丙酮酸羧化酶对非小细胞肺癌的增殖至关重要

新鲜组织（Warburg）切片证实非小细胞肺癌中PC和Krebs循环活动增强。

为了进一步评估人类肺组织中PC活性与GLS1活性的相关性，将13例人类非小细胞肺癌患者新鲜切除的配对CA和NC肺组织薄片（<1mm厚）培养于¹³C类₆-葡萄糖或¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺24小时。这些组织在培养条件下至少24小时保持生化活性和组织完整性(图2A,补充图2，A和B、和参考。26). 当组织与¹³C类₆-葡萄糖、CA切片显示糖酵解富集的百分比明显更高¹³C类_三-乳酸盐（3英寸图2B)与NC切片相比，这表明了Warburg效应。此外，CA组织中的¹³C类₄-,¹³C类₅-、和¹³C类₆-柠檬酸盐（分别为柠檬酸盐的4、5和6图2B)而非癌组织。这些同位素需要PDH、PC和克雷布斯循环的多次旋转的联合作用(图2C). 与标记的柠檬酸盐数据一致¹³C类_三-,¹³C类₄-、和¹³C类₅-谷氨酸（在图2B)CA组织中的Krebs循环和PC活性增强。

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图2

与成对NC肺切片相比，体外CA肺组织切片通过糖酵解和Krebs循环（有或无PC输入）增强了葡萄糖氧化。

将13例人类非小细胞肺癌患者新鲜切除的CA和NC肺组织薄片与¹³C类₆-方法中所述的24小时葡萄糖。通过GC-MS测定乳酸、柠檬酸、谷氨酸和天冬氨酸的富集百分比(A类)¹H（H）{¹³C} HSQC NMR显示标记的乳酸、谷氨酸和天冬氨酸增加。此外，CA组织升高¹³含腺嘌呤核苷酸（1′-AXP）的核糖部分的C丰度，表明组织是可行的，并且具有增强的核苷酸合成能力。(B)CA组织切片(n个=13）通过糖酵解增加了葡萄糖代谢，这是基于¹³C类_三-乳酸（“3”），通过Krebs循环¹³C类_4–6-柠檬酸盐（“4-6”）和¹³C类_3–5-谷氨酸（“3-5”）（参见¹³C命运追踪C类). *P（P）<0.05和**P（P）<0.01（按配对学生）t吨测试。误差条代表SEM(C类)原子解析图说明了PC、PDH和2圈Krebs循环活动如何产生¹³柠檬酸和谷氨酸的C同位素B其在CA组织切片中的富集显著增强。

当组织切片与¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺，¹³C类₅,¹⁵N个₁-谷氨酸（6个谷氨酸补充图2C)CA和NC组织中均产生谷氨酰胺酶，表明谷氨酰胺酶活性（见下文）。此外¹³C类₄-琥珀酸、富马酸、苹果酸和柠檬酸的同位素(补充图2C)被检测到，这证实了谷氨酰胺酶的作用。然而，Krebs循环中间产物除1个同位素外的所有同位素的富集模式都来源于¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺在CA和NC组织中具有可比性(补充图2C). 这些数据以及GLS1表达数据(图1C)表明GLS1是活跃的，并且可能在两种组织的克雷布斯循环恢复中起重要作用。但与PC不同，相对于NC肺组织，GLS1在NSCLC肿瘤中没有显著激活。

PC位于非小细胞肺癌肿瘤的癌细胞中。

非小细胞肺癌肿瘤是一种异质性很强的肿瘤，由多种细胞类型组成，包括癌上皮细胞、肺细胞、成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞，如巨噬细胞。为了确定PC是否在癌细胞中特异性表达，我们对9例患者样本的配对CA和NC组织进行了免疫组织化学分析。图3和补充图3显示4例NSCLC肿瘤中PC水平高于配对NC肺组织中PC水平，这在其他5对样本中也很明显（数据未显示），与Western blot数据一致(图1C). 此外，PC定位于癌上皮细胞的核周区域，而不是肿瘤组织中的基质细胞(图3、左下面板和补充图3D). 这种核周染色模式与PC在线粒体中的定位一致，这得到了PC核周共染色和NSCLC A549细胞线粒体标记物的支持(补充图3、C和D).

