简介
这个MYC公司原癌基因家族包括MYC公司编码c-Myc，MYCN公司编码N-Myc，以及MYCL公司其编码L-Myc。Myc蛋白是调节生长和增殖相关基因的bHLHZ转录因子(党，2012).MYC公司基因通常是在有丝分裂刺激下被诱导的。然而，致癌激活是通过导致Myc蛋白过度表达和未能下调表达以响应适当的生理信号的事件发生的。
放松调控的Myc家族蛋白转录重编程细胞代谢，以促进增加细胞生长和增殖所需的大分子合成。例如，c-Myc通过增强葡萄糖摄取和乳酸生成，以及为核苷酸、氨基酸和脂质生物合成提供糖酵解中间体，诱导有氧糖酵分解（Warburg效应）党，2013;Vander Heiden等人，2009年). 当这些过程转移TCA循环和线粒体中的碳时，c-Myc还调节促进谷氨酰胺吸收和加工的基因，以促进TCA循环(Gao等人，2009年;怀斯等人，2008年;Yueva等人，2007年)此外，c-Myc通过诱导TFAM公司和其他核编码线粒体基因(Li等人，2005年). 最近的研究表明，c-Myc在细胞周期进入过程中促进脂质代谢(Morrish等人，2010年)和淋巴腺病(Eberlin等人，2014年). 重要的是，细胞通过解除管制而转化MYC公司基因对营养素缺乏或代谢途径抑制引起的代谢应激高度敏感（综述于党，2011).
Myc蛋白在转录因子网络中的功能()(Conacci-Sorrell等人，2014年). 这些蛋白质与小bHLHZ蛋白Max形成异二聚体，后者与DNA中的E-Box序列结合。与Myc竞争Max和E-Box结合的Mxd家族蛋白对抗Myc转录活性。Mxd蛋白的表达通常与细胞周期退出、生长停滞和/或分化相关(胡克和胡林，2006年). 此外，围绕Mlx存在类似Myc的平行网络(Billin和Ayer，2006年). Mlx与MondoA或碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）异二聚体。MondoA与线粒体外膜结合，在那里它可以感知糖酵解中间体，如葡萄糖6-磷酸和线粒体代谢物(Han和Ayer，2013年;Kaadige等人，2009年;斯隆和艾尔，2010年). 代谢物促进细胞质MondoA蛋白的核定位，激活参与葡萄糖代谢的基因转录。（审阅于O'Shea和Ayer，2013年). 此外，Mlx与Mxd家族蛋白的子集异二聚体化，从而将Mlx和Max分支连接到更大的转录因子网络()(Billin等人，1999年;Meroni等人，2000年). 这个网络在后生动物进化过程中是保守的(McFerrin和Atchley，2011年)，表明营养敏感Mondo和营养利用Myc网络分支机构之间的合作。
解除管制的Myc对MondoA的合成致死依赖性（A）简化的Myc网络示意图显示了网络成员之间对异二聚体伴侣（带双箭头的黑线）和基因组E-Box位点的竞争（绿线和红线分别表示转录激活和抑制）。（B–E）P3C1（B）、CB660及其永生化（I-CB660）或Ras-transformed（T-CB660。前凋亡siRNA混合物（siDeath）作为转染效率的阳性对照。所示为平均值和SD（n=3）。（F）在指定条件下，通过指定细胞系对MondoA、c-Myc和N-Myc进行Western blot分析。另请参见图S1和表S1.
因为环境背景可以决定由Myc家族蛋白转化的细胞的存活率，所以我们推断扩展的Myc网络可能在整合环境线索和促进肿瘤存活方面很重要。
结果
放松管制的Myc和MondoA功能丧失之间的合成致命相互作用
为了确定失调的Myc是否依赖于Myc超家族中的其他转录因子，我们对扩展的Myc网络进行了靶向siRNA筛选。该筛选使用了具有多西环素（dox）诱导的c-Myc表达的小鼠成纤维细胞（克隆P3C1）。c-Myc（c-Myc-ON）的诱导导致增殖和凋亡增加以及分化标记Thy1.2的丢失(Eischen等人，2001年;Evan等人，1992年;Sridharan等人，2009年)(图S1A–C). 我们最引人注目的发现是，与c-Myc-OFF细胞相比，敲除MondoA及其专性二聚化伙伴Mlx在c-Myc-ON中显示出合成致死（SL）效应(和S1D系列). ChREBP的敲除没有影响，因为它在P3C1细胞中不表达(图S1E).
为了扩大我们对Myc过度表达细胞对MondoA/Mlx依赖性的观察，我们检测了小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），其中含有两种基因的纯合缺失Mlxip公司，对MondoA进行编码，或Mlx公司（未发布的数据）。与亲代野生型细胞相比Mlxip公司−/−和Mlx公司−/−原代MEFs在c-Myc过表达时表现出生存能力降低和细胞凋亡水平升高。Mlxip公司缺失还增强了Large-T抗原永生化成纤维细胞中c-Myc介导的凋亡，提示p53诱导的凋亡过程(图S1F和见下文）。
接下来，我们在一组人类细胞类型中检测了MondoA敲除（KD）的影响，在每一种情况下，比较了无Myc和有Myc过度表达的细胞。我们发现，使用siRNA的MondoA的KD（siMonA）显著降低了表达c-Myc的P493-6人B细胞系的存活率(和S1G系列). 在过度表达c-Myc（CB660+c-Myc）的人类神经干细胞（CB660）及其缺乏p53和RB肿瘤抑制因子的永生化衍生物（I-CB660+c-Myc(Hubert等人，2013年) (). 对照细胞对siMonA不敏感，表明MondoA功能丧失特别抑制c-Myc被解除调控的细胞存活。MondoA沉默还抑制结肠癌细胞株HCT116、肝细胞癌细胞株HEPG2和卵巢癌细胞株TOV1112D的生长，所有这些细胞都表达高水平的c-Myc(图S1H). 重要的是，针对Mlx的siRNA也在所有测试细胞中引发了相同的反应（数据未显示）。
MYCN公司在大约25%的人神经母细胞瘤（NB）中观察到扩增，并与不良预后相关(布罗德，2003;Huang和Weiss，2013年). 因此，我们检查了对MondoA的N-Myc解除管制的需求，使用逆转录病毒载体获得稳定的MondoA KD(Kaadige等人，2009年)在人NB细胞系中。蒙多阿沉默后，MYCN公司扩增的IMR32和SK-N-BE细胞以及过度表达N-Myc的Tet21N细胞与MYCN公司N-Myc未过度表达的非扩增SH-SY-5Y或Tet21N细胞(). 敲低后MondoA蛋白水平的降低如图所示图S1I。我们没有检测到MondoA沉默后Myc蛋白水平的变化，这表明MondoA的缺失不会通过减少Myc表达来抑制细胞增殖（见下文图S2A、H、I、J). 然而，c-Myc或N-Myc诱导增强MondoA mRNA(图S1J、K)细胞质和细胞核中的蛋白质水平(和S1L系列)在Tet21N和P493-6细胞中。这与我们的N-Myc染色质免疫沉淀数据一致(图S1M)以及ENCODE数据库中的数据（未显示），表明c-Myc与MondoA启动子区结合。
