的不同功能阿尔德1和拉尔德2在胚胎视黄醇信号通路配体生成的控制中

RNA转录与翻译

小鼠全长cDNA阿尔德1，鼠标拉尔德2、和人类ALDH3型从SP6启动子在体外转录的有意义方向上亚克隆到质粒pSP65（Promega，Madison，WI）中。将质粒线性化，并用SP6 RNA聚合酶进行体外转录，用7-甲基鸟嘌呤核苷覆盖5′，然后用大肠杆菌poly（A）聚合酶产生全长mRNA[维泽（Vize）等。, 1991]. 以这种方式生成的mRNAs在水中的浓度达到0.2µg/µl，并使用0.4µg在兔网织红细胞裂解物中进行体外翻译（Stratagene，CA），以监测mRNA生成全长蛋白质的能力。

青蛙胚胎微量注射与RA检测

非洲爪蟾胚胎是通过人工受精产生的，并按照前面所述进行分期Nieuwkoop和Faber[1994]如前所述，将胚胎置于1×MMR，3%Ficoll-400中，室温下微量注射mRNA[Kay，1991年]. 使用Nanoject显微注射装置（Drummond Scientific，Broomall，PA）将不同数量的mRNA（4.6–23.0 nl，浓度为0.2 ng/ml的水溶液）注射到2–4细胞期胚胎的植物极中，该装置安装在预先填充轻质矿物油的微移液管上。注射后4小时，将胚胎转移至0.1×MMR并孵化至第8阶段（囊胚）。

RA是通过使用RA报告细胞系F9-RARE-lacZ的生物测定检测到的[瓦格纳等。, 1992]. 该细胞系来源于小鼠F9细胞的稳定转染，转染的转基因包含RA反应元件，可驱动lacZ公司F9-RARE-lacZ通过检测这种脂溶性分子从胚胎向周围报告细胞的扩散来检测培养胚胎外植体中RA的存在。生物测定爪蟾RA按照之前对小鼠胚胎的描述进行[安（Ang）等。，1996年a]. 简单地说，F9-RARE-lacZ细胞生长到80-90%融合，此时阶段8爪蟾将胚胎放置在报告细胞单层的顶部，孵育18h，然后固定在1%戊二醛中，并测定其产生的β-半乳糖苷酶活性lacZ公司表达式。爪蟾放置在报告细胞上并在标准哺乳动物细胞培养条件下孵化的胚胎没有进一步发育，但在检测期间保持完整。

抗体的产生和Western Blot分析

小鼠ALDH1和RALDH2蛋白在大肠杆菌菌株BL-21的N端融合血吸虫使用pGEX表达载体的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）（瑞典乌普萨拉法玛西亚生物技术公司）。一个1.6 kb的小鼠全长cDNA阿尔德1[徐等。, 1999]在pGEX-4T-2的EcoRI位点的GST下游克隆。同样，一个1.6 kb的小鼠全长cDNA拉尔德2（如上所述）被克隆到pGEX-4T-3的EcoRI位点。用0.1%的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导转化的BL-21培养物后，两种结构都产生了分子量约为84000的融合蛋白（GST~29 kDa加ALDH~55 kDa）。如前所述制备的ALDH1-GST和RALDH2-GST融合蛋白包涵体制剂[多明戈等。, 1992]溶解在莱姆利样品缓冲液中，并使用标准技术在制备性SDS-PAGE凝胶上解析[萨姆布鲁克等。, 1989]. 用0.05%考马斯亮蓝在水中对凝胶染色1小时后，切除84 kDa融合蛋白并将其分为200µg等分。每一种都用弗氏佐剂进行了吉祥物注射，并使用标准技术对兔子进行了四个月的注射[哈洛和莱恩，1988年]. 使用100µg小份特异性ALDH-GST融合蛋白电印迹到PVDF膜上，从抗血清中亲和纯化抗体，并按照前面所述进行定量[Haselbeck和Duester，1997年].