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图3

肺组织中PC的免疫组织化学定位。

用抗PC抗体对非小细胞肺癌患者的CA和NC组织进行染色。所示为1名患者的典型显微照片。原始放大倍数，×400（顶部面板）和×600（底部面板）。补充图3提供了其他患者数据。在CA组织中，活的癌细胞对PC染色强烈，而巨噬细胞染色较弱，其他基质细胞对PC没有染色。在邻近的NC组织中，巨噬细胞对PC染色较强，而肺细胞对蛋白质染色很弱。

相反，在NC肺组织中，只有巨噬细胞在PC中富集，而其他细胞类型中的PC染色较弱或缺失(图3和补充图3). 因此，PC优先定位于异质性肺癌组织的癌细胞中。

shRNA对肺癌细胞中PC的抑制导致生长停滞，并降低体内肿瘤负担。

为了评估PC在肺癌细胞生存和生长中的作用，我们使用PC特异性shRNA来抑制个人电脑人A549腺癌细胞的mRNA表达。如所示补充图4A载体shPC54将PC蛋白水平降低至对照水平的20%，而在用shPC55转导的细胞中几乎未检测到PC表达。为了验证细胞中PC活性的抑制，我们将空载体（shEV）、shPC54和shPC55转导的A549细胞培养在¹³C类₆-用GC-MS测定PC活性标记物(图1A). 的级别¹³C类_三-柠檬酸盐，¹³C类_三-天冬氨酸，以及¹³C类_三-两种结构均能降低苹果酸；然而，shPC55比shPC54更有效(补充图4B). 有趣的是，PC活性增加可能发生在其他无关的转化细胞系中(三,27). PC敲除减缓细胞生长，shPC55再次比shPC54更有效(补充图4C). 这证实了shPC55在更大程度上击倒了PC(补充图4A). 此外，PC敲除大大减少了软琼脂中形成的菌落数(补充图4D)，细胞活力降低(补充图4E)和改变的形态(补充图4F).

由于shPC55是抑制PC表达和活性的更有效的结构，我们使用它来探讨PC抑制对额外的NSCLC腺癌细胞株H1299、H2030、HCC827和PC9的影响。PC敲除抑制了所有测试细胞系的净生长(图4A). HCC827和PC9细胞对PC敲除的敏感性高于A549、H2030或H1299细胞。HCC827和PC9细胞也比A549和H1299表达更多PC(补充图5A). 集落形成试验表明，PC敲除显著抑制A549和PC9细胞在软琼脂中形成集落的能力(图4B). 尽管PC抑制并没有减少H1299细胞产生的菌落总数(图4B)，它极大地影响了每个群体的规模(补充图5B)这与细胞生长较慢一致(图4A). 此外，PC抑制的细胞变大，多核化，并且多核化程度随着时间的推移而增加(补充图6，A–C).

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图4

通过shRNA抑制PC抑制体外和体内人类NSCLC细胞系的增殖和致瘤性。

用嘌呤霉素进行转导和筛选后1周开始进行增殖和克隆形成试验。转导后8天在NSG小鼠中进行A549异种移植*P（P）< 0.01, **P（P）< 0.001, ***P（P）<0.0001，以及****P（P）<0.00001（学生）t吨检验，假设方差不相等。误差条代表SEM(A类)用shPC55或shEV转导NSCLC细胞系。增殖试验(n个=6）在相对较长的潜伏期后，所有5个细胞系中的PC敲除均显示出显著的生长抑制。(B)集落形成分析表明，PC敲除降低了A549和PC9细胞在软琼脂中形成集落的能力(n个= 3). (C类)shPC55转导A549细胞的肿瘤异种移植的生长速度比对照shEV肿瘤慢2倍(P（P）<0.001由未配对的韦尔奇版本t吨测试）。肿瘤大小计算为πab/4，其中a和b是x，y直径。每个点代表平均6只小鼠。实线是非线性回归拟合方程：尺寸=a+bt吨²，如方法中所述。(天)小鼠异种移植中PC基因敲除的程度(n个=6）比细胞培养物中的低，导致PC表达的减弱（对照的30%-60%）和生长抑制较少。此外，根据皮尔逊相关系数，切除肿瘤中PC的表达与个体生长率相关。