由于MondoA有望与几个Mxd转录因子竞争以结合到Mlx，因此我们调查了Tet21N细胞中N-Myc激活时Mxd1、Mxd4和Mnt的表达水平。N-Myc过度表达降低c-Myc和Mxd4蛋白表达，同时增加Max、Mlx和MondoA蛋白(图S1N). 与此一致，当N-Myc激活时，MondoA靶基因Txnip的表达增加(图S1O). 我们的实验表明，放松调控的Myc改变了Max/Mlx网络以增强MondoA/Mlx转录活性，并且需要MondoA/M1x才能生存和增殖。
MondoA抑制Myc诱导的神经母细胞瘤细胞凋亡
为了研究N-Myc和MondoA之间的功能相互作用，我们使用Tet21N细胞系(Lutz等人，1996年). 存在dox（N-Myc-OFF）的Tet21N细胞表达内源性c-Myc并增殖，但不致瘤。退出dox后，Tet21N细胞中的N-Myc被诱导（N-Myc-ON），细胞在软黄和异种移植物中的增殖和生长增加(Kim等人，2007年;Wasylshen等人，2013年). 我们在四种条件下评估了Tet21N细胞的增殖、细胞周期和凋亡：siCtrl或siMonA加和不加dox。与siCtrl相比，瞬时siMonA阻断了Tet21N N-Myc-ON细胞的增殖，而对N-Myc-OFF细胞几乎没有影响(). 四个单独的siRNAs均能有效沉默MondoA的表达，仅抑制N-Myc-ON细胞的生长，表明我们观察到的表型是MondoA失活的结果(图S2A). 虽然siMonA略微降低了S期细胞的百分比，与N-Myc水平无关，但在siMonA N-Myc-ON细胞中有显著的G1以下细胞积聚，表明细胞凋亡(). MondoA KD也阻断了其靶基因的表达TXNIP公司(和S2B型)(Stoltzman等人，2008年)，并抑制mTOR活性(). 我们还检测到siMonA的p53和p21水平增加，在N-Myc激活后进一步增加(). 我们的数据表明，MondoA可以抑制与N-Myc放松调控相关的应激，并确保细胞周期进展和存活。
MondoA的缺失阻断了N-Myc诱导的增殖和肿瘤发生，同时增强了体内外的凋亡（A）用siCtrl或siMonA处理的Tet21N细胞的生长曲线，无论是否有N-Myc过度表达。所示为平均值和SD，n=3。（B）第3天对A组细胞进行细胞周期分析。（C）亚G1细胞群的时间进程量化。所示为平均值和SD，（n=3）.（D）在siCtrl或siMonA转染后第3天，对有或无N-Myc过度表达的Tet21N细胞中的指示蛋白进行Western Blot分析。（E、F）电镀后第14天，神经母细胞瘤细胞在软琼脂中的典型菌落形态（E）和菌落形成定量（F）。比例尺=20μm。CFU：集落形成单位。所示为平均值和SEM，（n=9）。（G）在Nu/Nu小鼠和终点代表动物中稳定表达shCtrl或shMonA的Tet21N细胞的皮下生长。（H）最终肿瘤重量和终点肿瘤的代表性图像。对于（G–H），显示的是平均值和扫描电镜（n=10）。比例尺=1 cm。（一）对来自（G）的肿瘤中Ki67和裂解caspase 3（CC3）免疫组化阳性的定量显示为平均值和SEM（n=12）。另请参见图S2.
首先通过软琼脂试验评估稳定表达shCtrl或shMonA的Tet21N细胞的致瘤潜力。当shCtrl N-Myc-ON细胞形成大量集落时，shMonA N-Myc-ON细胞形成的集落越来越少(). MondoA沉默也降低了软琼脂中N-Myc扩增细胞系的生长(). 重要的是，shMonA N-Myc-ON细胞克隆效率的降低和表达shMonA的HCT116细胞活性的降低通过表达shRNA-resistant MondoA得以挽救(,S2C、D). 最后，敲除细胞中MondoA的异位表达抑制了N-Myc介导的p53和p21的激活(图S2E)，并恢复MondoA靶基因的表达TXNIP公司(图S2F)，排除了shRNA或siRNA的离靶效应。
我们还进行了稳定表达shCtrl或shMonA的Tet21N N-Myc-ON细胞的皮下异种移植。我们观察到表达shMonA的细胞的肿瘤尺寸和肿瘤重量减小()由于增殖丧失和凋亡激活(和S2G公司). Tet21N细胞中N-Myc蛋白的稳定性(图S2H)以及来自异种移植物的大量裂解物(图S2I)独立于蒙多阿。在P493-6人淋巴瘤细胞系中获得了非常相似的SL相互作用。(和S2J公司). 我们的结论是，在体内外肿瘤生长和存活中，MondoA广泛需要Myc的下游功能。
N-Myc和MondoA协同调节促生长基因的表达
为了询问MondoA缺失是否影响N-Myc功能，我们比较了存在或不存在MondoA时N-Myc激活诱导的转录变化(和S3A、B、C). 总的来说，N-Myc诱导的基因表达变化与MondoA水平高度相关(图S3B). 此外，MondoA敲除不会改变N-Myc诱导后观察到的组蛋白H4乙酰化水平(图S3D)，表明MondoA与Myc共同发挥作用，但不会从根本上改变N-Myc的活性。
N-Myc和MondoA之间的转录协调调节代谢和增殖（A）TreeView生成的热图，表示每个条件下其表达发生改变的所有基因的中位数Z得分.（B）在存在或不存在MondoA的情况下，所有N-Myc上调和N-Myc下调探针的对数折叠变化（Log-FC）。所示为方框图，表示最大值（上线），3第个四分位数（方框顶部），中间值（方框中的行），1标准四分位数（方框底部）和最小值（底线）。（C）N-Myc（存在MondoA）和MondoA（存在N-Myc）调节基因的文氏图。（D）基因本体（GO）分析：显示了N-Myc（白色）、MondoA（灰色）或两者（条纹）上调的基因。（E）N-Myc和MondoA在四种条件下协同上调基因的全球表达谱。编码代谢调节器的基因，如彩色线条所示。（F）MondoA调节基因的GO分析（N-Myc-ON条件）（G）如彩色线条所示，MondoA上调参与脂质和葡萄糖代谢的基因的全球表达谱。另请参见图S3.
