定量分析缺氧癌细胞中乙酰辅酶A的生成揭示了醋酸盐的重要作用

摘要

背景

癌细胞具有驱动增殖的基因突变。这种增殖产生了对结构部件的持续需求，以产生子细胞[1–三]. 这包括对脂膜脂肪酸的需求。癌细胞可以通过从细胞外来源摄取脂肪酸和通过从头开始合成，后者是许多癌症类型中获取非必需脂肪酸的主要途径[4,5].

生产的第一种脂肪酸从头开始脂肪酸的合成是棕榈酸。脂肪酸合成酶（FAS）通过催化细胞溶质乙酰辅酶A提供的8-乙酰基（2-碳）单元的连接和还原来合成棕榈酸酯。然后将这种16碳脂肪酸棕榈酸酯并入结构脂质中，或进行额外的伸长（再次使用乙酰-CoA）和去饱和反应，以产生细胞所需的多种脂肪酸。

乙酰辅酶A位于中心碳和脂肪酸代谢之间的界面。在富含营养的高氧条件下，其2-碳乙酰基单元主要由葡萄糖生成。首先，丙酮酸脱氢酶从线粒体中的葡萄糖衍生丙酮酸生成乙酰辅酶A，然后将乙酰基连接到草酰乙酸生成柠檬酸盐。然后，柠檬酸盐被转运到ATP柠檬酸裂解酶产生的细胞溶质和细胞溶质乙酰辅酶A中。

缺氧时，从葡萄糖到乙酰辅酶A的流量受损。低氧导致HIF1复合物的稳定，通过激活HIF1反应性丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）阻断丙酮酸脱氢酶（PDH）活性[6,7]. 因此，葡萄糖衍生的碳被分流到乳酸中，而不是用于生成乙酰辅酶a，从而影响脂肪酸合成的碳可用性。

为了了解增殖细胞如何在缺氧条件下重新安排代谢以维持脂肪酸合成，多项研究集中于谷氨酰胺作为替代碳供体的作用[8–10]. 柠檬酸盐M的观察⁺⁵从U标记-¹³C-谷氨酰胺在缺氧时增加，这导致了以下假设：谷氨酰胺衍生的α-酮戊二酸的还原羧基化使缺氧细胞能够维持柠檬酸和乙酰-CoA的生成。然而，如后文所述，缺氧细胞中柠檬酸盐水平的下降使α-酮戊二酸盐向柠檬酸盐的转化更加可逆，而谷氨酰胺在缺氧条件下大量标记柠檬酸和脂肪酸的另一种解释是同位素交换，无净还原通量[11]. 相反，我们和其他人发现，缺氧细胞通过清除血清脂肪酸，至少可以部分绕过脂肪酸合成对乙酰辅酶A的需要[12,13].

除了提高血清脂肪酸清除能力外，我们还观察到缺氧细胞中有很大一部分脂肪酸碳（20%–50%，取决于细胞系）不是来自葡萄糖或谷氨酰胺。这里，我们使用¹³C-示踪剂和质谱法，以量化各种碳源对乙酰辅酶A的贡献，从而确定这种未知来源。我们发现，在缺氧条件下，非谷氨酰胺氨基酸和脂肪酸对乙酰辅酶a的贡献很小。相反，醋酸盐是之前下落不明的主要碳供体。因此，醋酸盐同化是缺氧细胞维持脂肪生成和增殖的途径。

方法

结果

细胞溶胶乙酰辅酶A标记可从脂肪酸标记模式推断

增殖的癌细胞产生大量非必需脂肪酸从头开始[12]. 这是通过连续连接和还原细胞溶质乙酰辅酶A（AcCoA）捐赠的2-碳乙酰基单元来实现的。AcCoA可以由各种底物产生，包括葡萄糖、氨基酸和脂肪酸。AcCoA生产的定量评估可以通过喂食进行¹³C-标记底物，然后通过质谱直接分析AcCoA标记[16]. 然而，AcCoA标记也可以从脂肪酸中推断出来[8,9]. 这提供了几个优点：脂肪酸比AcCoA更稳定和丰富，它们的标记特别反映了细胞溶质AcCoA的标记。16碳饱和脂肪酸棕榈酸酯的标记可以通过LC-MS可靠地测量[14]随着AcCoA标签的增加，标签分布向右移动（图1A） ●●●●。每种标签形式的频率（自然校正后¹³C丰度）反映了细胞溶质AcCoA的分数乙酰基标记的二项分布(第页)可以通过最小化计算的和实验观察到的棕榈酸酯标记之间的残差平方和来量化：

