对于非结合突变体，只有4.3秒，野生型在52秒后达到总恢复，而突变型在14.8秒内达到（图。). HP1、UBF、Brd4和FBP的野生型和突变对也获得了类似的结果（数据未显示）(13). 正如预期的那样，GFP-NLS的恢复非常迅速，并且在漂白后的～2 s内完成（图。). 在化学固定细胞中未观察到恢复或损失。野生型和突变对之间恢复动力学的差异不能用分子量的差异来解释，因为所有突变都包含替换而不是缺失。观察到的野生型和突变蛋白之间的差异也排除了野生型的恢复动力学反映非特异性结合的可能性，因为过度表达导致的结合位点饱和。综上所述，这些观察结果表明，光漂白是一种敏感的工具，可以探测完整细胞中蛋白质与天然染色质的结合作用。
瞬时结合是染色质相关蛋白的一般特征。
为了了解广泛蛋白质与染色质的相互作用动力学，我们研究了染色质功能各个方面的相关因素，包括结构、重塑、组蛋白修饰和转录激活（图。和). 大多数GFP融合的功能先前已经通过体内和/或体外测定进行了测试（表). 大多数测试的融合蛋白均匀地分布在细胞核内，被排除在细胞核之外，并且在核病灶中没有任何显著的积累（图。). 所有实验中均使用表达低水平融合蛋白的细胞，但在表达高水平融合蛋白细胞中，恢复率并没有显著差异。
染色质相关蛋白的定位和FRAP恢复和损失曲线。（A） 大多数融合蛋白在细胞核内均匀分布，并从细胞核中排除。（B） 显示的蛋白质在大约一半的核区域漂白后恢复之前和恢复期间进行成像。随着时间的推移，测量了漂白区（开口正方形）和未漂白区（实心正方形）的平均荧光强度。大多数情况下，荧光信号在30到60秒内达到平衡，表明染色质上的蛋白质交换迅速。这两条曲线的收敛表明没有任何实质性的固定的、稳定的束缚分数。数值为三个实验中至少10个细胞的平均值±标准偏差。
染色质蛋白质FRAP曲线的动力学特征。达到一半最大恢复所需的时间(t吨50)确定了所有染色质蛋白达到恢复和丢失稳定平台所需的时间（A）和时间（B）。对于大多数染色质蛋白，t吨50在3到8秒之间，恢复在30到45秒内完成。核心组蛋白和连接蛋白组蛋白除外。数值为三个实验中至少10个细胞的平均值±标准偏差。
FRAP实验的定性分析表明，绝大多数融合蛋白表现出快速恢复动力学（图。). 阳性对照H1除外0而FUSE结合蛋白FBP、恢复和损失的半衰期通常在漂白脉冲后3至8 s内，大多数蛋白质的恢复在30至45 s内完成（图。). 对相应的恢复和损失曲线对的检查表明，所有蛋白质的两个测量值收敛并达到一个共同的平台（图。). 聚合表示未漂白和漂白区域之间荧光信号的完全平衡。只有当整个蛋白质群体进行动态交换且不存在固定的静态结合群体时，才能实现这种收敛。当在不同的细胞类型中分析相同的蛋白质时，得到了可比较的结果（表).