然而，尽管在存在或不存在MondoA的情况下，N-Myc的一般转录活性相似，但与siCtrl相比，在siMonA条件下，N-Myc激活和抑制基因的变化幅度显著减弱(). 有趣的是，在将基因表达值标准化为siMonA/N-Myc-OFF条件并比较N-Myc和MondoA单独的相对贡献后，我们观察到一种趋势，即两种转录因子类似地上调或下调了大量共同的基因(图S3E). 具体来说，当N-Myc和MondoA同时存在时，我们分别鉴定出553和587个基因显著上调和下调()
为了评估这些转录谱的功能相关性，我们对N-Myc和MondoA单独和协同调节的基因集进行了基因本体分析（FDR调整的p值<0.05）。N-Myc主要驱动促进细胞增殖和生长的基因表达(，白色条）。然而，N-Myc也需要MondoA最大限度地上调参与这些过程的大量基因(，条纹条）。四种条件下所有协同上调基因的相对表达水平如下所示有趣的是，其中有几个基因对核苷酸生物合成、氨基酸代谢和转运、线粒体生物发生和功能以及TCA至关重要。
我们还发现，非依赖N-Myc的MondoA沉默导致参与氧化还原反应、胆固醇和类固醇代谢的基因以及内质网、细胞外基质、过氧化物酶体和溶酶体成分的表达降低(，灰色条）。特别是，蒙多阿消耗导致SREBP1号机组和SCD公司表达式，以及FASN公司和PCK2系列，分别编码参与脂质和葡萄糖代谢的酶(). 因此，N-Myc单独并与MondoA合作，控制一大组参与增殖、代谢和生长的基因的表达，而MondoA还调节脂质和甾醇生物发生等互补途径。
N-Myc和MondoA的协同转录调控可能有多种机制。为了确定这两个因子是否共同作用于共调控基因的启动子，我们测试了N-Myc和MondoA是否与TXNIP公司promotor，一个真正的MondoA目标，包含三个非规范电子盒。结果表明，这两个因素都与TXNIP公司启动子和N-Myc和MondoA的最大结合需要同时存在这两个因子(图S3F和讨论）。
参与代谢的Myc/MondoA依赖基因的表达是神经母细胞瘤细胞生存所必需的
我们的数据表明，由N-Myc和MondoA调节的基因中有很大一部分与代谢活动有关(). 我们利用qRT-PCR和免疫印迹分析来评估基因子集在微阵列研究中采用的四种条件下的表达，重点关注影响多种代谢途径的基因，并发现所有分析的基因都需要N-Myc/MondoA或MondoA的最大表达(和S4A系列). 这些基因的表达同样受到Tet21N细胞中MondoA异二聚体伴侣Mlx沉默的影响，这与我们观察到的表达变化是MondoA-Mlx异二聚物缺乏的直接结果的概念一致(图S4B). 有趣的是，MondoA或Mlx的沉默会导致这两种蛋白的表达缺失，这表明异二聚体促进了复合物的稳定性(图S4B).
N-Myc和MondoA协同调节Tet21N细胞的代谢和线粒体靶点（A）N-Myc和MondoA协同调节或MondoA依赖靶点子集的Western blot分析。（B）Tet21N细胞在所指示的条件下对葡萄糖刺激的反应的蛋白质印迹分析。（C）用指定的处理方法测定Tet21N细胞的谷氨酰胺（Gln）摄取。所示为平均值和SD，n=3。（D）使用指定的处理方法测定Tet21N细胞的耗氧率（OCR）。所示为平均值和SD（n=3）。（E）对siCtrl细胞或KD为Slc1A5或Slc3A2的细胞中的指示蛋白质进行Western blot分析。（F）表达指示蛋白的细胞或载体对照用siCtrl或siMonA转染，4天后通过台盼蓝排除法计数活细胞。所示为平均值和SD，n=3。（G）用指示的siRNA转染后4天，细胞在有或无Myc表达的情况下的存活率（归一化为相对对照siRNA）。所示为平均值和SD（n=3）。红线表示控件设置为1。另请参见图S4和表S1.
因为我们还观察到P493-6 B细胞的合成致死性，所以我们查询oncomine.org以获取B细胞恶性肿瘤的数据集(Basso等人，2005年;Zhang等人，2013). 我们在伯基特淋巴瘤和其他B细胞恶性肿瘤以及神经母细胞瘤中发现了c-Myc、Mlx（在一个数据集中）和许多靶基因之间的相关性(表S1) (Janoueix-Lerosey等人，2008年;Wang等人，2006年)与通过网络的Myc-Max和MondoA-Mlx臂的协同作用对代谢进行类似转录重编程的概念一致。使用MondoA或Mlx无效的初级MEF，我们发现Slc1A5和Tomm20的表达依赖于Myc和MondoA(图S4C)这意味着c-Myc和MondoA在原代细胞中表现出类似的共同调节模式。
我们还证实，N-Myc需要25 mM葡萄糖和MondoA来完全激活谷氨酰胺（Gln）转运体Slc1A5的表达，这表明MondoA的葡萄糖应答转录活性将葡萄糖利用率与Gln摄取相协调(). 为了确定Tet21N细胞中的MondoA敲除是否影响细胞代谢，我们使用放射性标记的Gln或2-脱氧葡萄糖（2DG）测量碳源摄取。N-Myc激活后，观察到Gln摄取显著增加，而shMonA处理可抑制N-Myc-ON Tet21N细胞中的Gln摄取()以及在c-Myc过表达的MEFs中(图S4D). 与Slc1A5表达的葡萄糖依赖性一致，N-Myc诱导的最大Gln摄取也是葡萄糖依赖性的(图S4E). 相比之下，N-Myc表达或MondoA敲除仅产生2DG摄取的适度增加，并且在对照组和SL条件下未观察到显著差异(图S4F). 此外，虽然细胞外酸化率不受N-Myc表达或shMonA的显著影响(图S4G)，MondoA缺失阻止了N-Myc驱动的谷氨酰胺依赖性耗氧量增加()，证实了表达N-Myc的细胞中MondoA的缺失导致细胞Gln代谢发生根本性变化。
转运体基因表达减少可能至少部分解释了蒙多阿缺失后谷氨酰胺摄取和生存能力降低的原因(和S4A系列). 如前所示，通过核糖体蛋白S6磷酸化（p-RpS6）测定，Gln导入子Slc1A5或反转运子Slc3A2的敲除导致mTOR活性降低() (Duran等人，2012年;Nicklin等人，2009年). 然而，只有Slc1A5沉默减少了Gln的摄取，认为Slc3A2的丢失不会通过阻止Gln的摄入影响细胞活性和mTOR信号(图S4H). 重要的是，虽然Slc1A5的过度表达增强了Gln的摄取(图S4I)，Slc1A5和Slc3A2过表达都不能挽救细胞活力(). 因此，Gln摄取减少并不是观察到的SL表型的唯一原因。
MondoA缺失会减弱其他代谢途径相关基因的表达；因此，我们询问共同调节或MondoA依赖基因的个体KD如何影响Tet21N细胞存活。如所示，针对21个选定靶点中15个靶点的siRNAs在杀死过度表达N-Myc的细胞方面明显更有效。CB660人神经干细胞中这些靶点的一个子集的缺失证实了单基因KD表型在不同细胞系中是Myc特异性的(图S4J).