在单独的窗口中打开

图1

百分比 ¹³ 细胞溶质乙酰辅酶A的C标记可通过棕榈酸酯标记进行量化。（A）增加的¹³C类₂-乙酰辅酶A标记使棕榈酸酯标记模式向右移动。¹³C类₂-乙酰辅酶a（AcCoA）标记可通过确定观察到的棕榈酸酯标记与根据不同乙酰辅酶a（AcCo a）标记分数计算出的二项式分布（如右侧所示）之间的最佳拟合来量化。（B）U形稳定棕榈酸酯标签-¹³C-葡萄糖和U-¹³MDA-MB-468细胞中的C-谷氨酰胺。（C）葡萄糖和谷氨酰胺产生乙酰辅酶A的百分比。对于（B）和（C），数据为的平均值±SDn个 = 三。

我们将此方法应用于在含有U的培养基中生长的MDA-MB-468细胞-¹³C-葡萄糖和U-¹³C-谷氨酰胺。由此产生的稳态棕榈酸酯标记模式显示出多重¹³C标记的表格以及剩余的未标记的M⁰峰值（图1B） ●●●●。M⁰-标记形式是清除未标记血清脂肪酸的结果，在确定AcCoA标记时可以忽略不计。根据剩余的标记分布，我们计算出87%的AcCoA标记来自葡萄糖，6%来自谷氨酰胺，其中93%的AcCoA标记来自这两个主要碳源（附加文件1：图S1）。HeLa和A549细胞也获得了类似的结果（图1C） ●●●●。

细胞溶质AcCoA的很大一部分并不来自缺氧细胞中的葡萄糖或谷氨酰胺

缺氧是肿瘤中常见的现象[17–19]并影响中枢碳代谢[6,7]. 为了研究缺氧如何影响细胞溶质乙酰辅酶A的产生，我们将细胞培养在1%氧气中₂在U在场的情况下-¹³C-葡萄糖，U-¹³C-谷氨酰胺，并用两种底物进行标记，然后进行棕榈酸标记的LC-MS分析。与早期的观察结果类似，我们注意到葡萄糖中AcCoA的标记减少，缺氧时谷氨酰胺的标记增加（附加文件1：图S1）[8–10]. 然而，令人惊讶的是，在葡萄糖和谷氨酰胺都充足的实验中¹³C-标记，缺氧MDA-MB-468细胞与正常氧细胞相比，棕榈酸酯标记分布向左移动（即朝向更多未标记的AcCoA）（图2A） ●●●●。我们在HeLa和A549细胞中进行了类似的观察（尽管不太明显）。对棕榈酸AcCoA标记进行量化表明，MDA-MB-468细胞中49%的AcCoA和葡萄糖和谷氨酰胺标记的HeLa细胞中78%的AcCoA（图2B） 而在常压条件下，所有细胞的标记率均超过90%。因此，缺氧显著影响了AcCoA的产生，约20%-50%的AcCoA库来自一个或多个碳供体，而不是葡萄糖和谷氨酰胺（图2C） ●●●●。

在单独的窗口中打开

图2

乙酰-CoA标签来自 ¹³ C-葡萄糖和 ¹³ C-谷氨酰胺在缺氧时减少。（A）U形稳定棕榈酸酯标签-¹³C-葡萄糖和U-¹³C-谷氨酰胺在常氧和缺氧条件下（1%O₂)条件。（B）低氧条件下葡萄糖和谷氨酰胺产生乙酰辅酶A的百分比。（C）一个或多个额外的碳供体对低氧条件下乙酰辅酶A的生成起着重要作用。缩写：Gluc、glucose；谷氨酰胺。数据为的平均值±SDn个 = 三。

氨基酸和脂肪酸是AcCoA的次要成分

除葡萄糖和谷氨酰胺外，其他介质成分的分解代谢必然会对缺氧时的AcCoA库产生重大影响。我们将氨基酸确定为可能的候选氨基酸，并首次测试其分解直接导致AcCoA的氨基酸，即支链氨基酸、赖氨酸和苏氨酸[20]. 为此，我们在1%O培养MDA-MB-468细胞₂介质类似于DMEM，但带有U-¹³所示氨基酸的C-标记形式。实际上没有¹³在棕榈酸盐中观察到C标记（图三A） 表明这些氨基酸不是AcCoA生成的主要贡献者。为了排除其他氨基酸的潜在贡献，我们在DMEM中用U培养细胞-¹³C-标记形式的葡萄糖和所有氨基酸。与使用U的DMEM相比，AcCoA标记略有增加-¹³C-葡萄糖和U-¹³C-谷氨酰胺（图三B） 但这仅占替代AcCoA源的一小部分。

