美国国家科学院院刊。2015年2月3日；112（5）：E478–E486。
以长篇论文形式
骨细胞介导骨中典型Wnt/β-catenin信号的合成代谢作用
,a、，1,2 ,a、，b、，1 ,一 ,一 ,c（c） ,c（c） ,d日 ,一 ,a、，b条和a、，b、，e、，2
Jesus Delgado-Calle（耶稣·德尔加多·卡勒）
一解剖与细胞生物学系
b条鲁德布什退伍军人管理医疗中心和
张华佳
c（c）印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院儿科，邮编：46022；和
纳迪娅·卡莱索
c（c）印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院儿科，邮编：46022；和
Makoto M.武藤
d日日本京都606-8501京都大学医学研究生院药理学系
莉莲·普罗特金
一解剖与细胞生物学系
b条鲁德布什退伍军人管理医疗中心和
Teresita Bellido公司
一解剖学和细胞生物学系
e（电子）印第安纳大学医学院医学系内分泌科；
b条鲁德布什退伍军人管理医疗中心和
一解剖与细胞生物学系
e（电子）印第安纳大学医学院医学系内分泌科；
b条鲁德布什退伍军人管理医疗中心和
c（c）印第安纳州印第安纳波利斯印第安纳大学医学院儿科，邮编：46022；和
d日日本京都606-8501京都大学医学研究生院药理学系
由马萨诸塞州查尔斯敦马萨诸塞总医院John T.Potts编辑，于2014年12月30日批准（2014年5月27日收到供审查）
作者贡献：X.T.和T.B.设计的研究；X.T.、J.D.-C.、K.W.C.、M.M.和H.Z.进行了研究；麻省理工学院提供了新的试剂/分析工具；X.T.、J.D.-C.、N.C.、D.B.B.、L.I.P.和T.B.分析数据；X.T.、J.D.-C.、L.I.P.和T.B.撰写了论文。
1X.T.和J.D.-C.对这项工作做出了同等贡献。
- 补充资料
补充文件。
GUID:B51E173E-8E76-4B8E-95B5-FE4F876643F7
补充文件。
GUID:564E48B4-7859-4269-9FE5-D3D7DBAFB860
重要性
骨合成代谢刺激激活典型的Wnt/β-catenin信号传导，而该途径的人类突变强调了其在骨累积中的重要作用。然而，负责策划这些行动的部门仍然难以捉摸。本研究确定骨细胞是骨中典型Wnt/β-catenin信号合成代谢效应的介质；此外，它通过骨细胞与成骨细胞中经典Wnt/β-catenin信号的选择性激活，从不期望的（吸收减少和白血病）结果中分离出期望的（骨增益）。长命骨细胞占骨细胞的90%以上，因此，与稀少、短命的成骨细胞相比，它代表了更合理、更有效的靶细胞来诱导骨合成代谢。这些发现为开发针对骨细胞Wnt/β-catenin信号的骨质疏松症和其他骨相关疾病的更好治疗方法铺平了道路。
关键词：骨细胞、典型Wnt、β-catenin、骨合成代谢、notch信号
摘要
骨细胞，占骨中90%以上的细胞，嵌入矿化基质中，通过尚不清楚的机制协调骨表面的破骨细胞和成骨细胞活性。骨合成代谢刺激激活Wnt信号传导，沿着这条途径的人类成分突变强调了其在骨累积和维持中的关键作用。然而，负责组织Wnt合成代谢活动的细胞仍然难以捉摸。我们在这里表明，典型Wnt信号仅在骨细胞中激活[显性活性（da）βcat其他小鼠]诱导骨合成代谢并触发Notch信号传导而不影响生存。这些特征与成骨细胞中表达相同daß-catenin的小鼠的特征形成对比，后者表现出减少白血病的再吸收和围产期死亡。达ß猫其他与同窝对照组相比，小鼠的轴骨和阑尾骨的骨密度增加，松质骨/小梁骨和皮质骨的骨体积显著增加。达ß猫其他小鼠表现出吸收和形成标记物增加，松质骨和皮质骨中破骨细胞和成骨细胞数量增多，骨基质生成增加，骨膜骨形成率显著提高。在daßcat的骨骼中，Wnt和Notch信号传导靶基因、成骨细胞和骨细胞标志物以及促破骨细胞和抗破骨细胞因子升高其他老鼠。此外，RANKL的增加取决于Sost/硬化蛋白。因此，骨细胞β-catenin信号的激活会增加破骨细胞和成骨细胞，从而导致骨质增加，并且足以激活Notch通路。这些发现证明了骨细胞与成骨细胞中β-连环蛋白激活的不同结果，并确定骨细胞是骨中典型Wnt/β-连环素信号合成代谢作用的中心靶细胞。
成骨细胞的成骨作用与破骨细胞的骨吸收有关。这两个对立过程之间的适当平衡对骨骼健康至关重要，这种平衡的破坏有利于再吸收，从而导致骨质减少，最终导致骨质疏松症，这是一种影响全球数百万人的毁灭性疾病(1). 骨细胞，即嵌入矿化骨基质中的终末分化成骨细胞，占所有骨细胞的90%以上，通过尚未阐明的机制控制成骨细胞和破骨细胞的生成和活性(2,三).