抑制Myc/MondoA依赖基因诱导p53依赖性合成致死
因为在压力条件下，mTOR和p53的活性通常呈负相关(Feng和Levine，2010年)，我们评估了其他Myc SL代谢基因的个体沉默是否影响p-RpS6和p21水平，分别作为mTOR和p53活性的指标。虽然只有Pfas、Cbs或Pck2的失活才会导致mTOR抑制，但所有敲除都会将p21诱导到不同的水平(). 这表明p53能够感知多种Myc和MondoA调节通路的活性。
MondoA抑制N-Myc诱导的代谢应激（A）在所示条件下用所示siRNA转染Tet21N进行Western blot分析。（B）Tet21N细胞的蛋白质印迹分析显示的蛋白质（−/+N-Myc和−/+nutlin-3a）。（C）在指定条件下，nutlin-3a处理后的细胞活力（Cell Titer Glo）和凋亡（Caspase-Glo试剂）定量。所示为平均值和SEM（n=5）。（D）表达对照或p53 shRNA的Tet21N细胞的活性测定。显示平均值和SD（n=3）。（E）HCT116 p53活性测定+/+和p53−/−敲除MondoA、Mlx和Myc/MondoA靶基因后的细胞。所示为平均值和SEM（n=5）。（F）siCtrl或siMonA处理下Tet21N细胞（−/+N-Myc）中所示凋亡相关蛋白的Western blot分析。（G）表达载体控制的Tet21N细胞（−/+N-Myc）（与)或BCL2转染siCtrl或siMonA，4天后（左）通过台盼蓝排斥法和BCL2蛋白免疫印迹法计数活细胞。所示为平均值和SD（n=3）。另请参见图S6.
为了评估Tet21N细胞对p53激活的反应，我们使用了MDM2拮抗剂Nutlin-3a，它强烈诱导p53和p21，并抑制N-Myc-OFF和-ON细胞的生长(). 然而，无论N-Myc状态如何，Nutlin-3a治疗都不会刺激siCtrl细胞中显著的caspase活性()表明p53激活促进这些细胞的细胞周期阻滞，但不促进凋亡。相反，MondoA单独缺失可促进N-Myc-ON细胞中caspase活性，Nutlin-3a治疗可进一步增强这种活性(). 这意味着N-Myc-ON细胞中MondoA的沉默会诱导凋亡，而p53的激活只会导致MondoA缺失后的凋亡。重要的是，我们仅在N-Myc过度表达时观察到caspase激活。此外，N-Myc-ON细胞中p53的完全敲除只能部分挽救siMonA的活性(). 此外，虽然p53 KD重新建立RpS6磷酸化，但它不会重新建立Myc和MondoA靶基因Pfas和Tomm20的表达，这表明mTOR活性的降低是细胞凋亡的结果，而不是SL表型的原因(图S5A). 此外，HCT116细胞(和5亿)，或CB660电池(图S4J)和MEF过度表达c-Myc(图S5C)对MondoA、Mlx或一些关键Myc/MondoA靶点的丢失同样敏感，与p53状态无关。此外，siMonA还导致HCT116细胞中Slc1A5、Pfas和Tomm20表达缺失，Gln摄取减少，与p53无关(图S5D、E)证实MondoA缺失通过p53依赖性机制促进细胞凋亡，至少部分是这样。
我们还发现蒙多阿的失踪()或Mlx(图S5F)导致促存活Bcl2蛋白的下调，并促进Bid和Bax的促凋亡、截短形式（tBid和tBax）和裂解的Parp的出现，仅在N-Myc-ON细胞中。这些数据表明，在缺乏MondoA的情况下，N-Myc的过度表达需要通过内在的凋亡途径来促进凋亡。然而，强制表达Bcl2不足以挽救N-Myc-ON，siMonA细胞的生存能力(). 这些结果促使我们寻找N-Myc诱导肿瘤发生所需的替代MondoA依赖的代谢途径。
代谢谱显示，N-Myc和MondoA协同调节三羧酸循环的再复性和再复性反应
我们利用基于LC-MS的代谢组学分析，调查了139种代表主要合成代谢和分解代谢途径的前体和中间产物的可溶性代谢物（参见补充实验程序). 如所示，我们检测到四种条件下代谢产物丰度的显著变化。代谢物集富集分析（MSEA）表明，N-Myc的激活广泛地改变了细胞的代谢模式，促进了氨基酸代谢的深刻变化，并导致新嘌呤和脂质生物合成前体的丰度增加(; 蓝色条）。重要的是，在我们的SL情况下，经siMonA治疗后，大多数通过N-Myc诱导而丰富的MSEA类别显示其重要性降低(，橙色条）。与观察到的代谢基因的协同转录调控一致，我们观察到某些代谢物的最大富集，例如核苷酸糖核糖-5-磷酸（R5P）和类异戊二烯香叶基焦磷酸（GPP）依赖于N-Myc和MondoA。我们还观察到MondoA沉默后谷氨酸（Glu）和苹果酸（Mal）水平降低，柠檬酸（Cit）增加五倍(图S6A和数据未显示）。这些数据表明，线粒体功能障碍导致了TCA循环的改变，这与我们观察到的线粒体含量和活性降低以及ROS生成增加相一致(图S6B、C).
N-Myc和MondoA调控途径的代谢组学分析（A）热图描述了四种条件下139种可溶性代谢物的归一化和对数转换代谢组学调查。（A–E）中条形图的颜色代码，白色：siCtrl，蓝色：siCtrl+N-Myc，绿色：siMonA，橙色：siMonA+N-Myc。(B）与siCtrl相比，每种情况下的代谢物数据的代谢集富集分析（MSEA）。显示的是富集的−对数p值，1.34处的红线指示0.05 p值。（C）GC-MS示踪13C类5-用siCtrl或siMonA处理Tet21N细胞（−/+N-Myc）中的Gln 24小时，并对Gln下游的质量同位素进行量化。所示为平均值和SD（n=3）。（D）总柠檬酸盐（Cit）的定量，如（C）所示，归一化为相对细胞数。所示为平均值和SD（n=3）。（E）GC-MS示踪13C类5-如（C）所示，Tet21N细胞中的Gln持续48小时13C类5-由m+（2n）同位素指示的Gln-衍生乙酰辅酶A到棕榈酸酯。显示了从头合成脂肪酸的途径，酶以蓝色显示。所示为平均值和SD（n=3）。（F）用caspase-Glo试剂测量转染siCtrl或siMonA 24小时，然后用载体对照（NT）、ZOL或C75处理48小时的Tet21N细胞（−/+N-Myc）的相对caspase活性。所示为平均值和SEM（n=5）。（G）用指示的siRNA转染Tet21N细胞，转染24小时后用载体（BSA）、BSA+GGOH或BSA-共轭油酸处理，96小时后用Cell-Titer-Glo试剂评估生存能力。显示平均值和SEM（n=5）。（H）对按（G）中所示蛋白处理的细胞进行蛋白质印迹分析。通过方差分析计算所有p值。另请参见图S6和表S2.