如前所述，对成年小鼠组织匀浆（FVB/N）进行Western blot分析[Haselbeck和Duester，1997年].使用ECL化学发光检测试剂盒（Amersham）对蛋白质印迹进行免疫化学检测。使用浓度为0.02µg/ml的ALDH1和RALDH2一级抗体。剥离电印迹膜，并使用每个亲和纯化抗体重新分析。

ALDH1和RALDH2蛋白在成年小鼠组织中的分布

自从老鼠的强制表达阿尔德1和拉尔德2中的基因爪蟾胚胎导致RA合成，我们产生了针对这两种酶的抗体，以检查它们在小鼠中的分布模式。采用小鼠ALDH1和RALDH2全长蛋白多克隆抗体，通过Western blot分析检测成年小鼠组织提取物。这两种抗体都检测到55kDa的蛋白质，这是ALDH亚单位的预期大小，但每种蛋白质的分布非常不同。在全眼、肺、食道（弱）、胃、肝、小肠、大肠、肾上腺、卵巢、子宫、睾丸和附睾的提取物中观察到ALDH1免疫检测，在全脑、胸腺、心脏、肾脏或皮肤的提取物中未发现ALDH1(图3). 另一方面，在用RALDH2抗体检查所有上述组织后，仅在非常有限的一组组织中观察到免疫检测，包括卵巢（弱）、子宫和睾丸(图3). 根据我们观察到的ALDH1在含有维甲酸依赖性上皮的许多成人器官中广泛出现，但RALDH2在少数生殖器官中的定位更为局限，ALDH1可能在成人组织RA合成中发挥比RALDH2更广泛的作用。

在单独的窗口中打开

图3

成年小鼠组织的蛋白质印迹显示ALDH1和RALDH2蛋白抗体的特异性。组织提取物以每条泳道20µg的总蛋白加载。用每个抗体依次检测印迹，每个病例中检测到的蛋白质为55kDa。

我们的ALDH1蛋白分布与阿尔德1mRNA，以前在小鼠肝脏、肠、肺和睾丸中观察到，但在肾脏、大脑或心脏中未观察到[洛佩斯·费尔南德斯和德尔·马佐，1997年；徐等。, 1999]. ALDH1抗体的特异性还表现为肺、肝和睾丸中存在强信号，但肾脏中完全没有信号(图3)，结果与之前关于小鼠ALDH1酶活性在成年器官中分布的研究结果相一致[劳特和霍姆斯，1985年]. RALDH2抗体的特异性通过我们在睾丸而不是肝脏中检测到的蛋白质信号来显示(图3)，从而与之前的研究相匹配拉尔德2mRNA在成人组织中的分布[赵等。, 1996]. 由于成年小鼠肝脏含有丰富的ALDH1酶活性[劳特和霍姆斯，1985年]和阿尔德1信使核糖核酸[洛佩斯·费尔南德斯和德尔·马佐，1997年]，肝脏中没有信号表明RALDH2抗体没有检测到ALDH1。此外，ALDH1和RALDH2抗体不能识别另一种相关的细胞溶质酶，即ALDH-PB，这可以通过成人肾脏中缺乏信号来证明(图3)之前已经证明含有丰富的ALDH-PB[徐等。, 1999]. 由于这些结果表明，ALDH1和RALDH2抗体具有高度的特异性，并且彼此之间或与ALDH-PB之间没有明显的交叉反应，因此它们适合于胚胎蛋白定位的研究。

小鼠早期胚胎发育过程中ALDH1和RALDH2蛋白在颅骨和躯干的不同定位

我们对小鼠胚胎发生E7.5-E10.5阶段ALDH1和RALDH2的整体免疫组化分析的总体结果总结如下表1未对E10.5以上的胚胎进行详细检查，但对选定的器官进行了检查。

E7.5（未显示数据）或E8.5未检测到ALDH1蛋白(图4A)但在E9.0首次在颅骨部位，尤其是中脑腹侧弯曲处检测到(图4B). 通过E9.5，在几种颅骨衍生物中检测到ALDH1蛋白，包括中脑腹侧、视网膜背侧和胸腺原基(图4C). 在E10.5，ALDH1蛋白在中脑腹侧、视网膜背侧、胸腺原基和耳小泡中被观察到，在一个躯干组织中，在中肾管中也被观察到(图4D). 有趣的是，沿着中肾的前后轴，ALDH1在前肢和后肢芽后方的区域定位更高(图4D).