Wnt信号通路已成为骨稳态的关键调节器(4). Wnt信号控制发育和出生后的过程，包括细胞增殖、分化、极性和通过规范和非规范途径的迁移(5). β-连环蛋白是典型Wnt信号传导的必需传感器。Wnt配体与Frizzled受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白（Lrp）5或6结合后，稳定β-catenin，β-catentin转位到细胞核，并与转录调节因子Tcf/Lef相互作用，激活Wnt靶基因的转录。经典Wnt/β-catenin（以前称为β-catentin）信号在骨内稳态中的重要性是通过Lrp5中的功能丧失和获得突变发现的，这些突变分别导致骨质疏松-假胶质瘤和高骨密度综合征(6–8). β-连环蛋白信号依赖于分化阶段对成骨细胞发挥细胞上下文依赖性功能。在早期阶段，间充质祖细胞和成骨细胞承诺的前体细胞中的β-连环蛋白失活阻止了成骨细胞分化，从而分别导致骨缺失和成熟成骨细胞缺失(9–12). 然而，在后期，成熟成骨细胞/骨细胞或仅骨细胞中的β-连环蛋白失活似乎不会影响成骨细胞分化或骨形成，反而会增加破骨细胞分化和骨吸收，导致低骨量(13–15). 相反，成骨细胞中β-catenin的激活通过减少骨吸收而导致骨量增加，但对成骨细胞的生成也没有明显影响(4,13). 此外，成骨细胞中的β-连环蛋白激活诱导Notch信号依赖性的造血改变，导致贫血、髓系扩张、急性髓系白血病的发展和围产期死亡(16).
即使成骨细胞中β-catenin信号的基因操作改变破骨细胞和骨吸收，但对成骨细胞或骨形成没有明显影响，该途径也与骨合成代谢有关。因此，公认的骨形成刺激物，如甲状旁腺激素和机械负荷，下调骨细胞Sost基因并增加β-catenin信号(17–22). Sost编码硬化蛋白，这是一种有效的骨形成抑制剂，通过与Lrp5/6结合对抗Wnt信号。硬化蛋白表达缺乏是高骨量/高骨形成人类疾病van Buchem和硬化症的原因(23–26). Lrp5基因的突变使蛋白无法被硬化蛋白和/或另一种Wnt拮抗剂Dkk1抑制，也因高骨形成而导致高骨量(27,28). 这些发现增加了这样一种可能性，即负责β-catenin信号合成代谢结果的细胞并不是基因操作所针对的成骨细胞系的不成熟细胞。我们在这里探讨了骨细胞（谱系中分化程度最高的细胞）介导途径合成代谢作用的可能性。我们建立了一种新的骨细胞特异性敲除小鼠模型，在骨细胞中表达显性活性（da）β-连环蛋白（daßcat其他)并且表明，骨细胞中β-catenin信号的激活促进了骨重塑，并有利于骨形成，从而导致骨增益。这种现象是由于成骨细胞/骨细胞分化的充分刺激，导致更多的骨基质生成成骨细胞和更多的骨细胞，以及Sost/硬化蛋白依赖性刺激RANKL基因表达导致破骨细胞增加。此外，骨细胞β-catenin信号通路的激活足以增强Notch信号通路的成分，但不会改变造血或存活。这些发现证明了骨细胞与成骨细胞中β-连环蛋白激活的不同结果，并确定骨细胞是骨中典型Wnt/β-连环素信号合成代谢作用的中心靶细胞。
结果
骨细胞中β-连环蛋白的激活增加了骨密度和松质骨体积。
敲入式猫其他Western印迹显示小鼠在骨细胞中表达显性活性β-连环蛋白()和免疫组织化学(和图S1A类)与对照窝友相比，典型Wnt靶基因表达上调液氧（不包括3）/+(). 达ß猫其他小鼠出生时没有表现出明显的骨骼异常，如正常形成的骨骼和软骨所示(). 断奶后，大猫其他小白鼠的生长速度与同窝小白鼠相比有所下降，体重下降了20-50%。6个月大猫咪其他小鼠体型变小()股骨长度降低20%（12.8±0.9，而同窝对照组为15.9±0.8 mm）。然而，在2个月龄或4个月龄时，生长板厚度没有发现差异(和图S2). 2个月龄猫的循环甲状旁腺素增加，钙减少其他小鼠，但在4个月龄的小鼠中两者都是正常的(图S3A类). 未检测到磷酸盐变化。
β-catenin的骨细胞激活增加骨中Wnt信号传导，提高骨密度和松质骨体积。(A类)对照组（c）和daßcat长骨裂解物中显性活性（da）和野生型（wt）β-catenin的Western blotting其他（da）小鼠（2个月龄）。(B类)股骨远端骨细胞β-catenin的免疫组织化学研究。(C类)使用腰椎（L4）mRNA（2-mo-old）对典型Wnt靶基因进行qPCR*P（P）<0.05 byt吨测试，n个=6-9只小鼠。(D类)新生幼崽的整体骨骼染色；骨骼（红色）和软骨（蓝色）。标尺单位为毫米。(E类)控制和数据猫其他雄性小鼠（6个月龄）。雌性小鼠的BMD(F类)雄性和雌性小鼠（4-mo-old）(克). *P（P）双向方差分析<0.05，n个=7–10只小鼠。f、 股骨；s、 脊柱；t、 总计。(H（H）)后肢X光片。(我)4月龄小鼠股骨远端纵切面的Von Kossa/甲苯胺蓝染色。(J型)4月龄小鼠股骨远端的典型μCT横断面重建图像。用μCT测量4月龄小鼠的BV/TV、小梁数（Tb.N.）、分离度（Tb.Sp.）和厚度（Tb.Th.）(K（K）)2-mo-old和4-mo-old小鼠的组织形态计量学(L（左）). *P（P）<0.05 byt吨测试，n个=4只小鼠。（比例尺：B类，25微米；H（H），2毫米；我和J型，0.5毫米）
纵向分析显示，大猫的骨密度（BMD）逐渐增加其他小鼠与对照组的比较(). 4个月大时，雌雄大猫其他小鼠的总骨密度、脊椎骨密度和股骨骨密度也有类似的增加(). X射线摄影显示大ß猫的股骨、胫骨和脊椎骨密度更大其他小鼠与对照组的比较(). Von Kossa或Goldner三色染色显示，大猫股骨远端有更多矿化骨其他老鼠(和图S2B类和C类). 股骨远端的微计算机断层扫描（μCT）分析显示松质骨较多()4个月龄时，骨体积和小梁数量分别增加了8倍和6倍，小梁间距显著减少，小梁厚度增加(). 组织形态计量学分析在2个月龄和4个月龄时证实了这些发现，尽管小梁厚度没有增加().