由于我们观察到Gln摄取减少和TCA循环中间体丰度的改变，我们直接测试了N-Myc和MondoA如何改变Gln代谢。我们采用了GC-MS方法(Du等人，2013年)追踪均匀标记的贡献13C类5-Gln转化为Glu、α-酮戊二酸（αKG）、Mal、Cit、丙酮酸（Pyr）和乳酸（Lac）。我们选择24小时标记是为了说明TCA上游和下游的代谢物。表明MondoA的缺失导致N-Myc依赖的部分贡献减少13C类5-谷氨酰胺酶反应下游的代谢物池中谷氨酰胺的代谢减少（谷氨酰胺质量+5(13C） =m+5）到Glu（m+5”），αKG（m+5），Mal（m+4），但矛盾的是，不是TCA衍生的Cit（m+4）。我们没有检测到13C类5-Gln对Pyr或Lac有贡献（数据未显示），表明Gln填充TCA，未通过细胞溶质苹果酸酶转化为Pyr，然后通过Ldha转化为Lac。
为了直接测试谷氨酰胺分解和线粒体活性降低是否是合成致死表型的原因，我们评估了Tet21N细胞对营养物质提取和代谢扰动剂的反应(表S2). 这些细胞既依赖葡萄糖又依赖谷氨酰胺，对常见的谷氨酰胺水解扰动剂敏感，如非特异性转氨酶抑制剂氨氧乙酸（AOA）(Szabo等人，2013年;怀斯等人，2008年)OXPHOS复合物I抑制剂二甲双胍（MET）或Pck1/Pck2抑制剂3-巯基吡啶酸（3MP），对H诱导的氧化应激敏感2O（运行）2。我们还测试了路径特异性代谢物对因抑制剂或siMonA治疗而导致的生存能力丧失的修复能力。虽然没有任何一种救援剂可以替代葡萄糖或谷氨酰胺，但每个特定的抑制剂都可以通过被抑制途径下游的代谢物进行救援。HCT116细胞对这些抑制剂的敏感性相似，与p53状态无关(表S2和数据未显示）。
重要的是，没有任何一种用于挽救受损谷氨酸分解的药物，如dmKG、Pyr或强制Slc1A5或Bcl2表达(怀斯等人，2008年;Yueva等人，2007年)足以挽救MondoA的损失(表S2和数据未显示）。因此，我们排除了单纯的回补缺陷，并询问了TCA下游的通路。如前所述，总Cit的GC-MS证实，在SL条件下Cit累积6倍(). 因为Cit是由αKG通过TCA循环（产生m+4 Cit）或通过IDH介导的还原羧基化（产生m+5Cit）产生的(图S6D)我们通过GC-MS定量了m+5 Cit。我们发现在SL条件下，m+5 Cit分数显著降低(图S6E)表明，虽然在我们的四种条件下，Gln-derivedαKG的命运发生了改变，但Cit含量的增加并不是由于合成的增强。因此，Cit的显著积累可能是因为其下游对从头合成脂肪酸或类异戊二烯生物合成的利用减少。与此假设一致，我们观察到MondoA的缺失导致Srebp1、Fasn和Scd的下调()所有这些都参与了脂质生物合成途径。因为Cit可以转化为乙酰-coA用于从头合成脂肪酸(图S6D)我们测试了Gln-衍生碳是否有助于脂质合成，以及MondoA的丢失是否会损害脂质合成。为此，我们采用了脂质提取方案和GC-MS(Metallo等人，2012年)用于追踪游离脂肪酸池中从Gln衍生的碳到棕榈酸盐（C16:0），在添加13C类5-格林尼治大学。当N-Myc与MondoA合作提供Gln作为补体底物生成Cit时，MondoA还需要将Cit转化为脂肪酸，因为MondoA沉默后，标记棕榈酸的总分数（m+2（N）棕榈酸之和）从约20%下降到不到15%，与N-Myc无关(和S6F系列). 与Fasn表达的损失一致，标记的棕榈酸盐（m+4至m+12）的分数显著减少().
删除Mlx公司在MEF中表达内源性Myc也会导致MondoA、Fasn和其他靶点的表达减少，并降低脂质含量，但不会诱导细胞凋亡(图S6G–J因此，在合成致死条件下观察到的新生脂肪酸生物合成减少不是细胞凋亡的结果，而是MondoA-Mlx转录活性和靶基因表达丧失的代谢反应。
为了证实N-Myc过度表达细胞对脂质生物合成的依赖性，我们测试了Tet21N细胞对Fasn抑制剂C75和法尼基二磷酸合成酶（Fdps）抑制剂唑来膦酸（ZOL）的敏感性。与siRNA结果一致，N-Myc过表达细胞对这些抑制剂明显更敏感，并且当用N-Myc-on细胞的IC50处理时，对N-Myc-OFF细胞的活性没有影响(图S6K). 此外，C75而非ZOL治疗与siMonA协同激活caspase(、和S6L系列)，表明对FASN活性丧失敏感，与棕榈酸酯通量减少一致。同样，siRNA介导的Fasn或Scd沉默增强了N-Myc-ON细胞的凋亡(图S6M). 此外，ZOL治疗的效果可以通过下游代谢产物香叶基香叶醇（GGOH）来挽救(表S2)，该代谢物未能挽救siMonA N-Myc-ON细胞活性的丧失，表明类异戊二烯途径的抑制不是SL表型的原因。因为C75处理可以通过油酸盐（C18:1）来挽救(表S2)，我们测试了油酸是否可以挽救siMonA N-Myc-ON细胞的生存能力。如所示和第6页，油酸盐抑制siMonA处理后应激的激活，部分恢复细胞活性，从而使脂质生物合成的失败位于导致SL表型的应激诱导级联事件的上游。
合成致死基因子集与几种癌症的不良预后相关
我们的数据表明，Myc和MondoA协同独立地增强多个代谢基因的表达，从而促进肿瘤的发生(). 如果是这样，其中几个基因在人类癌症中的高表达将被预测与不良预后相关。使用的累积表达式MLXIP（MLXIP）,计算机辅助设计,TFAM公司,煤层气,SCD公司,PFAS公司,SLC3A2型、和SLC1A5型，我们计算了不同类型癌症患者的总体生存率，发现在大多数情况下，与低表达患者相比，高表达特征的患者（前20%，红色）预后较差（后20%，蓝色；其余60%显示为灰色）(). 然而，尽管在神经母细胞瘤、LIHC和肺中高表达和低表达患者之间的差异显著，但在LAML和COAD中仅略微显著，而在BRCA中则不显著。这反映了癌症的固有异质性，与最近的一份报告一致，该报告表明c-Myc过度表达在不同组织中引发不同的代谢程序(Yueva等人，2012年).