然后，我们确定了PC-抑制的A549细胞在免疫缺陷小鼠的肿瘤生长中是否受到损害。我们跟踪用空载体（shEV）或shPC55（shPC）转导的A549细胞注射NSG小鼠后的肿瘤生长速率。PC基因敲除导致肿瘤生长速度减慢2倍(P（P）=0.001），通过肿瘤生长动力学的二次曲线拟合进行评估(图4C和补充表3). 我们发现，到第14天，肿瘤生长减少的情况已经很明显(P（P）= 0.009). 此外，肿瘤重量的终点分析显示，shPC55异种移植中的肿瘤比shEV异种移植小30%(P（P）= 0.0073). 然而，体内敲除并不像细胞培养中那样有效。我们发现，36天后，敲除肿瘤中PC的表达增加到使用对照空载体的肿瘤中PC表达的30%至60%(补充图7A). 有趣的是，单个肿瘤的生长速度显著相关(P（P）=0.006）及其PC表达水平(图4D). 因此，残留的PC表达可能是shPC55肿瘤生长能力有限的原因。总之，这些数据表明PC的表达对体内肿瘤的生长很重要。

PC敲低扰乱了Krebs循环活性、细胞的合成代谢能力和谷胱甘肽稳态。

为了研究PC敲除的代谢后果，A549细胞被shPC55转导，生长于¹³C类₆-葡萄糖或¹³C类₅,¹⁵N个₂-此外，将shPC55或shEV转导的A549细胞植入小鼠体内，注射¹³C类₆-葡萄糖。利用葡萄糖示踪剂，我们没有发现PC影响有氧糖酵解的证据，因为PC敲除细胞在培养基中有相似的葡萄糖消耗和总乳酸和标记乳酸的产生(补充图7B). 此外，释放到培养基中的乳酸在PC-敲除细胞和对照细胞中具有相同的富集模式百分比(补充图7C). 同样，携带shEV或shPC55的小鼠肿瘤的总乳酸浓度相当，标记的乳酸来源于¹³C类₆-葡萄糖(补充图7D)和乳酸富集模式的百分比(补充图7E).

相反，PC击倒降低了¹³C类₆-葡萄糖通过克雷布斯循环。如预期，糖酵解进入¹³C类_三-丙酮酸通过PC进入克雷布斯循环受到抑制，这表明¹³C类_三同位素和¹³C类₅-柠檬酸盐（以蓝色圆圈突出显示图5A). 有趣的是，丙酮酸通过PDH进入也受到PC击倒的阻碍（在图5A). 我们在由PC-敲除细胞引发的小鼠肿瘤中观察到了相同的趋势(补充图8)尽管其影响不如细胞培养中的严重。这再次与PC敲低的A549细胞能够在体内某种程度上恢复PC表达的发现一致(补充图7A). 通过细胞和肿瘤中的Krebs循环还观察到葡萄糖氧化减少¹H（H）-{¹³C} 异核单量子相干核磁共振(补充图9，A和C)，这表明¹³C从葡萄糖示踪剂转化为柠檬酸、天冬氨酸、谷氨酸和谷氨酸残基的谷胱甘肽。

