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J签证费用。2014; (90): 51871.
在线发布2014年8月20日。 数字对象标识：10.3791/51871
预防性维修识别码：项目经理4325827
PMID：25178087

使用维梧资本前钱德勒环路仪评估改性聚合物输血管的生物相容性

约书亚·B·斯利,1,2 伊万·阿尔弗雷耶夫,1,2 罗伯特·J·利维,1,2和斯坦利·斯塔切利克1,2
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

当合成表面进入人体时，异物反应发生。其特征是血液蛋白的吸附以及随后血小板的附着和激活、单核细胞/巨噬细胞粘附和炎性细胞信号事件，导致术后并发症。钱德勒回路装置是一个实验系统，允许研究人员研究聚合物导管上灌注大量血液时发生的分子和细胞相互作用。为此，该仪器被用作体外模型允许评估各种聚合物表面修饰的抗炎特性。我们的实验室已经证明，通过光活化化学与重组CD47共价修饰的血管可以赋予聚合物表面生物相容性。将CD47附着在聚合物表面可能是提高聚合物血液导管功效的有效手段。以下是详细说明用于将重组CD47附加到临床相关聚合血液导管的光激活化学以及Chandler Loop作为体外检测CD47修饰和控制导管与血液相互作用的实验模型。

关键词：生物工程，第90期，钱德勒循环装置，血液灌流，生物相容性，CD47，异物反应，聚合物血管

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介绍

许多临床程序，如体外循环和肾透析，需要使用聚合物输血管，并且经常与术后并发症相关1当用血液灌注时，这些聚合物会破坏异物反应（FBR），导致血液蛋白和血小板的吸附、单核细胞/巨噬细胞的粘附以及促炎细胞因子的释放，所有这些都会导致术后并发症和/或设备故障2,3因此，解决这一问题的战略仍然是生物材料研究的一个重要和持续的领域。研究人员试图通过用生物活性或生物惰性分子修饰血液接触表面来解决这个问题4-6我们实验室的研究重点是将重组CD47（recCD47）附加到聚合物生物材料中，作为减轻FBR和提高这些材料功效的策略。CD47是一种广泛表达的跨膜蛋白，在免疫逃避中具有已知作用，赋予表达细胞“自我”状态7-10当附加到聚合物表面时，有望赋予生物相容性11-13信号调节蛋白α（SIRPα）是CD47的同源受体，也是免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）跨膜蛋白家族的成员，在髓系细胞上表达14我们之前已经证明，CD47通过SIRPα介导的细胞信号传导下调对聚氨酯（PU）和聚氯乙烯（PVC）的免疫反应在体外,体外、和体内模型11-13.

我们研究的中心是一种相对新颖的光活化化学，如本文所述，在该化学中，通过使管与多功能聚合物（PDT-BzPh）反应，将化学反应性硫醇基团共价附加到聚合物管上，该多功能聚合物由2-吡啶二硫代（PDT）、光活性二苯甲酮（BzPh）组成和羧基改性聚烯丙基胺11-13.用三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）还原共价附加的PDT基团11产生可随后与治疗部分反应的硫代表面。在此和之前详细说明12,13，recCD47，通过添加C末端聚赖氨酸尾进一步修改12,13，与磺基丁二酰亚胺-4反应-[N个-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸盐（磺化-SMCC）1小时，以生成巯基反应基团，允许在管子和recCD47之间形成单硫键11。测试了CD47功能化表面的抗炎能力，生前o、 将钱德勒循环装置用于全人类血液，最初在1958年被描述为在体外血栓凝固模型15该仪器依靠一个部分充满空气的封闭管道系统和一个旋转电机使血液在管道中循环15这个实验模型提供了一个机会，可以检验血液暴露对修饰和未修饰表面的影响，以及这些表面修饰对血液细胞生理学的影响。