N-Myc和MondoA共同调节代谢基因的高表达与不良预后相关（A）Myc-MondoA协同调节细胞代谢的模型（左）。Myc激活后的合成致死状态和MondoA功能丧失（右）。缩写：电子传递链（ETC）、三羧酸循环（TCA）和活性氧物种（ROS）。（B）基于选定Myc和MondoA调节基因表达的Kaplan-Meier生存分析。红色、蓝色和灰色线条表示高（前20%）、低（后20%）和中等（剩余60%）累积表达MLXIP（MLXIP）,计算机辅助设计,TFAM公司,煤层气,SCD公司,PFAS公司,SLC3A2型、和SLC1A5型分别是。顶部和底部20%之间的显著性由Wilcoxon模型确定。肝细胞癌（LIHC）、肺鳞状细胞癌和肺腺癌数据集组合（lung）、结肠腺癌（COAD）、急性髓细胞白血病（LAML）和乳腺浸润癌（BRCA）。基因数据集：神经母细胞瘤(Oberthuer 2006年)休息时，TCGA(网址：http://cancergenes.nih.gov).
讨论
增殖和代谢是正常细胞生长和分裂过程中精确协调的过程，在癌症中经常被解除调控。Max/Mlx网络的一个独特特性是它能够感知和响应有丝分裂信号和营养物质的可用性(Diolaiti等人，2014年;O'Shea和Ayer，2013年). 在本研究中，我们提供了证据，证明MondoA-Mlx异二聚体是细胞代谢和肿瘤生长的Myc驱动转录重编程所必需的。我们发现MondoA/Mlx将葡萄糖传感与Gln利用以及Myc促进过度增殖所需的后续下游生物合成相协调。先前的工作已经证明了Gln在Myc驱动的癌症生存中的关键作用(党，2011;Qing等人，2012;Shachaf等人，2007年;怀斯等人，2008年;Yueva等人，2007年). 在这里，我们发现MondoA缺失抑制Myc诱导的GLN摄取、GLN依赖的线粒体活性和GLN衍生的脂质生物合成，从而导致细胞凋亡。为了支持我们的发现，据报道，MondoA在急性淋巴细胞白血病（ALL）中过度表达，其沉默可阻止肿瘤细胞生长(Wernicke等人，2012年). 这里描述的SL表型将MondoA置于转录级联之上，该转录级联协调调节对Myc-driven肿瘤生存至关重要的多种代谢途径。
本研究中发现的Myc/MondoA下游代谢效应器的损伤使我们能够定义解除调控Myc特有的SL相互作用。这些包括与葡萄糖、氨基酸、核苷酸、线粒体功能和脂质代谢有关的物质。虽然Myc与增强的糖酵解、谷氨酰胺解和线粒体活性之间的联系和依赖性是众所周知的，但糖异生酶Pck2的作用揭示了Myc对双向通路的需求。最近的报告表明在营养限制下肺癌和乳腺癌细胞中Pck2活性的必要性(Leithner等人，2014年;Mendez-Lucas等人，2014年)与MondoA-Mlx作为调节生存的营养反应因子的功能一致。
我们还观察到SL患者的脂质代谢受损。虽然MondoA家族成员ChREBP与癌细胞中葡萄糖衍生的脂肪生成有关(Tong等人，2009年)，ChREBP尚未被报道可改变谷氨酰胺裂解，其对Myc驱动的肿瘤发生的需求尚未得到测试。我们的数据支持MondoA和ChREBP的非冗余作用，因为针对MondoA（以及针对Mlx）的siRNA会杀死ChREBP表达细胞。
多项研究表明，抑制Acaca、Fasn或Scd活性(Zaidi等人，2013年)以及Srebp1的损失(Griffiths等人，2013年)抑制癌细胞生长。有趣的是，我们发现油酸能够部分地缓解这些损伤，以及由于高Myc水平细胞中MondoA抑制导致的细胞凋亡。我们的研究揭示了脂肪生成在Myc依赖的代谢重编程中的重要性，并为脂肪生成抑制剂在Myc驱动的恶性肿瘤中的临床评估提供了理论基础。根据最近关于Myc在人类淋巴瘤中诱导脂质代谢谱改变的报道，这是高度相关的(Eberlin等人，2014年)
重要的是，与所有其他Myc网络成员相比，Mondo蛋白是配体激活的，因为它们感知葡萄糖-6-磷酸（G6P）和其他糖酵解中间体(McFerrin和Atchley，2012年;Peterson等人，2010年;Stoltzman等人，2008年). 阻断MondoA对葡萄糖的反应能力可能是一种针对真菌驱动肿瘤的治疗策略。此外，还描述了c-Myc-Max异二聚化的小分子抑制剂(Wang等人，2007年)，表明开发Mondo-Mlx异二聚化抑制剂的可行性。
先前的研究已经明确确立了Myc和Mxd/Mnt蛋白在控制细胞行为中的功能性拮抗作用(胡克和胡林，2006年). 然而，最近的研究表明Mnt在Myc-driven肿瘤进展中的作用(Link等人，2012年)结合我们描述Myc-MondoA转录协同作用的报告，提出了一种更复杂的情况，即网络成员之间的失衡促进了细胞凋亡。
N-Myc和MondoA如何合作促进其代谢基因靶点的转录？一种可能是N-Myc和MondoA同时与含有多个E-box的启动子结合，以实现最大基因表达。c-Myc和MondoA或ChREBP与LDHA公司和香港国际投资银行(Sans等人，2006年)或PKLR公司(Zhang等人，2010年)已经描述了启动子，我们证明N-Myc和MondoA都与TXNIP公司发起人。我们还表明，N-Myc激活通过改变MondoA和其他网络成员的表达来促进Mondo-Mlx活性，以竞争共同的异二聚体伙伴Mlx。相反，MondoA的缺失可能通过改变代谢靶基因启动子处的染色质来消除N-Myc转录扩增，从而抑制N-Myc转录活性(Lin等人，2012年;Nie等人，2012年). 此外，在没有MondoA的情况下，Mxd和Mnt蛋白可能与Mlx异二聚并积极抑制N-Myc/MondoA靶基因。这些机制不是相互排斥的，可能以细胞类型和启动子特定的方式运作。
尽管由于Myc的致癌活性，人们对其给予了很大的关注，但我们认为，在生理和病理背景下对Myc生物学的充分理解将需要对整个Max/Mlx网络的生物学和动力学的理解。
实验程序
所有技术和试剂的完整列表，如酶抑制剂、逆转录病毒和慢病毒载体以及体外功能检测，都列在补充实验程序.