骨细胞激活β-连环蛋白意外增加骨吸收。
虽然下门牙的萌出还没有完全，但大猫其他小鼠上切牙和臼齿完全萌出()在2个月龄和4个月龄时，I型胶原（CTX）的C末端肽片段（一种骨吸收标记物）的循环水平分别比对照组的幼崽增加了三倍和两倍(). 在大ß猫的骨骼中发现了大量破骨细胞其他小鼠，通过破骨细胞特异性TRAPase染色检测，并对2个月龄和4个月龄小鼠进行定量(). 在大ß猫股骨远端的松质骨中，每个组织面积的破骨细胞数量增加了两到三倍其他小鼠与对照组的比较(). 然而，基因型之间的破骨细胞数量和每个骨表面的表面标准化没有差异，这可能是由于大猫松质骨表面显著增加所致其他老鼠。在股骨皮质内表面，破骨细胞的数量和表面也分别显著增加了六倍和八倍，但仅在4个月大时增加(). 此外，大ß猫皮质骨内破骨细胞增多其他2或4个月大的小鼠(). 这一效应导致2个月龄和4个月龄的同卵双胞胎皮质内孔隙度分别增加了21倍和35倍(). 在单个破骨细胞表面未检测到基因型之间的差异()或骨膜表面破骨细胞的数量(). daßcat表现出的吸收增加其他使用Col1-2.3kb-Cre小鼠与之前报道的在成骨细胞中表达相同daβ-catenin的小鼠表型进行对比，这些小鼠没有牙齿萌出，断奶后死亡，并且表现出低骨吸收和骨质疏松(13).
β-catenin的骨细胞激活增加骨吸收。(A类)大ß猫头部X光片显示上门牙萌出（红色箭头）其他小鼠（1个月龄）。(B类)血浆CTX水平，n个=8-14只小鼠*P（P）<0.05 byt吨测试。(C–H型)股骨远端纵切面TRAPase染色破骨细胞的组织形态计量学定量（2月龄和4月龄小鼠）。(C类)4月龄小鼠松质骨破骨细胞的显微图像。地区一和b条右侧放大。与组织面积（N.Oc/T.Ar）或骨表面（N.Oc/BS）标准化的破骨细胞数量，以及与骨表面标准化的破骨细胞表面（Oc.S/BS）。(D类)显微镜图像显示4月龄小鼠股骨远端皮质内和皮质内骨表面的破骨细胞。箭头指向骨膜表面。地区c（c）和d日右侧放大。(E类)根据骨表面（BS）归一化的皮质破骨细胞数量（N.Oc）和表面（Oc.S）。(F类)皮质内破骨细胞数量标准化为皮质骨面积（N.Oc/Ct.Ar）和孔隙度百分比。(克)松质骨、皮质内骨和皮质内骨上单个破骨细胞占据的平均表面。(H（H）)骨膜表面破骨细胞数（N.Oc/BS）*P（P）<0.05 byt吨测试，n个=3只小鼠用于（C–H). （比例尺：C、 左侧，0.5毫米；C、 右侧0.1毫米；D、 左侧0.2毫米；D、 右侧，0.05毫米）
β-连环蛋白的骨细胞激活增加皮质骨、成骨细胞数量和骨形成。
2个月龄和4个月龄小鼠的血浆中成骨细胞标志物碱性磷酸酶升高(). 在2个月大的小鼠中，1型前胶原氨基末端前肽（P1NP）（一种真正的骨形成标记物）也升高(). μCT显示大ß猫股骨干横截面骨较多，直径增大其他4个月时小鼠与对照组的比较(). 量化显示骨膜周长、皮质骨面积和组织面积增加4.7倍、3倍和2倍，导致BA/TA增加(). 与股骨远端的发现一致()，大猫其他小鼠股骨干皮质孔隙度也显著增加了150倍().