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图5

PC敲除扰乱了通过Krebs循环的葡萄糖和谷氨酰胺流量。

¹³C同位素浓度通过GC-MS测定(n个= 3). 值表示三倍的平均值，带有标准误差*P（P）<0.05时**P（P）< 0.01, ***P（P）<0.001，以及****P（P）<0.0001（学生）t吨检验，假设方差不相等。实验重复3次。(A类)用shPC55转导A549细胞10天，然后用¹³C类₆-葡萄糖24小时。正如预期的那样¹³通过PC和Krebs循环活性产生的Krebs周期代谢物的C同位素在PC-deficient细胞中耗尽（由原子分辨图中的蓝点和条形图中的蓝色圆圈跟踪；另请参见图2C）。此外，¹³C类₆-通过PDH的葡萄糖代谢也受到干扰（用红色圆点表示）。(B)用¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺表明，通过GLS的回补输入并不能补偿PC活性的损失，因为GLS活性减弱，正如活性标记（用红点和圆圈表示）所推断的那样。苹果酸酶（ME）对谷氨酰胺衍生苹果酸的脱羧作用以及谷氨酰胺衍生丙酮酸通过PC或PDH重新进入Krebs循环（分别以蓝色和绿色显示）也有所减弱。紫色钻石表示¹⁵N；黑钻石表示¹⁴N。

由于谷氨酰胺水解是另一个主要的补体途径，我们询问该途径是否可以弥补NSCLC细胞中PC缺乏。shPC55或shEV转导的A549细胞与¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺追踪谷氨酰胺水解。如所示图5B，GLS1活性可产生¹³C类₅,¹⁵N个₁-谷氨酸盐(6)来自¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺(7)随后进入克雷布斯循环生成¹³C类₄-琥珀酸盐(4),¹³C类₄- (4)或¹³C类₄^,15N个₁-天冬氨酸(5)，以及¹³C类₄-柠檬酸盐(4). A549细胞容易吸收和代谢¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺进入这些标记代谢物。然而，所有这些标记同位素的水平在PC-敲除细胞中都显著降低（在图5B)这与GLS活性降低一致。GLS活性降低在¹H（H）-{¹³C} HSQC光谱显示，PC-抑制细胞在谷氨酸、天冬氨酸和柠檬酸中加入较少的谷氨酰胺碳(补充图9B). 应该注意的是，酰胺转移酶的活性也有助于生产图5B和补充图9B然而，酰胺转移酶活性的变化不太可能解释所观察到的由PC敲除诱导的Gln代谢受阻。这是因为A549细胞或小鼠异种移植物中PC的敲除导致GLS1表达受到抑制(补充图10A). 此外，A549细胞在细胞裂解液中表现出较高的GLS1表达和GLS活性，表明GLS1的表达对A549细胞的生长很重要（见下文）。

为了进一步探讨谷氨酰胺在前列腺癌抑制细胞中利用的重要性，用2或0.2 mM谷氨酰胺培养A549细胞。我们发现谷氨酰胺限制使对照细胞的生长速度显著降低约30%，但对PC-敲除细胞没有影响(补充图10、B和C). 因此，谷氨酰胺水解不能补偿PC作为NSCLC细胞中Krebs循环中间产物前体的补体供应商的损失。

除了提供还原当量和能量（ATP和GTP）外，克雷布斯循环还为合成代谢提供各种前体。例如，柠檬酸盐从线粒体输出，为脂肪酸合成提供乙酰辅酶A；OAA转氨基为天冬氨酸，用于嘧啶生物合成；α-酮戊二酸胺化为谷氨酸，用于从头合成谷胱甘肽；苹果酸脱羧生成丙酮酸，为脂质生物合成和谷胱甘肽还原提供NADPH(图1A). 为了确定PC抑制对Krebs循环的扰动如何影响这些合成代谢途径，我们使用SIRM跟踪生长在¹³C类₆-葡萄糖或¹³C类₅-谷氨酰胺示踪剂。

PC敲除降低了细胞培养和体内尿嘧啶和腺嘌呤核苷酸的水平(补充图11，A和B). 这些变化至少部分归因于PC敲除减弱了这些核苷酸的生物合成，HSQC NMR分析中观察到的标记葡萄糖与C1′核糖碳的结合减少证明了这一点¹H（H）{¹³抄送}(补充图9A和补充图11A). 这可以解释为尿嘧啶和胞嘧啶环的生成减少，这是由于细胞内葡萄糖和谷氨酰胺合成其前体天冬氨酸减少所致(图5)和体内(补充图8). 通过傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR-MS）分析，我们观察到UTP和CTP环中葡萄糖和谷氨酰胺碳的掺入较少(图6A).