利用这种光活化化学，recCD47可以被附加到各种聚合物表面，并且可以利用临床相关的体外聚合物表面血液灌注模拟模型11,12与未经修饰的聚合物相比，经recCD47修饰的临床级输血管道在仪器中暴露于人体血液时，血小板和炎性细胞附着明显减少。下面详细介绍了此修改过程的分步说明。

协议

1.用recCD47修饰聚合物表面

注：协议概述见图1.图1A说明了巯基反应聚合物表面的生成。图1B说明了巯基反应recCD47的生成。

  1. 第1天
    1. 制备PDT BzPh（1 mg/ml）和碳酸氢钾（KHCO）的溶液三)（0.7 mg/ml）。在4°C下搅拌过夜(避光).
  2. 第2天
    1. 将聚合物管切割成40厘米长的碎片（足够长，可以围绕旋转的轮子）。
    2. 在振动筛或钱德勒回路仪器上，在室温下将试管在0.1%六烷基吡啶水溶液中浸泡90分钟。浸泡90分钟后，用无菌水冲洗试管3次。
    3. 通过添加15%的磷酸二氢钾水溶液（KH），从第1天起酸化PDT-BzPh溶液2人事军官4). 添加50µl KH2人事军官4每毫升PDT-BzPh，形成浑浊的胶束溶液。
    4. 将试管在室温下的酸化PDT-BzPh溶液中在振动筛或仪器上浸泡40分钟。
    5. 用稀醋酸（1:1000）冲洗管子一次。
    6. 将管子暴露在紫外线照射下60分钟。每15分钟旋转管子¼圈，照射整个表面积。
    7. 将试管浸泡在20 mg/ml碳酸氢钾（KHCO）溶液中三)在室温下在摇床或设备上保持20分钟。
    8. 用无菌水冲洗试管3次，并将其保存在4°C的无菌水中。
  3. 第3天
    1. 将5 mg磺化SMCC溶解在200µl二甲基甲酰胺（DMF）中(注意：在通风橱内进行).
    2. 将步骤1中制备的50µl磺化SMCC溶液添加到0.1 mg/ml recCD47聚赖氨酸溶液中，并在室温下搅拌60分钟。
    3. 在60分钟搅拌期间，将无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲盐（DPBS）脱气并放在一边。
    4. 按照制造商的说明，Purify Sulfo-SMCC使用7K分子量截止旋转脱盐柱对recCD47进行反应。收集最终的流通液（高质量的硫醇反应recCD47），并稀释至必要的体积，以便用DPBS涂覆管内部。
    5. 从第2天开始，用无菌脱气DPBS 3x冲洗试管。
    6. 用20 mg/ml的溶液与脱气DPBS中的三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP）在试管的修饰表面反应不到2分钟。用无菌脱气DPBS4x冲洗试管。
    7. 将磺化SMCC反应的recCD47添加到试管中，并在摇床或仪器上于4°C下培养过夜。

2.改良表面上recCD47的免疫分析定量

  1. 用DPBS 3x冲洗从第3天开始定量的改良试管。将未用于DPBS定量的管子储存在4°C下。
  2. 使用4 mm活检冲头制作重复的试管样品，并将活检冲头放置在96 well板的孔中。
  3. 制备阴性对照品，包括未经修饰的试管样品，未经检测抗体处理。制备抗体对照品，包括用检测抗体处理的未经修改的试管样品。制备经检测抗体处理的改良试管测试样品。
  4. 室温下，在振动筛上用0.4%牛血清白蛋白（BSA）将样品置于DPBS中60分钟。
  5. 阻塞后，抽吸BSA，用三缓冲生理盐水加1%吐温-20（TBST）3次，每次10分钟，在振动筛上冲洗。
  6. 根据制造商推荐的免疫分析稀释液，在0.4%BSA中制备抗体的工作稀释液。在0.4%BSA中稀释人CD47抗体B6H12-FITC 1:100。
  7. 将200µl抗体稀释液加入适当的孔中。仅用0.4%牛血清白蛋白培养阴性对照。在室温下在振动筛上培养60分钟(避光).
  8. 用TBST冲洗3次，每次10分钟，放在振动筛上。吸取最后一次TBST冲洗液，并将200µl DPBS添加到试管样品孔中。
  9. 收集最终的流通液，即高质量的巯基反应重组CD47，并稀释至必要的体积，以便用DPBS涂覆管内。
  10. 使用带有FITC激发（485 nm）和发射（538 nm）设置的微孔板读取器读取FITC信号强度。
  11. 根据标准值计算结合到聚合物表面的recCD47，考虑抗体对照样品的自荧光和非特异性结合。