β-catenin的骨细胞激活增加骨膜骨形成和皮质骨。(A类和B类)血浆碱性磷酸酶和P1NP水平，n个=8–11只小鼠*P（P）<0.05 byt吨测试。(C类)红线所示位置（4个月）股骨横截面的代表性重建μCT图像。显示骨膜周长、骨面积（BA）、组织面积（TA）、BA/TA和皮质孔隙度。(D类)骨膜骨表面的动态组织形态计量学分析。骨膜表面荧光色素掺入的典型图像。（比例尺：0.1 mm）BFR/BS，每个骨表面的骨形成率；MAR，矿物同位速率；MS/BS，每个骨表面的矿化骨表面百分比*P（P）<0.05 byt吨测试，n个=每个基因型7只小鼠。
动态骨组织形态计量分析显示，2个月和4个月大时骨膜表面的骨形成率（BFR/BS）较高(). 这种效应是由较高的矿物同位率（MAR）和每骨表面矿化表面（MS/BS）共同作用的结果，分别反映了单个成骨细胞活性的增加和覆盖骨表面的成骨细胞数量的增加。
与骨膜表面骨形成增加相一致，松质骨中每个组织面积的成骨细胞数量增加()股骨皮质内表面()达ß猫其他2个月龄和4个月龄的小鼠。然而，与骨膜表面相比，动态组织形态计量学分析未能证明这些表面的BFR更大。相反，在松质骨中，BFR/BS在2月龄时没有改变，但在4月龄时由于MAR较低而降低(图S4A类). 在皮质内表面，2和4个月时MAR较低，4个月后MS/BS较低；因此，BFR/BS在这两个时间段都较低。4个月时皮质内MS/BS显著降低可能是由于N.Oc/BS和Oc较高。在4个月时发生但在2个月时不存在的S/BS(图S4B类). 在4个月龄的松质表面和两个年龄的皮质内表面，BFR降低与双标记表面覆盖的表面显著减少和更多的单标记表面有关(图S4C类和D类). 此外，与第二个（红色）标签相比，在4个月大时，第一个（绿色）标签在两个骨骼表面的丢失更为优先(图S4E类). 此外，与枯落物对照组的强荧光和宽标签相比，绿色和红色标签都显示出明显的变薄(图S4C类和D类). 然而，骨基质的形成没有受到损害，这可以通过两种特殊的染色程序来区分非矿化骨基质和矿化骨基质所显示的类骨的显著积聚来证明(和图S2B类和C类). von Kossa染色切片的定量显示，2个月龄时股骨远端松质骨和骨干皮质骨中的类骨体积显著增加，4个月龄则略有增加(和图S3B类). 2个月时，类骨质增多，MAR降低，导致松质骨表面和两个年龄段的皮质内表面矿化延迟时间增加(). 此外，松质骨室和骨干的骨细胞密度在两个年龄段均增加(). 相反，股骨远端皮质骨的类骨体积和骨细胞密度均与对照组不同(和图S3B类). 骨吸收增加和类骨质积累的结合解释了即使循环P1NP、骨膜BFR、松质/皮质内成骨细胞数量和类骨质体积增加时，2个月龄时骨密度缺乏增加。4个月龄时，大ß猫类骨体积增加其他小鼠体重减轻，表明类骨质最终会矿化。因此，4月龄时的骨密度高于对照组，6月龄时骨密度的差异更加明显().
β-catenin的骨细胞激活增加松质骨和皮质骨中的成骨细胞数量、类骨生成和骨细胞密度。对2个月龄和4个月龄小鼠的股骨松质骨和皮质骨进行静态组织形态计量学分析。(A类和B类)每个组织面积的成骨细胞数（N.Ob/T.Ar）和每个骨表面的成骨细胞数（N.Ob/BS）。(C类)显示了用von Kossa/McNeal（骨黑和类骨浅蓝色）或Goldner’s三色（骨绿和类骨橙色/红色）染色的股骨纵切面的代表性图像，以区分矿化骨和类骨。（比例尺：25µm）(D类)矿化滞后时间计算为骨样厚度除以MAR(E类)骨细胞密度（N.Ot/B.Ar）*P（P）<0.05 byt吨测试，n个=每个基因型7只小鼠。
骨细胞激活β-连环蛋白信号增加成骨细胞/骨细胞分化和破骨细胞原性细胞因子表达。
未检测到增殖标记物PCNA或成骨细胞凋亡率的变化(图S3C类和D类). 相反，与组织和细胞表型一致，成骨细胞和骨细胞的标记物在大ß猫的骨骼中升高其他老鼠。成骨细胞转录因子Runx2和Osterix以及碱性磷酸酶和骨钙素的表达增加，而胶原蛋白1无变化()成骨细胞和骨细胞表达的骨细胞标记物Sost、DMP1、Dkk1和MEPE的表达也增加(). 这一证据与较高的骨细胞密度相结合()表明成骨细胞分化更快，产生更多的骨细胞。此外，在daß猫的所有骨包膜中，硬化蛋白阳性骨细胞的患病率较高其他小鼠与对照组的比较(和图S1B类)即使在大约一半的骨头没有矿化的骨干中（类骨）(). 由于硬化蛋白是矿化骨中完全分化骨细胞的标志物，这一证据与骨细胞加速成熟一致。
β-catenin的骨细胞激活增加成骨细胞和骨细胞标记物以及破骨细胞前因子和破骨细胞抗因子。(A、 B类、和D类)通过qPCR定量腰椎（L4）（2-mo-old）的基因表达*P（P）<0.05 byt吨测试，n个=6-9只小鼠。(C类)在用抗硬化蛋白抗体染色的股骨纵切面上量化硬化蛋白阳性骨细胞的百分比*P（P）<0.05 byt吨测试，n个=3只小鼠。用免疫组织化学方法检测4月龄小鼠股骨远端纵切面RANKL蛋白的表达。(E类和F类)过表达或缺乏Sost基因的小鼠中OPG和RANKL的表达。(克)Wnt激活通过处理5周龄野生型或3周龄对照组和daßcat骨骼诱导OPG和RANKL表达其他带有抗clerostin抗体的小鼠。（比例尺：C类，50微米；D类，25微米）