在单独的窗口中打开

图4

小鼠胚胎发生E8.5–E10.5阶段ALDH1和RALDH2蛋白的定位。对胚胎进行整体免疫组化，并在拍照之前在苯甲醇：苯甲酸苄酯（1:2）中清除。由于清胚的透明性，双侧结构的两部分同时被观察到。al，尿囊间质；c、 体腔间充质；cl，泄殖腔；dr，视网膜背侧；mes，中脑腹侧曲；mg，中肠；mn，中肾管；op，视小泡/额onasal肿块；耳，耳囊泡；som，somite；你的胸腺原基。

RALDH2的定位在很大程度上与ALDH1的定位不重叠，主要发生在躯干组织中。在近轴中胚层直至头巾底部的E7.5–E8.0处检测到RALDH2蛋白（数据未显示）。在E8.5–E9.5，RALDH2蛋白在发育中的体节、轴旁中胚层、邻近心脏的体腔间充质和尿囊间充质中检测到，而在腹侧视小泡和额鼻周围区域短暂检测到(图4E-G). 通过E10.5，RALDH2定位于几个躯干组织，包括体节、体腔间质、心包、泄殖腔、中肠和中肾管(图4H). E10.5时，视泡或额鼻区不再有RALDH2信号(图4H).

ALDH1和RALDH2蛋白在胚胎神经组织中的定位

切片的免疫组织化学分析表明，E9.0定位于中脑腹侧的中脑中明确存在ALDH1蛋白（数据未显示），并继续定位于E10.5，而RALDH2蛋白在该位置缺失(图5A、B). 在E10.5期，ALDH1和RALDH2在前脑、后脑或中脑背侧均未表达(图4). 切片还显示E11.5时视网膜背面有丰富的ALDH1蛋白(图5C)晶状体和E14.5处的背视网膜(图5D)，但这些组织中均未检测到RALDH2(图5E，数据未显示）。E11.5也将ALDH1蛋白定位于耳泡的内侧，而RALDH2在该组织中未检测到(图6A、B).

在单独的窗口中打开

图5

神经组织中ALDH1和RALDH2蛋白的免疫组织化学定位。在中脑腹侧弯（mes）中，对E10.5胚胎进行的免疫组织化学分析显示，冠状切片中存在ALDH1(A类)但不是RALDH2(B). 在眼睛的冠状切片中，ALDH1免疫检测发生在E11.5的背视网膜（ret）(C类)E14.5处的背视网膜和晶状体(D类)，未检测到RALDH2(E类). 在E12.5肱脊髓横切面上，ALDH1蛋白缺失(F类)但在运动神经元和脑膜中检测到RALDH2蛋白(G公司).

在单独的窗口中打开

图6

免疫组织化学显示ALDH1和RALDH2蛋白的器官特异性定位。对冠状切片的E11.5胚胎的分析表明，ALDH1蛋白存在于耳囊的内侧部分和双侧胸腺原基（thy）中(A类)而RALDH2在这些组织中不存在(B). 在E11.5肾上腺胚芽的矢状切片中，检测到ALDH1蛋白(C类)，但不是RALDH2蛋白(D类). 在E14.5，发育中肾脏的矢状切面显示ALDH1蛋白缺失(E类)但RALDH2蛋白丰富且主要定位于肾皮质(F类).

尽管RALDH2蛋白在E9.5时从视小泡消失后未在颅神经组织中检测到，在E10.5之前的神经管中也未检测到，但在发育后期的躯干神经组织中，尤其是在E12.5时脊髓脑膜和支配前肢的运动神经元中检测到(图5G). 脊髓运动神经元中RALDH2的表达仅限于分别与发育中的前肢和后肢相邻的臂和腰区域（数据未显示）。在脊髓中未检测到ALDH1蛋白(图5F).