3.钱德勒环路装置协议

在开始采集人体血样之前，寻求机构审查委员会（IRB）对血液采集协议和知情同意书的批准。获得人类献血者的知情同意。注：设备示意图如所示图2.

  1. 用蒸馏水填充水浴，直到大约1/2直径的车轮浸没。在水浴中加入足够的漂白剂，制成10%的漂白溶液。将水浴温度设置为37°C，并使温度达到平衡。
  2. 收集金属适配器（如所示图1B)、未修改的管子和修改过的管子，并围绕设备轮进行组装，如所示图1C.确保管子紧贴车轮，金属适配器就位。
  3. 使用IRB批准的方案，在预先装满2 ml柠檬酸盐或其他抗凝剂的小瓶中获取30 ml血样，并通过倒置进行混合，以防采集样本后发生凝血。
  4. 使用金属阀和注射器向每根管子中添加约10毫升血液，使管子中留有一些空气。固定阀盖并旋转3小时。
  5. 将血液排入用10%漂白剂溶液处理过的废烧杯中（或按照机构政策的要求）。
  6. 用DPBS轻轻冲洗管道内部，以清除所有血迹。收集废物烧杯中的流通物。按照机构政策处理血液。
  7. 使用10%漂白液或根据机构政策对器械和任何接触血液的表面进行消毒。
  8. 处理荧光显微镜或扫描电子显微镜样品，如下所述。

4.荧光显微镜和细胞计数

  1. 制备4%多聚甲醛（PFA）溶液(注意：在通风橱内进行).
  2. 在4°C下，在4%PFA溶液中培养管子过夜。
  3. 过夜培养后，去除4%PFA并用DPBS轻轻冲洗薄膜。
  4. 将管子切成段，露出内腔表面进行染色。
  5. 在室温下，用几滴4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）安装介质将一段管子染色30分钟(避光). 染色后，用DPBS轻轻冲洗管子，以减少背景DAPI信号。
  6. 图像使用配备DAPI滤波器和数码相机的荧光显微镜，在放大200倍的条件下计算9个盲目选择的视野中的细胞数量。
  7. 记录每个视场的细胞计数，并进行适当的统计分析，以确定结果的统计显著性。

5.扫描电子显微镜

  1. 制备2%戊二醛溶液(注意：在通风橱内进行).
  2. 在4°C下，在2%戊二醛溶液中培养管子过夜。
  3. 培养过夜后，用DPBS轻轻冲洗管子3x。
  4. 制备1%四氧化锇溶液(警告：严重吸入危险！用于通风柜).
  5. 在室温下，将管子在1%的四氧化锇溶液中培养15分钟。
  6. 用DPBS轻轻冲洗管道3x。
  7. 准备一系列乙醇浓度（25%、50%、75%、95%和100%乙醇）。
  8. 通过培养一系列乙醇浓度，使管子脱水。分别在25%、50%、75%和95%乙醇中培养20分钟。在100%乙醇中培养30分钟。
  9. 用CO进行超临界点干燥2持续45分钟以去除所有水分。
  10. 用银糊或石墨将管段安装在试样上。
  11. 用12.5 nm的金钯涂覆管段。
  12. 用扫描电子显微镜检查。  