我们从这些观察中得出结论，各种染色质相关蛋白，无论其功能或结构特征如何，都只与活细胞细胞核中的染色质短暂结合，并且几乎整个群体都是动态交换的。因此，蛋白质与染色质的瞬间结合似乎是许多染色质相关蛋白质的共同特征。
体内蛋白质-色素相互作用的动力学建模。
为了提取有关结合率和停留时间的特定定量信息，我们应用了计算动力学建模方法(48,50). 我们根据化学动力学的标准原理生成了一个数学模型，以描述细胞核中染色质结合蛋白的动力学行为（图。). 我们假设染色质相关蛋白随机穿过核质并以随机间隔与染色质结合。平均来说，蛋白质在染色质上停留一段时间，我们称之为平均停留时间，然后分离并移动到另一个结合位点。因此，染色质相关蛋白通过核空间的整体运动由两个因素决定：结合位点之间的平移迁移率和结合反应本身。由于平移、扩散迁移率比速率限制结合事件快得多，蛋白质通过核空间的运动可以用一级近似描述为简单的缔合/解离反应（参见材料和方法）。由于每个蛋白质及其结合位点的绝对丰度未知，通过将未知的稳态结合位点丰度与相应的二级速率常数相结合，将二级结合过程转换为伪一级过程，以获得一级结合速率常数。这具有将非线性微分方程组转换为线性系统的额外优点（详见材料和方法）。
染色质结合动力学模型。（A） 半FRAP光漂白数据分析的分区模型。该模型由一个与两类核结合位点交换的蛋白质非结合核质池组成，即快速交换池和缓慢交换池。这些池存在于细胞核的未漂白和漂白区域，并进行复制，以准确模拟实验漂白方案。箭头表示绑定和解除绑定的过程；它们标有相应的速率常数。在这些光漂白实验的时间尺度上，蛋白质的合成和降解被认为可以忽略不计。扩散事件被忽略，因为它们比结合事件快得多，并且没有速率限制。（B） Mad和FBP实验恢复和损失数据的最小二乘最佳拟合。对于Mad，双位点结合模型比单位点结合模型给出了更好的拟合。对于FBP，单站点绑定模型就足够了。符号代表实验数据，线条代表最佳拟合。
动力学模型包含作为参数的开和关速率常数以及结合分子和非结合分子的丰度（图。)（材料和方法）。总结合分数的大小是通过利用蛋白质的扩散时间比使用的漂白时间短得多的事实来实验确定的（表). 对于每种蛋白质，将漂白前未漂白区域的荧光强度与漂白脉冲后立即的荧光强度进行比较。这种差异表明了结合分数，因为446 ms的漂白脉冲完全消除了未漂白区域自由扩散的未结合分子的荧光信号（数据未显示）。对于所有染色质相关蛋白，结合分数约为90%或更高（表). 这一观察表明，绝大多数分子在任何时候都与染色质结合。结合分数的大小被用作实验数据与建模数据拟合的约束条件。
表2。
| 蛋白质 | 快速分数
| 慢速分数
| 总结合分数（%） |
|---|
| k个关闭1 | 平均停留时间（s） | 分数大小（%） | k个关闭2 | 停留时间（s） | 分数大小（%） |
|---|
| GFP公司 | <1 | <1 | | | | | |
| 过氧化氢 | | | | | >3,600 | >98 | >98 |
| H1° | | | | <0.004 | 183 | >99 | >99 |
| H1°ΔC | 0.082 | 14.4 | 99 | | | | 99 |
| HMGB1标准 | 0.209 | 4.7 | 95.9 | | | | 95.9 |
| HMGN1号机组 | 0.241 | 4.1 | 19.9 | 0.040 | 24.8 | 79.5 | 99.5 |
| HMGN1-E20、E24 | 0.294 | 3.4 | 96.5 | | | | 96.5 |
| HP1β | 0.089 | 11.3 | 88.1 | 0.013 | 73 | 12 | 99 |
| BRG1公司 | 0.326 | 3.1 | 24.9 | 0.51 | 19.4 | 66.2 | 91.1 |
| PCAF公司 | 0.209 | 4.7 | 81 | 0.058 | 17.1 | 12.7 | 93.7 |
| 阿赫勒 | 0.253 | 4 | 42.9 | 0.039 | 25.6 | 56.1 | 98.9 |
| ARNT公司 | 0.137 | 7.3 | 90.1 | 0.032 | 30.9 | 7.8 | 97.9 |
| C/EBP公司 | 0.15 | 6.7 | 64.5 | 0.053 | 18.8 | 35.5 | 99 |
| NF1型 | 0.216 | 4.6 | 34.4 | 0.061 | 16.2 | 58.1 | 92.5 |
| 六月 | 0.169 | 5.9 | 19.5 | 0.037 | 27.3 | 75.2 | 94.7 |
| 福斯 | 0.417 | 2.4 | 32.4 | 0.068 | 14.6 | 54.2 | 86.6 |
| Myc公司 | 0.180 | 5.5 | 45.1 | 0.061 | 16.3 | 54.1 | 99.1 |
| 马克斯 | 0.197 | 5.1 | 64.3 | 0.071 | 13.9 | 34.5 | 98.7 |