在单独的窗口中打开

图3

氨基酸（谷氨酰胺除外）和脂肪酸不是缺氧时胞浆乙酰辅酶A的主要来源。（A）低氧条件下棕榈酸酯标记（1%O₂)MDA-MB-468细胞，在支链氨基酸加赖氨酸和苏氨酸被其各自U取代的培养基中生长48小时-¹³C标签表格。（B）相同的条件，除了葡萄糖和谷氨酰胺或葡萄糖和所有氨基酸被U取代之外-¹³C标签表格。（C）低氧条件下棕榈酸酯标记（1%O₂)MDA-MB-468细胞，在添加20μM U的培养基中生长-¹³C-棕榈酸盐48小时。数据为的平均值±SDn个 = 三。

由于DMEM组分似乎不负责AcCoA的产生，并且细胞在10%的血清中培养，我们认为脂质/脂肪酸氧化可能是AcCoA来源[21]. 我们用20μM U培养细胞-¹³C-棕榈酸酯导致约20%的细胞棕榈酸酯池标记（图三C） ●●●●。标记棕榈酸酯的氧化和随后的AcCoA生成应导致合成部分标记形式的棕榈酸酯，尤其是M⁺²和M⁺⁴表格（附加文件1：图S2）。例如，假设20%的细胞棕榈酸酯池被完全标记，即使来自未知来源的贡献只有13%来自棕榈酸酯氧化，10%M⁺²表格应该存在。只有更小的M⁺²观察到峰值。虽然棕榈酸以外的选定脂质可能仍有助于AcCoA池，但最简单的解释是脂肪酸氧化不是AcCoA的主要来源。

醋酸盐是缺氧时AcCoA的主要额外碳源

我们接下来研究了缺氧细胞是否能激活醋酸盐生成AcCoA。虽然我们在实验中使用了透析血清，并且醋酸盐不是DMEM的组成部分，但我们考虑到可能仍然存在微量，或者醋酸盐是作为其他来源的分解代谢中间体产生的（例如来自蛋白质脱乙酰化）。我们在1%O中培养MDA-MB-468细胞₂在含有U的DMEM中-¹³C-葡萄糖和U-¹³C-谷氨酰胺和添加更多U-¹³C-乙酸盐（图4A） ●●●●。AcCoA标记随着U的增加而显著增加-¹³C-醋酸盐浓度，约50%至86%，500μM U-¹³C-醋酸盐。与U孵育后，在正常毒性细胞中未观察到AcCoA标记的显著增加-¹³C-醋酸盐。因此，醋酸盐在缺氧时选择性地促进AcCoA。

在单独的窗口中打开

图4

缺氧时AcCoA的主要补充来源是醋酸盐。（A）百分比¹³C类₂-乙酰辅酶A标记在低氧（1%O）条件下由棕榈酸酯标记定量₂)以及在含有U的培养基中生长的正常毒性MDA-MB-468细胞-¹³C-葡萄糖和U-¹³C-谷氨酰胺，并补充指示浓度的U-¹³C-醋酸盐。（B）新鲜10%DFBS、DMEM和含10%DFBS的DMEM中的醋酸盐浓度。（C）百分比¹³C类₂-乙酰辅酶A标记低氧（1%O₂)HeLa和A549细胞。对于（A）和（C），数据为n个 ≥ 2.对于（B），数据是平均值±SEMn个 = 三。

为了确定培养基中的微量醋酸盐水平是否可以解释碳源缺失或更可能产生醋酸盐的分解代谢反应，我们测量了无血清新鲜DMEM、透析血清和10%透析血清新鲜DMEM中的醋酸盐水平（图4B） ●●●●。值得注意的是，DMEM和血清（尽管是透析过的）都含有相当多的醋酸盐，在完整的培养基中（DMEM含有10%透析过的血清），醋酸盐总量约为285μM。这在人类受试者报告的血浆醋酸盐浓度范围内（50–650μM）[22–25]. 添加250μM U-¹³该培养基中的C-醋酸盐使AcCoA标签增加18%，总计增加73%（图4A） ●●●●。考虑到在此特定条件下标记和未标记的部分大致相等，如果要标记整个醋酸盐池，这将转化为91%AcCoA标记，类似于正常氧细胞中葡萄糖和谷氨酰胺的AcCoA标签（图1C） ●●●●。因此，新鲜培养基中的醋酸盐似乎是AcCoA的主要低氧诱导因子。类似于MDA-MB-468细胞，U-¹³醋酸C-也标记缺氧HeLa和A549细胞中的AcCoA（图4C） ●●●●。

讨论

肿瘤需要持续供应脂肪酸来维持细胞复制。据认为，大多数癌症都会通过以下途径获得相当一部分非必需脂肪酸从头开始合成。这需要AcCoA及其2-碳乙酰基作为碳供体。在营养充足和氧合良好的条件下，AcCoA主要由葡萄糖制成。然而，肿瘤细胞经常经历缺氧，导致葡萄糖碳进入TCA循环的机会有限。这反过来影响AcCoA的生成，有人提出缺氧细胞可以通过增加谷氨酰胺衍生碳在α-酮戊二酸还原羧基化途径中的AcCoA生成来进行补偿[8–10].