异种移植
1×106Tet21N细胞在生长因子降低（GFR），无酚红BD基质™（Becton Dickinson），并皮下注射到裸鼠（nu/nu）两侧（n=10）。每2-3天测量一次肿瘤体积，当肿瘤负荷达到2.5 cm时处死小鼠三对肿瘤进行解剖，并将等分样品冷冻在液氮中或固定在福尔马林中以进行进一步分析。在Fred Hutchinson癌症研究中心实验组织病理学中心进行免疫化学分析。弗雷德·哈钦森癌症研究中心机构动物护理和使用委员会批准了所有小鼠实验。
基因表达分析
使用Illumina HumanHT-12 v4 expression BeadChip进行全基因组表达分析。样本处理在弗雷德·哈钦森癌症研究中心基因组设施进行，数据提交给基因表达总站（GEO中数据集的登录号：GSE55538）。有关数据统计分析的详细信息，请参见下文。
代谢组学分析
细胞处理：转染1×10后48小时6细胞被放置在6孔板中。抽吸24小时培养基后，将细胞在冰凉H中清洗两次20，并在1.5 mL冰冷的9:1甲醇：氯仿中裂解，将平板置于干冰（约−75°C）上以抑制代谢。5分钟后，刮取细胞并转移到1.5 ml试管中。将裂解液在13000 RPM下离心10分钟，将上清液转移到新的小瓶中，并在室温下使用Speedvac进行干燥。将干燥样品在水中和1%甲酸中重新配制后，对其进行LC-MS分析（参见补充实验程序). 代谢物水平根据平行板上的细胞数进行标准化。有关数据统计分析的详细信息，请参见下文。
统计分析
使用Graphpad Prism软件计算所有体外实验的统计显著性，使用Student T检验对两种条件进行比较，使用ANOVA和Bonferroni校正对多次比较。基因表达数据以分位数归一化和对数转换值一式三份运行。根据使用R版本3.0.1的lumi包，Benjamin Hotchberg（BH）根据FDR调整的p值<0.05确定显著性(Du等人，2008年). DAVID生物信息数据库中满足BH调整后p值<0.05的类别报告了基因本体富集(黄达等，2009). 代谢物数据通过对数转换z评分归一化为N-Myc OFF和siCtrl条件。使用Metaboanalyst进行代谢途径富集(Xia等人，2012年)具有FDR校正p值<0.05的代谢物组被认为是显著的。使用Cluster和TreeView，基因和代谢物热图都显示了每个三份样品的中间z得分(Eisen等人，1998年).
补充材料
1
图S1，与.小鼠成纤维细胞中siRNA的筛选以及原代细胞和癌细胞系中未受调控的Myc和MondoA缺失之间的合成致死性。（A）在存在或不存在强力霉素的情况下，对C3H10T1/2细胞系克隆P3C1中指示的蛋白质表达水平进行Western blot分析。（B）在存在或不存在强力霉素的情况下，对克隆P3C1的增殖（BrdU掺入试验）和凋亡（TUNEL试验）进行量化。所示为平均值和SD（n=3）。（C）在多西环素存在或不存在的情况下（5天治疗），克隆P3C1中成纤维细胞分化标记Thy1.2的免疫荧光染色。比例尺=20μm。（D）siRNA介导沉默指示的Max/Mlx网络基因后，P3C1克隆（+/-c-Myc）的相对存活率定量（红色表示p<0.05）。（E）瞬时转染所示siRNA的P3C1细胞中Mlx、MondoA和ChREBP mRNA表达的实时定量。ND：未检测到。所示为平均值和SD（n=3）。（F）上图：用对照载体或表达c-Myc的逆转录病毒载体转导的MEF中c-Myc表达的western blot分析。底部：感染后72小时检测到相对细胞数和caspase活性（caspase-Glo试剂）。所示为平均值和SD（n=3）。F/F表示MondoA的floxed等位基因(Mlxip公司)LT表示SV40大T抗原。（G）瞬时转染所示siRNA的P493-6细胞中Mlx、MondoA和ChREBP mRNA表达的实时PCR定量。ND：未检测到。所示为平均值和SD（n=3）。（H）HCT116、HEPG2和TOV112D中MondoA沉默的相对存活率，以及正常人前皮肤成纤维细胞（HFF）与HCT116，HEPG2，TOV112肿瘤细胞系中c-Myc表达水平的比较。所示为平均值和SD（n=3）。（一）所示细胞系中MondoA敲除的Western blot分析。（J）野生型（WT）和Eμ-c-Myc转基因B220中的相对c-Myc和MondoA mRNA+CD43细胞+小鼠B细胞。所示为平均值和SD（n=3）。（K）标准化为SH-SY-5Y细胞的神经母细胞瘤细胞系中MondoA mRNA的相对定量。所示为平均值和SD（n=3）。（左）c-Myc和N-Myc诱导细胞中细胞质和细胞核定位的MondoA蛋白的蛋白质印迹分析。（百万）MondoA的N-Myc染色质免疫沉淀（ChIP）(MLXIP（MLXIP）)启动程序。阴性对照：阴性引物组1（Active Motif）。阳性对照：4月1日发起人。数值表示N-Myc-ON和N-Myc-OFF条件下标准化ChIP DNA含量之间的比率。所示为平均值和SD（n=3）。（N）N-Myc诱导Tet21N细胞中Max和Mlx相互作用蛋白的Western blot分析。未分析L-Myc，因为它在Tet21N细胞中不表达。未分析Mxd2和Mxd3，因为它们不与Mlx相互作用。（O）Western blot分析MondoA靶向Txnip在（N）中处理的细胞中的表达。
图S2，与:MondoA敲除的特异性和Myc稳定性的体内外补充数据。（A） Western blot分析比较单个siRNA和4个siRNA与MondoA的混合物，并分析MondoA、Txnip和N-Myc在所有测试条件下的表达水平，右侧显示相对活性。所示为平均值和SD（n=3）。（B）Taqman RT-PCR分析所示处理细胞的MondoA和Txnip mRNA（归一化为RPS16）。所示为平均值和SD（n=3）。（C）在不存在和存在shRNA抗性MondoA cDNA的情况下，具有shCtrl或ShMonA的HCT116细胞的相对活力。所示为平均值和SD（n=3）。（D）按图S2C处理的HCT116细胞中MondoA的Western blot分析。（E）在没有和存在异位MondoA的情况下，用siCtrl或siMonA处理的Tet21N细胞中指示蛋白的Western blot分析。（F）在不存在和存在shRNA-resistant MondoA cDNA的情况下，使用shCtrl或ShMonA对Tet21N细胞中的指示蛋白质进行Western blot分析。（G）在匹配的shCtrl和shMonA异种移植物的切片上对Ki67和裂解caspase 3（CC3）进行免疫组织化学染色。比例尺=20μm。（H）用环己酰胺（CHX）处理后的N-Myc的western blot分析在shCtrl或shMonA-Tet21N细胞中进行N-Myc蛋白稳定性分析。（一）对匹配的shCtrl和ShMonA异种移植组织样本的N-Myc表达进行Western blot分析。GFP显示为shRNA载体衍生表达的对照。（J）通过siCtrl或siMonA对P493-6细胞的caspase活性（caspase-Glo试剂）进行量化，并对类似处理的细胞进行蛋白质的western blot分析。所示为平均值和SD（n=3）。