具有代表性的结果

通过使用PDT-BzPh和TCEP以及使用SMCC的巯基反应recCD47聚赖氨酸生成巯基反应聚合物表面，允许recCD47附着到聚合物表面。修改过程如图所示图1这种修饰过程的便利之处在于，它可以应用于许多不同的蛋白质和许多不同的聚合物表面，假设蛋白质可以用足够的化学反应基团（如含胺赖氨酸）进行修饰，并且聚合物具有足够的可用碳氢化合物。

之前已经证明，使用该方案，recCD47可以被附加到聚合物表面11-13。如所示图3A，使用针对CD47细胞外Ig结构域的FITC-结合抗体，可对recCD47进行显著的FITC染色，如DIC成像所示，该结构域特异定位于膜上(图3B). 这些结果表明，recCD47可以共价附着到聚氨酯膜上。测量荧光单位并与标准曲线比较，确定表面结合recCD47的浓度。我们已经证明recCD47可以以超过500 ng/cm的水平附着到聚合物表面2,11-13这些结果证实，这种基于硫醇的聚合物修饰方案可以用于将聚赖氨酸修饰的重组蛋白附加到聚合物表面。

CD47已被证明是“自我”的标志物，可防止炎症细胞附着和免疫系统激活7-13.模仿体内条件尽可能接近体外设置时，可以通过钱德勒回路装置（如图所示）中未经修改和修改的聚合物管灌注人体全血图2). 可通过DAPI染色评估细胞与导管的连接(图4)和SEM(图5). 通过DAPI染色获得的细胞计数表明，与未修饰表面相比，附加recCD47显著抑制细胞粘附（p=0.004）(图4A和4B). DAPI细胞计数通过SEM证实，表明未修饰和recCD47修饰表面的细胞粘附水平相似(图5). 这些数据表明，使用本文描述的方案，recCD47的附件显著抑制炎症细胞在体外血液灌流模型。

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图1.表面改性示意图。A）通过用光活化交联剂PDT-BzPh孵育聚合物表面并随后用TCEP还原，生成了硫酸化聚合物表面。B）SMCC用于产生巯基反应性recCD47，然后将其与硫代合成表面反应，得到recCD47功能化表面。

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图2.钱德勒回路装置图。A）该设备由加热至37°C的水浴器、固定在旋转电机金属杆上的旋转轮组成。这种设置允许旋转电机转动车轮，从而将部分管子浸入37°C水浴中，并通过管子灌注血液。B）金属适配器用于连接管道的端部，形成围绕其中一个旋转轮的环。血液通过金属阀口添加到管道中，并用阀盖盖住。C）组装完成后，管子和金属阀应紧贴在旋转轮周围，如图所示，使用空管子。

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图3.聚氨酯膜上recCD47的定量使用针对CD47外部Ig结构域的抗体来量化与聚氨酯膜结合的recCD47的量。使用适当的滤光片组在200倍放大下拍摄的荧光显微镜图像显示FITC检测到添加到聚氨酯中的recCD47(A类). (B类)DIC图像显示，FITC信号是聚氨酯膜特有的。

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图4.细胞对未改性和recCD47改性聚氨酯的粘附收集全人类血液，并在未经修饰或recCD47修饰的PU膜上灌注3小时。灌注3小时后，用DPBS冲洗膜，用4%PFA在4°C下过夜固定粘附细胞，并在室温下DAPI染色30分钟。DAPI染色的细胞在200倍放大的荧光显微镜和适当的滤镜下进行计数。(A类)每个修改都会统计9个随机选择的视野。(B类)数据代表9个视场，表示为平均值±标准误差（p=0.004）。

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图5.以下recCD47修饰和对照表面的SEM分析体外分析。收集全人类血液，并在未经修饰或recCD47修饰的PVC管上灌注3小时。典型图像显示未经修饰的表面有明显的细胞附着，而recCD47改良的表面仅显示偶尔附着的细胞。