| 疯狂 | 0.270 | 3.7 | 76.7 | 0.051 | 19.5 | 21.2 | 97.9 |
| 固定基地计划 | | | | 0.016 | 63.6 | 99.7 | 99.7 |
| XBP公司 | 0.343 | 2.9 | 78.6 | 0.043 | 23.1 | 18.6 | 97.3 |
| 巴西雷亚尔4 | 0.127 | 7.9 | 27.6 | 0.026 | 38.1 | 62.4 | 90 |
在初步建模分析中，我们发现大多数蛋白质的回收动力学可以通过两个指数最准确地拟合（数据未显示）（表和)这表明，大多数蛋白质存在于至少两个具有不同结合动力学的可区分群体的细胞核中。具有两个动力学种群的蛋白质的完整动力学模型如图所示。描述模型的微分方程组如材料和方法所示。为了简单起见，我们将这两个群体称为“快”和“慢”
表3。
| 蛋白质 | 相位数 | 快速分数
| 慢速分数
| 总结合分数（%） |
|---|
| k个远离的 | 分数大小（%） | k个远离的 | 分数大小（%） |
|---|
| 过氧化氢 | 1 | | | 2.2 | <0.1 | 0.2 |
| H1° | 2 | | | 3.75 | 0.3 | 0.3 |
| H1°ΔC | 1 | 4.2 | 7.1 | | | <0.1 |
| HMGB1标准 | 1 | 1.7 | <0.1 | | | <0.1 |
| HMGN1号机组 | 2 | 10.6 | 7 | 17.6 | 17.6 | <0.1 |
| HMGN1-E20、-E24 | 1 | 3.4 | 9.6 | | | <0.1 |
| HP1β | 2 | 11.3 | 4.7 | 8.9 | 12 | <0.1 |
| BRG1公司 | 2 | 11.2 | 5.2 | 2.1 | 1.9 | 0.1 |
| PCAF公司 | 2 | 5.3 | 5.5 | 23.6 | 3.5 | 0.8 |
| 阿赫勒 | 2 | 11.3 | 7.5 | 5.8 | 5.7 | <0.1 |
| ARNT公司 | 2 | 0.9 | 1.2 | 4.7 | 7.2 | 0.7 |
| C/EBP公司 | 2 | 6.7 | 8.5 | 6.2 | 4.8 | 0.4 |
| NF1型 | 2 | 10.7 | 11.7 | 4.1 | 6.9 | 0.2 |
| 六月 | 2 | 6.5 | 4.4 | 1.2 | 1.1 | 0.4 |
| 福斯 | 2 | 1 | 7.9 | 4.5 | 4.7 | 0.5 |
| Myc公司 | 2 | 16.7 | 23.4 | 10.1 | 19.5 | <0.1 |
| 马克斯 | 2 | 9.3 | 13.8 | 12.4 | 25.8 | <0.1 |
| 疯狂 | 2 | 3.9 | 10.4 | 8.2 | 10.4 | <0.1 |
| 固定基地计划 | 1 | | | 0.3 | 0.13 | <0.1 |
| XBP公司 | 2 | 3.8 | 1.9 | 7.9 | 7.9 | <0.1 |
| 巴西雷亚尔4 | 2 | 8.4 | 8.2 | 3.3 | 3.6 | 0.6 |
表4。
| 蛋白质 | Akaike信息准则一
|
|---|
| 2站点模型 | 单站点模型 |
|---|
| 过氧化氢 | 不适用 | −3.82 |
| 上半年0 | −2.8 | −2.74 |
| HMGB1标准 | 不适用 | −2.94 |
| HMGN1号机组 | −3.23 | −3.02 |
| HP1β | −4.1 | −3.28 |
| BRG1公司 | −3.16 | −2.85 |
| PCAF公司 | −3.04 | −2.74 |
| 阿赫勒 | −2.56 | −2.30 |
| ARNT公司 | −3.56 | −3.27 |
| C/EBP公司 | −3.54 | −3.08 |
| NF1型 | −3.11 | −2.84 |
| 六月 | −3.87 | −3.29 |
| 福斯 | −2.77 | −2.55 |
| Myc公司 | −2.71 | −2.54 |
| 马克斯 | −3.20 | −2.95 |
| 疯狂 | −3.17 | −2.54 |
| 固定基地计划 | 不适用 | −3.31 |
| XBP公司 | −3.09 | −2.43 |
| 巴西雷亚尔4 | −3.44 | −2.89 |
染色质相关蛋白在体内的定量结合特性。
使用这个动力学模型，我们在计算机上模拟了FRAP实验，以获得实验数据和模拟之间的最佳拟合（图。). 通过使用广义最小二乘法（图。和表). 所有最佳拟合参数的误差幅度通常约为测量值的10%，方差系数如表所示获得的值基于这样的假设，即可用的特异性和非特异性结合位点的总数超过观察到的蛋白质的分子数。为了确保包含两种不同类型结合位点的动力学模型比简单的单位点模型更准确，我们确定了单位点或双位点模型的所有蛋白质的最佳参数拟合，并根据Akaike信息标准评估了拟合优度（表). 除H2B、HMGB1和FBP外，所有蛋白质都更准确地符合双位点模型（图。和表).