与成骨细胞/骨细胞中β-catenin激活的小鼠相似(13)，OPG在daßcat中的表达其他小鼠高于对照组（约四倍）(). 然而，RANKL表达更高（>9倍），导致RANKL/OPG比率增加。破骨细胞前体巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）丝裂原的表达也升高。M-CSF和RANKL/OPG比率的增加解释了daßcat破骨细胞和骨吸收增加的原因其他老鼠。破骨细胞标志物组织蛋白酶K（Ctsk）、TRAP、降钙素受体和RANK的mRNA表达在猫的骨骼中没有改变甚至降低其他2个月龄和4个月龄的轴向骨骼和阑尾骨骼小鼠(数据集S1). 由于在骨中检测到大量TRAP阳性破骨细胞，并且循环中CTX增加，这一悖论可以用猫体内的细胞数量来解释其他骨以骨细胞/成骨细胞为主，掩盖了破骨细胞基因表达的增加。
为了解决骨细胞中β-catenin的激活通过Sost/硬化蛋白依赖机制增加RANKL的可能性，在Sost表达改变的小鼠模型中分析了RANKL的表达。在骨细胞中过表达Sost的DMP1 Sost转基因小鼠表现出RANKL表达增加，并且预期OPG和其他Wnt靶基因的表达减少(22) (). 此外，Sost基因敲除小鼠表现出预期的OPG增加，但RANKL表达没有变化(). 这些结果表明，Sost过度表达足以增加RANKL，并且需要通过Wnt激活来增加RANK。此外，就像在达菲猫体内一样其他小鼠，体外激活Wnt信号传导（通过用中和抗体阻断分泌的硬化蛋白；参考文献。29)WT小鼠或对照Catnb小鼠骨器官培养物中OPG和RANKL mRNA表达增加液氧（不包括3）/+老鼠(). 然而，抗clerostin抗体并没有改变OPG已经升高的表达水平，而是逆转了RANKL在大ß猫骨骼中增加的表达水平其他小鼠，证明β-连环蛋白骨细胞激活诱导的RANKL增加需要硬化蛋白功能。总之，这些发现表明，β-连环蛋白的激活增加了成骨细胞谱系所有细胞中的OPG，而它只增加了同样表达Sost/硬化素的骨细胞中的RANKL。
缺口信号位于骨细胞β-连环蛋白激活的下游。
通过β-catenin信号对Notch配体的调节，Wnt和Notch信号通路之间的交叉(30–33). 与这一证据相一致，大猫的骨头其他小鼠Notch配体、Notch受体和Notch靶基因的mRNA表达水平较高(和数据集S1). 尽管在2个月龄和4个月龄时发现基因表达谱有轻微变化，在轴骨或阑尾骨骼中也发现了轻微变化，但在大猫咪中，Notch信号通路所有成分的总mRNA表达都增加了其他老鼠。此外，长骨骨细胞中Notch靶基因Hes 1在蛋白水平上的表达增加().
β-catenin的骨细胞激活可增加Notch通路配体、受体和靶基因的表达，而不会影响造血或寿命。(A–D)对2个月龄和4个月龄小鼠的腰椎（L4）或长骨中的基因表达进行量化；n个=6-9只小鼠。(E类)用免疫组织化学方法检测4月龄小鼠股骨远端纵切面Hes 1蛋白的表达。（比例尺：25μm）(F类)小鼠6个月龄存活率；n个=7–10只小鼠。(克)脾脏重量（2个月和4个月）。(H–J型)红细胞压积和外周血细胞数（1.5和4个月龄小鼠）；n个= 6–8. *P（P）<0.05 byt吨测试。
与最近在成骨细胞中β-catenin激活的小鼠中的发现相反，成骨细胞表现出Jag1依赖性髓细胞扩张，导致白血病、贫血和围产期死亡(16)β-catenin骨细胞激活诱导的Notch配体/受体/靶基因表达增加不会导致过早死亡()或脾肿大，脾脏重量变化很小(). 此外，红细胞压积和红细胞数量正常(); 没有血小板减少，相反，血小板数量略有增加(). 此外，未发现白细胞总数或中性粒细胞、淋巴细胞或单核细胞数量发生变化(). 因此，大猫其他幼年（1.5月龄）或成年（4月龄）小鼠的血液学变化与贫血或白血病不一致。
讨论
骨合成代谢刺激激活典型Wnt/β-catenin信号传导，沿着该途径的人类组分突变强调了其通过刺激骨形成在骨累积和维持中的关键作用。然而，自相矛盾的是，成骨细胞及其祖细胞中β-catenin信号的基因激活会减少破骨细胞和骨吸收，而对骨形成没有明显影响。目前的研究表明，与此相反，仅在成骨细胞系的骨细胞-终末分化细胞中激活此途径足以诱导骨合成代谢。这些发现确定骨细胞是β-catenin信号传导的骨合成代谢作用的中心靶细胞。由于骨细胞寿命长，占骨细胞的90%以上，因此在寻求更好的骨质疏松症和其他骨相关疾病治疗方法的过程中，它们比稀缺、寿命短的成骨细胞更有效。
这里报道的研究结果挑战了目前的范式，即成骨细胞中的β-连环蛋白信号仅调节骨吸收，而不影响骨形成(13–15). 在成骨细胞前体、成骨细胞或骨细胞中缺乏β-连环蛋白的小鼠，由于OPG降低和骨吸收加剧，表现出严重的骨质减少(13–15,34). 然而，2月龄小鼠成骨细胞前体β-catenin的条件性缺失会降低MAR和BFR(34). 此外，骨细胞中β-catenin单倍体不足的小鼠对骨负荷表现出有缺陷的合成代谢反应(35). 这些证据表明，β-连环蛋白信号传导在成骨细胞控制成骨细胞活性中发挥作用。然而，骨合成代谢的直接证据缺失。目前的报告表明，骨细胞中的β-连环蛋白选择性激活可导致骨获得，证明骨细胞是成骨细胞系的细胞，能够对β-连环素信号进行骨合成代谢。这些发现强烈表明，骨细胞也可能通过GSK3β抑制剂或硬化蛋白中和抗体介导由该途径的系统激活诱导的合成代谢，甚至在Wnt途径成分的人类突变中也可能介导合成代谢(4). 骨细胞构成骨中大多数细胞的事实可能解释了为什么骨合成代谢是系统性Wnt激活最明显的结果，即使在某些情况下也可能表现出抑制吸收(36).