讨论

光活化化学（总结于图1)允许对几乎任何具有足够碳氢化合物的聚合物表面进行修饰，以促进PDT-BzPh的附着和随后的紫外线照射，从而对PDT-BzPh进行光活化。用反应性硫醇基团使聚合物表面功能化，允许随后附着一系列感兴趣的可测试分子。在我们的特殊研究中，我们选择了重组CD4711-13我们使用的特殊共轭化学涉及蛋白质的胺基与双功能交联剂SMCC的反应11-13这为随后与硫代聚合物表面的反应提供了巯基反应recCD47。最终产物是一个单硫键，将recCD47共价结合到聚合物上。为了帮助确保CD47中氨基酸的胺基不会用于反应，从而降低固定化CD47的功效，我们通过在蛋白质的C末端插入多赖氨酸标签来进一步修改recCD47。类似的分子策略可以应用于其他蛋白质是可行的。因此，共轭化学呈现在这里和其他地方11-13为评估潜在治疗分子在合成表面上赋予生物相容性的能力提供了一个重要机会。

该方案的一个缺点是，将某些类型的聚合物（如聚氨酯）长时间暴露在紫外线照射下会导致变色。这可以通过将聚合物放置在聚苯乙烯培养皿（通常用于组织培养）中来避免，以防止聚合物变色而不阻碍PDT BzPh的光活化。本协议中使用的紫外光波长为302 nm；偏离该波长会导致PDT-BzPh的光活化效率低下。如果使用不同波长的紫外线，则有必要优化紫外线曝光时间，以确保显著的光活化。

根据该方案，允许将recCD47附着到聚合物表面，以逃避免疫，并将“自我”状态传递到聚合物表面以防止异物反应。使用FITC-标记的CD47 Ig结构域抗体，使用免疫分析和荧光显微镜完成附着在表面的recCD47的定量(图3). 假设抗体可用，这种方法可以适用于附着在聚合物表面的其他蛋白质。未能获得recCD47（或其他蛋白质）的显著附属物可能是由于多种因素造成的，包括未能光活化PDT-BzPh、聚合物表面上的游离烃不足、聚合物表面的疏水性，或者聚合物太厚或不透明，无法让光通过以进行适当定量。所有这些变量都可以针对特定聚合物进行实验测试和优化。

钱德勒回路装置是一种独特的工具体外全人类血液暴露于聚合物表面的分析。该系统与各种医疗程序中使用的临床血液导管的血液灌注非常相似，能够分析与血液接触表面相关的许多生理终点。作为recCD47附着到聚合物表面的生理终点，使用DAPI染色进行细胞计数(图4)和扫描电子显微镜(图5)使用了。根据设备的可用性，也可以使用其他端点，例如，也可以采用通过聚合物血液导管进行血液灌注前后的细胞计数。无论如何，与未经修饰的对照表面相比，recCD47修饰表面的粘附细胞明显较少。这些数据表明，recCD47向聚合物表面传递生物相容性，并可能用于在使用聚合物输血管的临床程序中预防FBR。

虽然这是一种广泛使用的在体外用于血液灌流研究的模型，在某些方面有局限性。这种方法的两个主要缺点是需要在血样试管中加入空气。血液与空气的频繁相互作用会导致白细胞和血小板聚集和蛋白质变性16-18，可能会干扰某些端点。其次，空气保持在回路的最高点，限制了血液循环速度19尽管这种方法有明显的局限性，但与其他方法相比，它引起的血液损伤较小19并作为筛选聚合物血管上潜在生物分子生物相容性的一种方法。一旦通过这种方法识别出候选生物分子，就可以通过以下方式进行进一步分析体内动物模型。最终，需要使用合适的体内模型系统。

披露

本出版物中报告的研究得到了美国国家生物医学成像与生物工程研究所（编号R21 EB015612（SJS））和美国国家心脏、肺和血液研究院（编号T32）的支持HL007915型（JBS和RJL），国家卫生研究所。

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文章来自可视化实验杂志：JoVE由以下人员提供MyJoVE公司