二者k个远离的从双位点结合模型获得的速率通常相差大约一个数量级（表)：快速增长的人口k个远离的0.15至0.3之间，且人口缓慢k个远离的在0.03和0.07之间（表). 这些值对应于停留时间（定义为1/k个远离的)3到6秒的快速人口和15到30秒的缓慢人口（表). 发现Jun和XBP的最短平均停留时间为～2 s，而FBP和HP1β的最长平均停留时间是～70 s。作为对照，GFP的标称平均停留时间小于1 s，这在我们的实验误差范围内（表). 我们确认核心组蛋白的平均停留时间约为小时（表). 此外，根据之前的定性报告，我们确定了H1的平均停留时间0约3分钟，H10-ΔC突变体缺乏整个C末端，DNA结合活性严重降低，平均停留时间约为14s（表) (43). 当对单一结合位点模型进行拟合时，大多数蛋白质的平均停留时间约为5到30秒（数据未显示）。很可能存在的具有更快结合动力学的种群低于我们的时间分辨率极限。然而，计算机模拟表明，实验观察到的FRAP回收动力学与亚秒范围内的大量平均停留时间不一致（数据未显示）。
接下来，我们通过使用最佳拟合分析来确定每种蛋白质的快速和慢速组分的相对大小。根据所分析蛋白质的不同功能，可以预期，大多数蛋白质表现出不同的停留时间组合以及慢结合组分和快结合组分的相对比例（表). 对于某些蛋白质，主要部分显示出快速结合，而对于其他蛋白质，快速部分仅代表少数群体（表). 例如，只有大约20%的BRG1或Jun分子处于快速部分，而超过80%的PCAF或ARNT分子构成快速部分（表). 作为对照，我们发现HMGN1核小体结合活性的受损会导致慢组分的完全丧失，并使快组分增加到96%以上，而野生型蛋白质的这一比例低于20%（表).
HMGB1和FBP这两种蛋白质更准确地适用于单位点模型，尽管它们的平均停留时间相差很大（表和). 虽然DNA结合蛋白HMGB1是一种快速结合蛋白，其整个群体的平均停留时间为～4 s，但TFIIH相互作用蛋白FBP的整个群体平均停留时间超过60 s（表). HMGB1的短平均停留时间与其通过与染色质的瞬时相互作用刺激染色质重塑的作用一致(5).
结构蛋白总的趋势是周转较慢。平均停留时间为72 s的HP1β慢速组分的平均停留时间是所有蛋白质中最长的，尽管80%以上的蛋白质在11 s内翻转，但即使在快速组分中，该平均停留时间也是最长的（表). 这种长停留时间与FBP在RNA结合中的作用不一致。同样，HMGN1相对较长的平均停留时间24.8秒，加上其接近80%的大缓慢部分，使其成为更稳定的相关蛋白质之一（表). 因此，尽管结构蛋白与染色质的相互作用是非常短暂的，但其较低的周转率可能对建立和维持稳定的染色质结构域至关重要(12).