我们的发现还确立了关于β-连环蛋白途径控制再吸收的意外事实。达ß猫其他小鼠出现牙齿萌芽、破骨细胞增多和吸收增加。这方面的表型与在成骨细胞中表达相同显性活性β-连环蛋白的小鼠的研究结果形成对比，成骨细胞无牙萌出，表现出吸收减少。因此，骨细胞中β-连环蛋白信号的激活与成骨细胞谱系中不太成熟的细胞相比，对再吸收产生相反的影响。而在这两种情况下，在daßcat中，OPG的表达都增加了其他小鼠RANKL表达更高，导致RANKL/OPG比值升高。先前的研究表明，在Col1-2.3kb表达细胞中缺失或激活β-catenin或激活体内骨钙素表达细胞中的通路，RANKL表达没有变化(13). 因此，骨细胞中β-catenin激活与其他模型的主要区别在于RANKL增加。此外，我们现在证明RANKL增加是daßcat中Sost表达增加的结果其他老鼠。一些证据支持这一机制。Sost的过度表达足以提高RANKL的表达，而Wnt信号传导激活在缺乏Sost基因的小鼠中无法增加RANKL。与体内研究结果类似，体外激活Wnt信号通路可增强RANKL的表达；此外，大ß猫骨骼中RANKL表达增加其他小鼠被抗clerostin抗体所清除。因此，结合以往的研究(13,14)我们的研究结果表明，β-catenin激活增加了成骨细胞系所有细胞中的OPG，而它只增加了也表达Sost的骨细胞中的RANKL。我们的结果与早期研究一致，研究表明Sost/硬化蛋白的高表达上调了RANKL(19,37)并增加破骨细胞(37). M-CSF在大ß猫中的表达也升高其他与我们最近的研究结果一致，M-CSF是骨细胞中RANKL的下游靶点(38). 因此，RANKL和M-CSF升高的组合优于OPG表达增加的组合，然后在da-cat中重吸收升高其他老鼠。大ß猫的表型比较其他骨细胞β-catenin缺失小鼠(15)发现骨细胞中β-catenin的激活和缺失都会导致骨吸收增加。预计，在两种模型中，典型Wnt/β-catenin靶基因OPG的调控方式相反，因为其表达通过激活而增加，通过β-catentin在骨细胞中的缺失而减少。然而，尽管低OPG导致β-catenin缺失导致吸收增加，但由该途径激活导致的高OPG被更高水平的RANKL和M-CSF所克服，然后吸收也增加。
大ß猫破骨细胞较多其他小鼠可能解释了皮质内骨表面存在更多成骨细胞时，低MS/BS和BFR的反常现象。双标签的丢失和大量薄标签的出现可能是由于骨形成后很快被吸收。与这一假设一致，在没有更多破骨细胞的骨膜表面上，很容易检测到更大的BFR。此外，在类骨过度生成的情况下，低MAR导致更长的矿化滞后时间，并表明高骨基质生成率和相对低矿化率之间的不匹配。然而，累积的类骨最终矿化，导致骨密度逐渐增加。
在骨细胞中PTH受体激活的小鼠中发现了类似的高骨量和高骨转换表型(18,19,38–40). 然而，值得注意的是，这两种小鼠模型骨骼表型的机制是截然相反的。事实上，随着骨细胞PTH受体的激活，Sost/硬化蛋白表达降低，而随着骨细胞β-catenin的激活，Sost/硬化素表达增加。由于随着PTH升高，Sost/硬化蛋白和OPG均增加，而不是预期的降低，因此在2个月大的小鼠中发现的PTH水平增加不太可能有助于达菲猫的骨骼表型其他老鼠。
Notch信号通过膜结合配体和受体之间的细胞间通信激活。先前对其他细胞类型的研究表明，Notch激活位于Wnt信号的下游(30–33). 本研究表明，在骨细胞中，β-catenin信号的激活足以触发Notch激活并增加传统Notch靶基因的表达。配体Jag1、2、Dll4以及受体Notch 1、2和4的表达在daßcat中也升高其他这增加了骨细胞β-catenin在整个骨细胞网络中启动Notch激活链的可能性，通过Notch激活，信号以自分泌/旁分泌的方式被放大。早期的研究表明，Notch信号在骨骼中的作用是复杂的，与Wnt信号类似，是细胞间特异性的，并且依赖于成骨细胞分化的阶段(41–44). 特别是，骨细胞中Notch信号的激活对骨稳态有很大影响，其机制尚不清楚，松质骨和皮质骨的机制似乎不同(45). Notch骨细胞活化的小鼠表现出松质骨增加，骨吸收增加，皮质骨孔隙度加剧(45). 这些特征与大猫的特征相似其他小鼠，增加了Notch激活是激活骨细胞β-catenin的一些骨骼后果的可能性。
成骨细胞中β-连环蛋白的激活不仅影响骨骼，还诱导贫血和髓细胞膨胀，导致白血病和6周龄前的过早死亡(16). 这种效应是由于成骨细胞中Jag1表达增加，从而触发造血干细胞祖细胞中的Notch信号。与这些发现相反，大猫其他小鼠没有表现出与贫血或白血病一致的血液学变化，这表明在这种情况下，Jag1（和其他Notch配体）的高表达不会激活造血谱系细胞中的Notch信号。骨细胞中表达的Notch配体无法激活造血细胞中的Notch信号，这可能是因为与成骨细胞相比，骨细胞在生理条件下直接与造血细胞进行细胞间接触的途径相对有限。相反，骨细胞-脂肪细胞在腔隙-小管网络内的接触为骨细胞自身的Notch激活提供了基础，Hes 1表达增加证明了这一点。未来的研究，在当前工作范围之外，有必要阐明由成骨细胞谱系中β-连环蛋白的组成性激活所诱导的Notch激活差异靶细胞的机制。
Sost上调对大ß猫骨合成代谢的影响其他老鼠还没有完全被理解。然而，升高的Sost/硬化素表达可能会调节老年小鼠的合成代谢反应，以保护它们免受过度的骨骼增加。事实上，猫体内循环P1NP、骨膜骨形成和类骨体积的增加其他4月龄的小鼠比2月龄的小。最近有人提出了一种类似的机制来减弱服用抗clerostin抗体后的合成代谢反应(46).