阿尔德1和拉尔德2两者在胚胎RA合成中的作用

我们测试了老鼠阿尔德1和拉尔德2以及人类ALDH3型，可通过在体内异位表达刺激RA合成爪蟾胚胎。使用此处描述的RA生物测定，内源性RA在爪蟾胚胎从受精到囊胚阶段8，因此提供了一个大的时间窗口，在此期间胚胎可以注射ALDH mRNA，并在基本上没有背景检测的情况下检查对RA合成的影响。该分析进一步依赖于以下事实：爪蟾鸡蛋和胚胎含有大量维生素A底物视网膜，即RA的直接前驱物[Plack和Kon，1961年；克里奇牛皮纸等。, 1994；布隆伯格等。, 1996]. 根据我们的研究结果，我们得出以下结论：阿尔德1或拉尔德2在体内试验中刺激RA合成，但人类的表达ALDH3型不会导致这种结果。这些观察结果表明阿尔德1和拉尔德2可以催化RA合成爪蟾胚胎使用内源浓度的底物、辅酶和任何其他可能影响酶活性的因素。

我们的分析表明，RALDH2作为RA合成酶在爪蟾胚胎。体外酶分析表明，大鼠RALDH2的催化效率大约是大鼠ALDH1的15倍[王等。, 1996；庞兹等。, 1997]. 因此，ALDH1和RALDH2的生理和生化分析都提供了证据，证明这些酶确实作为RA合成酶发挥作用，而RAHDH2具有更高的活性。人类ALDH3缺乏RA合成活性，这与之前的研究结果相符，表明该酶缺乏视网膜氧化为RA的体外活性[吉田等。, 1992]. 这表明并非所有的ALDH都被设计为具有RA合成酶的功能。

ALDH1和RALDH2蛋白在早期胚胎中相对于RA分布的定位

以前有报道称，在小鼠胚胎发生过程中，后天对RA的最初合成有偏好[霍根等。, 1992]，并可能对Hox基因进行差异调节，这有助于在早期发育过程中建立前后轴[卢夫金，1996；Shimeld，1996年]. 先前对小鼠胚胎的研究表明，RA最初只存在于E7.5–E8.0的躯干中；从E8.5到E10.5，躯干中仍有较高水平的RA，但现在在视小泡和额鼻周围区域可以检测到RA[罗桑等。, 1991；安（Ang）等。，1996年a]. 在这里，我们发现更活跃的RA合成酶RALDH2最初定位在E7.5–E8.0的躯干中，并在E8.5–E10.5的躯干组织中继续高度定位，但在E8.5-E9.5的腹侧视小泡和周围额鼻区中短暂定位。以前的研究表明拉尔德2mRNA也主要定位于E7.5–E10.5的躯干组织中，在视泡区短暂表达[尼德雷瑟等。, 1997]. 相反，活性较低的RA合成酶ALDH1最初定位于E9.0的颅骨组织（中脑腹侧），然后定位于E9.5–E10.5的几个颅骨组织，包括中脑腹部、视网膜背侧、耳泡和胸腺原基。我们之前报道过那只老鼠阿尔德1mRNA从E7.5开始可检测[Ang和Duester，1997年]，但由于我们目前的结果表明，直到E9.0才能检测到ALDH1蛋白，所以这种酶在E9.0之前不太可能促进RA的合成。

这里检测到的ALDH基因的表达模式与RALDH2在躯干和额鼻区产生RA的功能一致，并且RALDH2和ALDH1在视小泡中都有助于RA的形成。事实上，拉尔德2E8.5晚期的−/−基因敲除小鼠胚胎（相当于我们的E9.0）显示出在躯干和额鼻区域RA检测完全消失，但在视觉囊泡中仍可以检测到一些RA[尼德雷瑟等。, 1999]可能由ALDH1生产。此外，我们认为ALDH1可能在其他几种颅骨衍生物中产生RA，在这些衍生物中检测到这种酶，但在以前没有检测到RA的情况下，如下所述。