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图6

PC抑制阻碍了Krebs循环驱动的生物合成。

(A类)¹³C原子分解嘧啶生物合成¹³C类₆-葡萄糖和¹³C类₅-谷氨酰胺用一个¹³C类₅-通过磷酸戊糖途径（PPP）产生的核糖部分（红点）和¹³C类_1-3尿嘧啶环（蓝点）来源于¹³C类_2-4-通过克雷布斯循环或ME和PC的联合作用产生的天冬氨酸（蓝色圆点）。用shPC55或shEV转导的A549细胞与¹³C类₆-葡萄糖或¹³C类₅-谷氨酰胺24小时。来自极性细胞提取物的FT-ICR-MS分析的UTP和CTP等位异构体的部分富集显示¹³C类₆-葡萄糖衍生¹³C类₅-核糖（5同位素）和¹³C类₆-葡萄糖–或¹³C类₅-谷氨酰胺衍生¹³C类_1-3-嘧啶环（“6–8”或“1–3”同位素，用绿色虚线矩形突出显示；对于“6-8”同位素，5¹³Cs来自核糖和1-3¹³C来自环）（10，45）。这些数据表明，PC敲除抑制葡萄糖和谷氨酰胺从头合成嘧啶。(B)葡萄糖和谷氨酰胺碳通过柠檬酸盐进入脂肪酸。对非极性细胞提取物标记脂质的FT-ICR-MS分析表明，PC敲除严重抑制了葡萄糖和谷氨酰胺碳并入磷脂酰胆碱脂质的脂肪酰链（偶数）和脂肪酰链加甘油主链（奇数>3）。然而，合成¹³C类_三-甘油骨架（“3”同位素）或其前体¹³C类_三-α-甘油-3-磷酸（αG3P，m+3）¹³C类₆-PC基因敲除增强而非抑制葡萄糖。这些数据表明，PC抑制特别阻碍A549细胞中脂肪酸的合成。值表示三倍的平均值(n个=3），标准误差*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，以及***P（P）<0.001（学生）t吨检验，假设方差不相等。

通过FT-ICR-MS评估同一细胞提取物的非极性组分中的脂质生物合成，该方法可以分解大量完整的脂质并测定其含量¹³甘油和脂肪酰基成分中的C富集(28). PC敲除大大抑制了葡萄糖和谷氨酰胺示踪剂中主要细胞膜成分磷脂酰胆碱的合成(图6B). 使用¹³C类₆-葡萄糖作为示踪剂，¹³丙三醇骨架（3¹³C原子）、脂肪酰基链（甚至¹³C） 和甘油加脂肪酰基残基（奇数>3¹³C） shEV控制单元中(28). 随着PC抑制，几乎所有磷脂酰胆碱物种要么未标记（作为0），要么仅在甘油主链标记（作为3），而¹³反映葡萄糖合成脂肪酰基的C同位素（偶数和奇数>3）在A549细胞中显著减少。此外，甘油骨架前体α-甘油-3-磷酸（αG3P）（例如¹³C类_三-αG3P源自¹³C类₆-葡萄糖）积聚在PC-敲除细胞中(图6B). 同样，脂肪酰基的合成¹³C类₅-谷氨酰胺（“偶数”图6B)通过谷氨酰胺解和Krebs循环在PC抑制的细胞中大大减弱。综上所述，这些结果表明，PC敲除通过阻断脂肪酰基成分的生物合成而不是葡萄糖衍生的甘油骨架，从而严重抑制脂质生成。这与克雷布斯循环活动减少一致(图5)，这反过来又减少了线粒体的柠檬酸盐输出，从而在细胞质中提供脂肪酸前体乙酰辅酶A。