β-连环蛋白是典型Wnt信号的分子介体，因此研究其激活的后果是揭示典型Wnt在骨细胞中的作用的有力途径。然而，值得注意的是，我们的模型并不完全等同于配体对典型Wnt信号的激活，配体也会激活β-catenin上游的受体介导事件，并触发骨细胞以外的其他细胞中的通路。此外，我们的模型也与Wnt配体激活的信号转导不同，Wnt配子可能涉及经典和非经典信号通路。
总之，我们的研究通过选择性激活骨细胞与成骨细胞中典型的Wnt/β-catenin信号，从不期望的（吸收减少和白血病）结果中分离出期望的（骨增益）。
材料和方法
老鼠。
达ß猫其他小鼠由DMP1-8kb-Cre小鼠杂交产生，DMP1-8kb小鼠在骨细胞中表达Cre重组酶，但在成骨细胞中不表达(47)，带Catnb液氧（不包括3）小鼠，其中编码β-catenin降解所需位点的外显子3两侧为LoxP位点(48). 半合子DMP1-8kb-Cre+/−小鼠与纯合Catnb杂交lox（ex3）/lox（ex3)老鼠。交叉渲染50%Catnb液氧（不包括3）/+;DMP1-8kb-核心+/−（名字叫达ß猫其他小鼠）和50%对照Catnb液氧（不包括3）/+老鼠。DMP1-8kb-Cre小鼠的产生和特性已发表(47). DMP1-8kb-Cre小鼠具有C57BL/6背景，以预期孟德尔频率出生，雄性和雌性均可生育，大小和体重正常。DMP1-8kb-Cre小鼠保持为半合子（DMP1-8lb-Cre+/−). DMP1-8kb-Cre小鼠的骨骼表型与野生型C57BL/6小鼠或Catnb小鼠无法区分液氧（不包括3）/+在本研究中，作为窝友对照的小鼠。给小鼠喂食常规湿食（Harlan），随意饮水，并保持12小时的光/暗循环。所有动物程序均由印第安纳大学医学院动物护理和使用委员会批准。
骨骼表型分析。
使用Pixarray 100（Bioptics）在45 kV下1s曝光，生成小鼠骨骼的射线照片。如前所述进行BMD测量和micro-CT分析(19,22). 通过吸入2.5%（vol/vol）异氟烷（雅培实验室）与O混合的异氟烷对小鼠进行麻醉2（1.5 L/min），以及不包括头部和尾部、腰椎（L1-6）和股骨在内的全身BMD通过使用PIXImus II密度计（GE Medical Systems）对1、2、4和6个月龄小鼠进行双能X射线吸收法（DXA）测量。对于显微CT分析，对4个月龄小鼠的骨骼进行解剖，清除软组织，将其固定在10%的福尔马林缓冲液中，并将其储存在70%的乙醇中，直到以6微米的分辨率进行扫描（Skyscan 1172；Skyscan）。
血清生物化学。
在指定年龄禁食3小时后，从小鼠面部静脉的血液中获取血浆。分别使用ELISA试剂盒（生物医学技术和免疫诊断系统）测量P1NP和CTX(41,42,49). 在印第安纳大学医学院综合临床研究中心的Randox Daytona分析仪（Randox Laboratories Limited）上测量碱性磷酸酶。使用小鼠PTH 1–84 ELISA试剂盒（免疫主题）测定血浆中甲状旁腺激素水平。在印第安纳大学医学院普通临床研究中心使用罗氏Cobas Mira S化学分析仪（罗氏诊断）进行钙测量。
骨形态计量学。
为了进行动态骨组织形态计量学分析，小鼠在处死前7天和2天分别注射钙黄绿素（30 mg/kg；西格玛）和茜素红（50 mg/kg；西格玛），如前所述(19,22). 解剖骨骼，将其固定在10%的福尔马林缓冲液中，并嵌入甲基丙烯酸甲酯中。使用金刚石线锯（Histosaw；Delaware金刚石刀）在股骨中段制备厚（100μm）横截面，并研磨至最终厚度约40μm。使用金刚石自动旋转缩微仪Leica RM2255（Leica Microsystems）在股骨内侧远端切割薄（5μm）纵切面。测量总周长、单周长、双周长、第一周长和第二周长以及标签间宽度。当存在单标签但未检测到双标签时，矿物并置率（MAR）的值为0.1µm/d(50). 矿化滞后时间（Mlt）通过将类骨厚度除以MAR计算(51). 对于静态骨组织形态计量学分析，对股骨远端纵切面进行TRAPase或von Kossa染色，并用甲苯胺蓝进行复染。使用OsteoMeasure高分辨率数字视频系统（OsteoMetrics）进行组织形态计量学分析。在确定β-catenin的骨细胞激活对骨体积/组织体积（BV/TV）和小梁参数的影响时，使用总骨体积（矿化+类骨）。对股骨骨干的皮质骨和股骨远端800μm区域的松质骨和皮质骨进行分析，从生长板下方200μm开始。股骨远端的皮质骨被定义为骨膜表面和皮质内表面之间的骨，来源于生长板，并继续向骨干延伸。我们不能排除被视为皮质骨的区域包含一些小梁的可能性，这些小梁是由皮质内表面的突起形成的。还评估了这三个区域的骨细胞密度。使用Osteomeasure软件在股骨远端von Kossa/McNeal染色切片中测量生长板宽度。骨切片也用Goldner’s三色染色法染色，以显示骨样和矿化骨。使用的术语和单位是美国骨与矿物研究学会组织形态计量学命名委员会推荐的(51). 通过使用Tdt介导的dUTP镍标记（TUNEL）试剂盒（EMD-Millipore）对股骨远端松质骨的纵向切片进行染色，测定凋亡成骨细胞的百分比(18).