两种酶促染色质相关蛋白BRG1和组蛋白脱乙酰酶PCAF显示出非常不同的动力学曲线（表). BRG1主要以相对较慢的部分存在，平均停留时间约为20秒；相比之下，PCAF在快速组分中高度富集，平均停留时间小于5s。这种差异可能反映了蛋白质的不同功能，因为PCAF可能会在一种非常快速的酶反应中修饰组蛋白尾部，而BRG1可能需要更长的时间来引起染色质重塑所涉及的结构变化。
转录激活物ARNT主要存在于快速交换的部分中（90%），只有约8%的总ARNT结合时间更长（30秒）。这个慢片段的大小类似于基于转录参与的AhR-ARNT复合体中ARNT片段的定位数据的估计(20). 此外，估计约42%的AhR快速部分与估计与细胞转录位点相关的部分在相同的范围内。这些数据与ARNT扫描潜在靶基因，然后将AhR临时招募到这些基因中，从而激活这些基因的模型一致(20).
这些结果的总和表明，瞬时结合是体内许多染色质相关蛋白的共同特征，染色质相关蛋白质存在于几个动力学上不同的群体中，在稳定状态下，每个蛋白质的主要群体与染色质结合，而不是以可溶性形式存在于核质中。
讨论
我们在这里描述并应用了一种结合显微计算的方法来分析活细胞细胞核中各种蛋白质与染色质的结合动力学。我们通过定量分析发现，瞬时结合是许多染色质相关蛋白的共同特性。平均停留时间通常约为2至20秒，对于大多数蛋白质而言，未检测到大量静止相关分子。虽然我们不能严格排除由于荧光标记蛋白的过度表达而导致更稳定的相互作用检测被模糊的可能性，但有几条证据反对这种说法，对于一系列代表内源性蛋白质谱的蛋白质，观察到具有类似停留时间的瞬时结合，其内源性结合位点的丰度和数量不同。如果内源性丰度和可用结合位点等因素以批判性和人为的方式决定了我们的结果，则预期会有更大的停留时间范围。其次，在几种细胞类型中，给定蛋白质的动态行为相似，但在给定的细胞类型中观察到蛋白质之间的差异。第三，我们的方法可以检测到相对较小的蛋白质组分。我们估计过表达蛋白的丰度通常在每核10000到100000个分子之间(18). 由于检测动力学部分的灵敏度约为总蛋白质的5%（表)，可以检测到500到5000个分子的不同动力学种群。因此，即使是相对低丰度的结合事件也可以检测到一个过度表达的蛋白质池。第四，对所有病例中的野生型和突变蛋白对进行比较，发现突变蛋白的停留时间显著缩短，表明观察到的野生型蛋白结合较慢并不是由于非生理结合。第五，我们的结果与许多表征良好的实验系统中的定性观察结果一致(3,8,13,16,17,30,31,35,38,40,51,57,59). 例如，在HP1的情况下，FRAP实验在瞬时和稳定表达系统以及基因替换系统中获得了类似的结果(13,23). 重要的是，HP1及其酵母同源物swi6的动态特性与GFP融合蛋白的表达水平无关(12). 由于HP1的行为与此处观察到的几种蛋白质类似，因此这些结合事件可能也代表了这些蛋白质的生理行为。此外，尽管我们不能严格排除FRAP动力学中的某些延迟是由于非染色质介导的结合，例如与核基质或储存室的结合，六种染色质相关蛋白的FRAP曲线对影响染色质结合的突变的敏感性表明，我们的测量结果确实主要反映了与染色质的结合。
虽然我们可以将大多数蛋白质的实验数据准确地拟合到包含两种不同结合类型的动力学模型中，但这两种动力学组分的生物学意义尚不清楚，对于每个蛋白质来说可能不同。人们很容易认为快速和慢速组分代表每个蛋白质的非特异性和特异性结合事件。然而，由于无法准确确定关键参数，例如内源性分子和结合位点的数量以及大多数分析蛋白质的外源性和内源性蛋白质的比率，因此很难推广这种解释。每个动力学组分的生物学意义应在蛋白质对蛋白质的基础上确定。无论如何，产生不同动力学组分的最可能原因是转录因子与不同类型的靶序列发生功能性结合时的临时固定。由于蛋白质与染色质的功能相互作用而调节蛋白质动态特性的充分记录的例子包括类固醇受体，其在用配体刺激时暂时固定在靶基因上(59)，RNA聚合酶I和II在转录参与时(3,17,35)以及与修复和复制位点相关联的DNA修复和复制因子(30,31,57).