在这里，我们研究了来自¹³C标记底物转化为棕榈酸盐[14]使用部分棕榈酸酯标记衍生细胞溶质AcCoA标记。与早期发现一致[8–10]，我们观察到缺氧时谷氨酰胺的AcCoA标记增加。然而，AcCoA的很大一部分并没有从葡萄糖或谷氨酰胺中标记出来。通过后续¹³C-追踪研究发现，这一分数标记来自醋酸盐。

区分底物对AcCoA标记和净合成的贡献很重要。高标记部分可以通过底物与AcCoA（或其母体分子柠檬酸盐）来回交换（或形成交换）2-碳单元的中间体来实现，而不必对AcCoA池做出净贡献。与Tomer Shlomi一起，我们认为α-酮戊二酸和柠檬酸之间的交换，而不是净2碳单位捐赠，解释了大多数谷氨酰胺AcCoA标记[11]. 醋酸盐生成AcCoA是由乙酰辅酶A合成酶介导的（ACSS1是线粒体，ACSS2是细胞溶质），它消耗ATP来驱动净反应；因此，醋酸盐和AcCoA之间的可逆交换不太可能解释在缺氧条件下从醋酸盐中观察到的AcCoA标记。然而，醋酸盐和AcCoA之间的无效循环可能会增加醋酸盐的表观贡献。然而，其他因素可能会导致对这一贡献的低估。U的AcCoA标签-¹³C-葡萄糖可以通过游离标记的醋酸盐作为中间体产生。U的AcCoA标签-¹³C-谷氨酰胺可能涉及α-酮戊二酸和柠檬酸盐之间的可逆交换，从而稀释醋酸盐的标记。因此，乙酸盐对净AcCoA合成的贡献可能实际上超过了此处观察到的标记程度。

无论醋酸在缺氧中的精确净贡献如何，一个显著的方面是，只有在培养基中的醋酸（~300μM）受到污染时，才会产生显著贡献。这远远低于葡萄糖（25 mM）或谷氨酰胺（4 mM）。据报道，人体受试者血浆中的醋酸盐浓度范围为50至650μM[22–25]因此，在人类肿瘤中可能发生醋酸盐向AcCoA的显著转化。这得到了以下临床观察的支持：¹¹C-醋酸盐PET可用于肿瘤成像，尤其是常规FDG-PET通常无法成像的肿瘤[26]. 我们的结果表明¹¹C-醋酸盐PET在众所周知的低氧肿瘤（如胰腺癌）中可能特别重要。初步结果提供了这方面的证据[27].

最后，由于我们对脂肪酸标记的测量特别反映了细胞溶质AcCoA，因此细胞溶质乙酰辅酶A合成酶ACSS2很可能在观察到的醋酸盐同化中发挥重要作用。因此，抑制ACSS2作为一种潜在的治疗方法值得研究。

结论

在缺氧培养的癌细胞中，四分之一到一半的胞浆乙酰辅酶A不是从葡萄糖、谷氨酰胺或其他氨基酸中获得的。另一个主要的乙酰辅酶A来源是醋酸盐。在人体血浆中发现低浓度的醋酸盐（例如50–650μM），并且在典型的组织培养基中也会作为污染物出现。在缺氧时，这些量被大量选择性地并入细胞乙酰辅酶A中。因此，¹¹醋酸纤维PET显像可能有助于探测缺氧性肿瘤或肿瘤区域。此外，通过靶向乙酰辅酶A合成酶（例如ACSS2）抑制醋酸盐同化可能会损害肿瘤生长。

电子辅助材料

致谢

脚注

参与者信息

Jurre J Kamphorst，电子邮件：ku.ca.wogsalg@tsrohpmak.erruj.

Michelle K Chung，电子邮件：moc.liamg@gnuhc.iyek.ellehcim公司.

景凡，电子邮件：moc.liamg@rodamagnij.

约书亚·D·拉比诺维茨，电子邮件：ude.notecnirp@rhsoj.

工具书类