ALDH1最初定位于胚胎颅骨衍生物

先前的研究表明，胚胎背视网膜（从E9.5开始）是小鼠胚胎发生过程中ALDH1（以前称为AHD2）蛋白质积累的主要部位[麦卡弗里等。, 1991]. 有令人信服的证据表明，ALDH1在视网膜发育过程中和成人视网膜中有助于RA的合成[麦卡弗里等。, 1991,1993,1999]. 在这些研究中，用于定位ALDH1的抗体是针对苯巴比妥诱导的大鼠细胞溶质ALDH制备的[Lindahl和Evces，1984年]它与ALDH1不同，共有90%的身份[徐等。, 1999]. 显然，这种大鼠ALDH-PB抗体与小鼠视网膜背侧的ALDH1有一些交叉反应，后者含有特别高水平的这种酶，但这种抗体可能会遗漏ALDH1定位的其他位点。我们在这里描述的小鼠ALDH1抗体确实在视网膜背侧和晶状体中检测到ALDH1，但我们的研究表明，ALDH1蛋白也定位于眼睛外的其他几个颅骨结构中，这是以前没有报道过的。此外，此处描述的小鼠ALDH1抗体不会与上述小鼠ALDH-PB发生交叉反应。

我们发现ALDH1在E9.0–E10.5中脑屈肌腹侧定位。这一发现表明，腹侧中脑可能是大脑发育过程中RA合成的一个部位。然而，对转基因RA报告小鼠胚胎的分析并没有发现RA在中脑腹侧的检测[罗桑等。, 1991；巴尔干半岛等。, 1992]. 如果RA确实存在于该组织中，则其水平可能过低，无法在这些报告小鼠中检测到，或者报告基因可能在中脑无反应。与ALDH1在中脑腹侧E9.0的初始定位一致，该组织启动中脑多巴胺能神经元的发育[佩罗内·卡帕诺和迪·波齐奥，1996年]，表明ALDH1可能在此事件中发挥作用。RA和维甲酸受体被认为在胚胎发育后期和成年期参与多巴胺信号传导[克雷泽尔等。, 1998；瓦尔德奈尔等。, 1998]在胚胎发育后期和成年期，ALDH1蛋白定位于中纹状体和中边缘多巴胺系统的轴突和末端[McCaffery和Dräger，1994年]. 有趣的是，我们之前报道过那只老鼠肾上腺4（编码视黄醇脱氢酶，能够将视黄醇转化为视网膜）也在E9.0–E10.5中脑屈肌的腹侧表达[Haselbeck和Duester，1998年b]. 这表明，当中脑多巴胺能神经元首次发育时，ADH4和ALDH1可能协同将视黄醇在中脑腹侧局部转化为RA，但到目前为止，还缺乏在该部位存在RA的直接证据。

在E10.5–E11.5阶段发现耳囊含有ALDH1蛋白。观察到表达是不对称的，免疫检测仅发生在囊泡的中间部分。肾上腺4耳泡内侧也有表达[Haselbeck和Duester，1998年b]. 自从有人提出RA在内耳发育中的作用[科里和布雷菲尔德，1994年]因此，有理由认为ADH4和ALDH1可能在局部将视黄醇转化为RA以分化耳囊泡。然而，转基因RA报告小鼠胚胎在耳泡中没有检测到RA[罗桑等。, 1991；巴尔干半岛等。, 1992]，表明RA水平可能较低或报告基因在该组织中无反应。

胸腺原基在第三臂袋腹侧发育为两个对称的上皮细胞伸长，然后向尾部迁移并融合形成胸腺[史密斯，1965年；科迪尔和豪蒙特，1980年]. 我们在E9.5–E11.5的胸腺原基中检测到ALDH1蛋白，但没有检测到RALDH2蛋白，这表明ALDH1可能催化胸腺发育所需的局部RA合成。正如在转基因RA报告小鼠胚胎中观察到的那样，由于发育中的胸腺原基靠近明显含有RA的躯干组织的边界，因此尚不清楚胸腺原原基本身是否在此类报告胚胎中检测到RA[罗桑等。, 1991；巴尔干半岛等。, 1992]. 然而，对RAR缺失突变小鼠的分析表明，存在持续的颈部胸腺和其他胸腺异常，表明维甲酸信号对胸腺的正常发育和尾部迁移是必需的[门德尔松等。, 1994].