虽然我们的测量提供了停留时间的估计，但它们并没有解决染色质上蛋白质交换的潜在原因。几十秒或几十分钟的平均停留时间不太可能简单地反映自发的交换事件，但可能表明参与了监管活动。据报道，在激素激活期间伴侣家族成员对特定基因的招募，以及分子伴侣活性对糖皮质激素受体（GR）和孕酮核受体流动性的影响(21,25). 同样，蛋白质组活性影响糖皮质激素和雌激素受体的交换动力学(55,58,59). 此外，染色质重塑在GR主动交换中的作用已被提出，因为GR在重塑过程中似乎主动从模板中移位(24,29,45). 重要的是要确定这些活性过程是否仅限于控制类固醇受体的结合，或通常参与染色质上蛋白质的快速交换。
染色质相关蛋白的3D基因组扫描模型。
我们对所有分析的染色质相关蛋白的瞬时结合和大结合分数的观察支持这样一个模型，即染色质相关蛋白质的单个分子在染色质上停留几秒钟，然后在与新位点结合之前分离和扩散相对较短的时间，很可能在不同的染色质纤维上(53). 虽然我们还没有系统地确定一个分子在两次结合事件之间通过核质扩散的时间，但对连接体组蛋白H1的初步观察表明，这一时间约为200至400 ms（T.Misteli，未发表的观察）。无论如何，染色质相关蛋白与大量结合分子的动态交换产生了一种稳定状态，在这种状态下，主要结合分子通过染色质纤维之间的扩散跳跃，不断对基因组进行取样，以寻找合适的结合位点。这种作用模式是确保整个细胞核内染色质相关蛋白可用性的一种有效方法，也是一种将蛋白质有效靶向其结合位点的简单方法(42).
染色质上的动态蛋白质相互作用网络。
染色质相关蛋白的动态交换对染色质功能和基因调控具有重要意义。蛋白质与基因组中某一位点的特征性瞬间结合导致特定结合位点的分子高通量流动。因此，维持蛋白质的占有率或染色质上的蛋白质复合体，需要持续供应相关因子。酵母中已证明需要持续供应阻遏物，其中交配型基因的沉默需要其沉默剂的持续存在(11). 同样，在哺乳动物细胞中，活性核糖体基因的持续维持以及预启动和转录复合物的形成需要聚合酶组分的不间断供应(17).
由于蛋白质-色素相互作用的不稳定性，基因组中任何特定位点的潜在结合伙伴之间的简单竞争成为染色质状态的主要决定因素(42,53). 任何蛋白质解离后，可用的结合位点都会被多种结合因子竞争。由于这种竞争的结果在很大程度上取决于竞争因子的局部浓度和亲和力，因此动态竞争是一种简单但有效的调节染色质状态的手段。例如，在酵母和哺乳动物的异染色质中，仅与染色质短暂结合的强制性结构蛋白HP1，在染色质致密状态发生改变后，可在几分钟内从着丝粒周围异染色素中被取代(13). 类似地，GAL4激活剂在报告系统中的表达果蝇属可以克服异色沉默，很可能是通过影响沉默因子的结合位点占有率(1). 虽然这些例子由两个已知的竞争对手组成，但作用于染色质的更复杂的动态相互作用网络可能很常见。其中一个网络是最近在活细胞中描述的连接蛋白组蛋白H1和多种HMG蛋白之间的动态竞争相互作用(7,8). 多个蛋白质以这种方式以动态相互作用网络的形式相互作用，可以解释基因表达系统的一些最普遍的特性，例如快速反应、可塑性、多样性、稳健性和信号整合。由于蛋白质与染色质的瞬时结合是这种相互作用网络的关键组成部分，我们认为染色质相关蛋白质的动态性质是基因调控过程的一个关键特征(42,53).
致谢
我们感谢T.Kerppola、D.Levens和E.Prochownik提供的试剂。
J.V.的部分资金来自捷克共和国科学院的IAA5039103拨款和教育、青年和体育部的MSM111100003拨款。D.T.B.得到了NSF拨款MCB-0235800的支持。J.V.承认收到了《细胞科学杂志》旅行奖学金。T.M.是Keith R.Porter细胞生物学基金会的研究员。
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