图S3，与:N-Myc和MondoA的基因表达分析。（A）总RNA水平定量（2×106在指定条件下，Tet21N和P493-6电池中。显示的是平均值和SD（n=3）。（B）siCtrl和siMonA条件下N-Myc诱导变化（Log-FC N-Myc-ON/N-Myc-OFF）的相关性，分别有1475和1285个探针重叠上调或下调。（C）N-Myc-ON和N-Myc-OFF条件下MondoA诱导的变化（Log-FC-siCtrl/siMonA）的相关性，分别有1843和1598个上调和下调基因重叠。（D）在四种指示条件下对总组蛋白和乙酰化组蛋白H4进行Western blot分析。（E）基因Z得分是相对于Myc-OFF，siMonA条件（=0）设置的，Myc-ON，siMonA条件位于x轴，N-Myc-OFF和siCtrl条件位于y轴。N-Myc-ON，siCtrl条件Z分数值叠加在2D图上，并使用色标（红色，负值；绿色，正值）表示。等高线表明大多数基因没有变化，密度集中在（0,0,0）。（F）N-Myc和MondoA结合的染色质免疫沉淀分析TXNIP公司发起人。阴性对照：阴性引物组1（Active Motif）。值表示归一化为输入DNA的免疫沉淀DNA的百分比。所示为平均值和SD（n=3）。
图S4，与.N-Myc和MondoA调控途径的代谢组学分析。（A）用siCtrl或siMonA转染Tet21N细胞（−/+N-Myc），并通过qRT-PCR验证参与代谢的N-Myc和MondoA协同调节或MondoA依赖靶点的子集。所示为平均值和SD（n=3）。（B）瞬时转染所示siRNA的Tet21N细胞（−/+N-Myc）中N-Myc和MondoA/Mlx协同调节或MondoA/M1x依赖靶点子集的Western blot分析。（C）缺乏MondoA的初级和永生小鼠胚胎成纤维细胞（−/+c-Myc）中MondoA/Mlx共调控基因Slc1A5和Tomm20的Western Blot分析(Mlxip公司)或Mlx公司基因。LT表示使用SV40大T抗原永生化MEF。（D）使用强力霉素诱导的c-Myc测定MEF在shCtrl或shMonA存在下对放射性标记谷氨酰胺（Gln）的摄取，并将其归一化为c-Myc-OFF、shCtrl条件。所示为平均值和SD（n=3）。（E）将Tet21N细胞接种在（N-Myc OFF/ON）中8小时，然后在所示条件下用0、2.5或25mM葡萄糖再培养16小时，然后测定放射性标记的Gln的摄取，并用N-Myc-OFF将其标准化为25mM葡萄糖下的基线摄取。显示的是平均值和SD（N=3）。（F）用所示shRNA转导的Tet21N（−/+N-Myc）进行放射性标记的2-脱氧葡萄糖（2DG）检测。所示为平均值和SD（N=3）。（G）用所示shRNA转导的Tet21N（−/+N-Myc）的细胞外酸化率（ECAR）定量。所示为平均值和SD（N=3）。（H）用指示的siRNA瞬时转染Tet21N，并在转染48小时后测定放射性标记Gln的摄取。相对摄取量标准化为siCtrl；N-Myc-OFF条件。所示为平均值和SD（n=3）。（一）左图：过表达氨基酸转运蛋白Slc1A5和Slc3a2的Tet21N（−/+N-Myc）被检测为放射性标记Gln的摄取，相对摄取被标准化为载体控制/N-Myc-OFF条件。右图：蛋白质印迹显示氨基酸转运蛋白的表达。（H–I）为代表性实验（平均值和SEM，n=4）。（J）CB660细胞（原代；CB660，永生化；I-CB660或转化；T-CB660）−/+c-Myc转染有指示的siRNA。转染后4天评估存活率。显示平均值和SD（n=3）。
图S5，与.Myc和MondoA独立于p53协同调节靶基因。（A）Western blot分析显示MondoA、Pfas、Tomm20、p53和p-RpS6蛋白在Tet21N细胞中的MondoA KD表达水平，shCtrl敲除shp53。（B）Western Blot分析siRNA靶点表达和切割PARPTP53型+/+和TP53型−/−用所示siRNA转染HCT116细胞。（C）用空载体对照或c-Myc表达载体转导的野生型和mondoA或Mlx-null成纤维细胞中p53和p21表达的蛋白质印迹分析（c-Myc表达见图S1E）。LT表示使用SV40大T抗原永生化MEF。（D）HCT116中MondoA和N-Myc/MondoA协同靶点的Western blot分析TP53型+/+或TP53型−/−细胞。（E）HCT116型TP53型+/+或TP53型−/−用指示的siRNA转染，48小时后检测放射性标记的Gln摄取。对于每个细胞系，摄取量标准化为siCtrl条件。所示为代表性实验（平均值和SEM，n=4）。（F）瞬时转染所示siRNA的Tet21N（−/+N-Myc）中促凋亡Bcl2家族成员的Western blot分析。
图S6，与.肿瘤和原代细胞的代谢分析。（A）代谢组学调查中选定代谢物的LC-MS相对强度，siCtrl N-Myc-OFF设置为1。所示为平均值和SD（n=3）。（B）通过细胞组学分析A中4种条件下Tet21N细胞的线粒体含量和活性。所示为大于1000个单个细胞的平均强度。（C）用ROS诱导染料DCFDA流式细胞术分析四种条件下的Tet21N细胞。所示为平均值和SD（n=3）。（D）新陈代谢示意图13C类5-Gln衍生的碳和酶以蓝色显示。（E）在所示条件下，Tet21N电池中M+5柠檬酸盐（源自还原羧基化）的GC-MS。所示为平均值和SD（n=3）。（F）报告4种实验条件下（**p≤0.01；**p≤0.001）标记棕榈酸总量百分比的表。（G）小鼠Taqman mRNA定量Mlx公司和Txnip公司WT和Mlx-KO-MEFs中的编码转录物。（H）MEF的Western blot分析（WT vs Mlx KO）。（一）Mlx WT和KO MEF用油红O染色。总油红O在异丙醇中溶解，并用Abs 492nm定量。所示为平均值和SD（n=3）。（J）油红O染色的WT和Mlx KO MEF的代表性图像。比例尺=20μm。（K）Tet21N细胞在使用Pck2:3-巯基吡啶酸（3MP）、Fasn:C75或Fdps:唑来膦酸（ZOL）的化学抑制剂处理的指定条件下，在计算的N-Myc-ON IC50剂量下的存活率。相对存活率已标准化为倒数NT条件（−/+N-Myc）设置为1。所示为平均值和SEM（n=4）。（左）经C75（−/+N-Myc）处理的Tet21N细胞指示蛋白的Western blot分析。（百万）用对照、Fasn或Scd特异性siRNA处理Tet21N细胞的Western blot分析。（N）在指定条件下油酸处理Tet21N细胞的代表性图像。比例尺=200μm。