RALDH2最初定位于胚胎干组织

我们对E7.5–E10.5小鼠胚胎中RALDH2蛋白定位的免疫组织化学观察在很大程度上与之前发现的有关拉尔德2原位杂交mRNA表达等。, 1997]. 从E7.5-E10.5，RALDH2蛋白在许多躯干组织中广泛存在，如轴旁中胚层、体节、心包、体腔间质和中肾，除腹侧视小泡和额鼻区的短暂表达外，在颅组织中不存在。检查拉尔德2−/−小鼠已经证明，RALDH2实际上对许多躯干结构的发育是必要的，包括体节、心脏、肢芽和中肾管，但也可以看到颅骨缺陷，包括额鼻区截断和耳泡缩小[尼德雷瑟等。, 1999]. 从E8.5到E9.5，RALDH2蛋白定位在额鼻区，这可能解释了其参与RA的产生，促进额鼻发育。拉尔德2在E10.5时，耳泡外侧区有mRNA表达[尼德雷瑟等。, 1997]，这可能是RA局部合成的原因，但我们在此阶段未观察到RALDH2蛋白在耳泡中的定位。

进一步表明，RALDH2对躯干组织产生RA的作用来自于对脊髓的研究，其中RALDH2-而不是ALDH1定位于脊髓。在E12.5中，我们发现RALDH2蛋白定位于支配前肢和后肢的运动神经元，但不位于脊髓的其他区域。以前的研究表明拉尔德2mRNA在小鼠发育的E12.5中高度定位于支配四肢的运动神经元亚群[赵等。, 1996]这一模式与胚胎脊髓肱部和腰部较高水平的RA相一致[McCaffery和Dráger，1994年b]以及这些区域中较高水平的维甲酸-X受体信号[索洛明等。, 1998]. 此外拉尔德2鸡脊髓对运动神经元亚型特征的影响[Sockanathan和Jessell，1998年]. 总之，这些事实为拉尔德2为RA提供一种独特的视黄醇信号事件，该事件规定了支配四肢的脊髓运动神经元的身份。

ALDH1和RALDH2在胚胎中肾、后肾和肾上腺的定位

最初在体节中观察到的高水平RALDH2蛋白在E10.5后显著降低，但在这个阶段，RALDH2蛋白的高水平定位于体腔和中肾管的整个前后轴。肾上腺1编码视黄醇脱氢酶，在mRNA水平上也沿中肾管的整个前后轴表达[安（Ang）等。，1996年a]和蛋白质水平（R.J.Haselbeck和G.Duester，未发表的数据），从而可能建立一种代谢途径，在中肾中将视黄醇转化为RA。有趣的是，ALDH1蛋白也存在于E10.5处的中肾管中，但它沿前后轴分布不均，因此定位最高的是前肢和后肢芽的后部。这种ALDH1定位的中肾模式有助于提高RA向发育中肢芽后部扩散的水平；然而，这显然不足以支持肢体发育，因为拉尔德2敲除小鼠不会形成肢芽[尼德雷瑟等。, 1999].

ALDH1和RALDH2的中肾定位可能也提供了已知的RA，用于正确开发对维生素A缺乏或RAR缺失突变敏感的泌尿生殖道中肾衍生物[威尔逊等。, 1953；门德尔松等。, 1994].拉尔德2−/−小鼠缺乏中肾管，这表明RA是其初始发育所必需的[尼德雷瑟等。, 1999]. 对RAR无效突变的检测表明，当视黄醇信号被破坏时，后肾也不能正常发育[门德尔松等。, 1994]. 在E14.5，我们的研究表明RALDH2而不是ALDH1在后肾中丰富。我们之前已经表明Adh1型在E16.5的后肾中表达[安（Ang）等。，1996年b]因此，提示ADH1和RALDH2可能在该器官中协同将视黄醇转化为RA。

先前的免疫组织化学研究表明，ADH1和ADH4（都是视黄醇脱氢酶）在肾上腺芽基首次形成时就定位于肾上腺芽基[Haselbeck和Duester，1998年a]在E16.5期，在分离的肾上腺中可以检测到RA[哈泽贝克等。, 1997]. 在这里，我们证明了ALDH1蛋白也定位于肾上腺基，从而提供了证据，证明将视黄醇转化为RA的代谢途径的两个步骤所需的酶存在于肾上腺中。

我们为人类感谢L.Hsu和A.YoshidaALDH3型cDNA，用于F9 RARE lacZ报告细胞系的M.Wagner，以及用于批判性讨论的H.L.Ang、L.Deltour和M.Foglio。

合同授予赞助商：NIH；合同授予编号：AA07261。