免疫组织化学。
如前所述，显示的蛋白质在2个月和4个月的石蜡包埋股骨中的表达(17,18). 简言之，切片脱蜡，用3%H处理2哦2抑制内源性过氧化物酶活性，用兔或山羊血清阻断，然后与小鼠单克隆抗CTNNB1（β-catenin）抗体（1:100；BD Biosciences）孵育；兔多克隆抗Hes1抗体（1:500；Abcam）；山羊多克隆抗RANKL抗体（1:100；Santa Cruz Biotechnology）或山羊多克隆抗鼠硬化蛋白抗体（1:100:R&D Systems）。然后用相应的生物素化二级抗体和亲和素结合过氧化物酶（Vectastain Elite ABC试剂盒；Vectora实验室）培养切片。采用二氨基联苯胺底物显色体系（Dako公司）显色。表达感兴趣蛋白的细胞呈棕色，而阴性细胞呈绿色。相应的非免疫IgG被用作阴性对照。评估2月龄小鼠股骨远端皮质骨中硬化蛋白阳性骨细胞的患病率。
定量PCR。
按照报告进行总RNA提取和定量PCR（qPCR）(22). 简单地说，使用TRIzol（Invitrogen）从L4腰椎提取总RNA。利用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）合成cDNA。使用Applied Biosystems或Roche Applied Science的引物探针集通过qPCR分析基因表达。使用ΔCt法将相对mRNA表达水平标准化为持家基因核糖体蛋白S2（ChoB）(19,22).
西方印迹法。
按说明进行蛋白质印迹(22). 从股骨/胫骨骨干（约1/3的骨）制备蛋白裂解物。在10%SDS/PAGE上分离10微克蛋白质，并将其电转移到PVDF膜（Millipore）上。使用山羊多克隆抗小鼠β-连环蛋白抗体（1:1000；R&D Systems）或小鼠单克隆抗PCNA（1:1000）或抗α-微管蛋白或抗β-肌动蛋白（1:2000）抗体（Santa Cruz Biotechnology）进行免疫印迹。使用化学发光法（皮尔斯生物技术）开发印迹。
体外培养。
从3周龄和5周龄野生动物和达菲猫身上采集颅骨和股骨其他小鼠和室友对照组，在含有10%FBS的α-MEM中保存24小时。然后用抗硬化抗体处理骨骼(29)（10µg/mL；Acris抗体）或载体24小时，并分离mRNA。如上所示，通过qPCR测量基因表达。
血液学测量。
使用Microvette采集管（Sarstedt 20.1278.100）通过尾静脉出血收集外周血，并使用Hemavet机器（Drew Scientific）进行血细胞计数分析。
统计分析。
使用SigmaStat（SPSS Science）对数据进行分析。控制和da-cat之间的差异其他使用Student’st吨如图所示，对年龄和骨密度因素进行测试或双向方差分析。A类P（P）0.05或更低的值被认为具有统计学意义。所有值均报告为平均值±标准偏差。
致谢
我们感谢Munro Peacock博士提供的技术建议，以及Kevin McAndrews、Meloney Cregor、Hannah M.Davis、Emily Atkinson、Hugo Gabilondo、Amy Sato和Anthony Acton在组织采集方面提供的技术支持和协助。本研究得到了NIH拨款R01DK076007和美国复苏与再投资法案补充文件S10-RR023710（至T.B.）、退伍军人事务功绩奖I01BX002104（至T.B..）、，印第安纳大学办公室-普渡大学印第安纳波利斯分校研究副校长，负责通过InVestigative Expertise项目（X.T.）培养多元化研究人员。M.M.获得了Fundación Conchita Rábago de Jiménez Díaz和欧洲分子生物学组织的短期访问研究金。
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