最后，通过以下方法分析了谷胱甘肽的从头合成¹H（H）{¹³C} HSQC核磁共振。PC敲除抑制了葡萄糖和谷氨酰胺合成谷胱甘肽(补充图9，A和B). 减少从头合成导致还原型谷胱甘肽（GSH；补充图12，A和B). 同时，PC-敲除细胞积累的氧化谷胱甘肽（GSSG；补充图12，A和B)导致细胞培养和体内GSH/GSSG比率显著降低(补充图12C). 为了确定谷胱甘肽稳态的这种扰动是否会损害PC-抑制细胞处理氧化应激的能力，我们通过DCFDA荧光测定了ROS的生成。PC-敲除细胞的基础活性氧比对照细胞多70%以上（0 mM H₂O（运行）₂;补充图12D). 当细胞暴露于浓度增加的H₂O（运行）₂，敲除细胞对活性氧的淬灭能力较差，因为它们产生的活性氧比对照细胞多300%(补充图12D). 然而，N个-10 mM的乙酰半胱氨酸（NAC）不能拯救PC-敲除细胞的生长，这表明这种生长效应不仅仅与GSSG不能再生GSH有关。总之，这些结果表明，PC抑制会破坏Krebs循环的补体输入，从而降低Krebs周期的活性，同时限制A549细胞合成核苷酸、脂质和谷胱甘肽的能力。当比较shPC55转导的A549细胞与用打乱载体（shScr）转导的C549细胞的代谢时，PC敲除的这些下游效应也很明显(补充图13)这表明它们是PC击倒的目标效应。

样品制备。

将冷冻组织样品在液态N中粉碎至小于10μm的粒径₂使用Spex冷冻磨机（Spex）。从地面组织中提取极性和非极性代谢物，也会产生不溶性蛋白质残留物(21,42). 通过在2%SDS、62.5 mM Tris和1 mM DTT缓冲液中均质提取蛋白质残留物，以使用Pierce BCA方法（Thermo Fisher Scientific）测定蛋白质。

电泳、蛋白质印迹、免疫组织化学、细胞增殖和集落形成测定。

补充方法中描述了详细的方案。

shRNA敲除肺癌细胞中的PC。

NSCLC细胞系和从ATCC获得的HEK 293T细胞在含有0.45%葡萄糖和4mM谷氨酰胺的DMEM培养基中生长，培养温度为37℃，相对湿度为95%，CO为5%₂用携带病毒包装（gag、pol、rev）和包膜（VSV-G）基因的pCMV和pMD2.G载体以及含有shRNA对抗PC（shPC54或shPC55）、shEV或shScr（Mission shRNA；Sigma-Aldrich）的质粒转染HEK 293T细胞。使用的抗PC序列为：shPC54:CCGGGCCCAGTTATGGTCAGAATCTCGAGATCTCGATCCATAACTGGTTTTG；shPC55:CCGGGCCAAGGAACAACGTATCGATCTACGTACTTGTTCTCCTTGGCTTTTG。

48小时后，收集转染细胞的培养基，过滤，补充16μg/ml聚brene，并将其添加到等体积的DMEM培养基中的NSCLC细胞系中。将新鲜培养基添加到293T细胞中，24小时后，重复NSCLC细胞的转导。使用1μg/ml嘌呤霉素筛选出携带嘌呤菌素耐药基因质粒的NSCLC细胞。

细胞培养中的示踪研究。

用shEV、shScr、shPC54或shPC55转导的细胞在10 mM存在的DMEM中培养¹³C类₆-葡萄糖或2 mM¹³C类₅,¹⁵N个₂-谷氨酰胺24小时，在冷乙腈中骤冷，并在乙腈/水/氯仿（v/v 2:1.5:1）中提取，如前所述(10).

小鼠PC-敲除细胞异种移植的示踪研究。

评估PC-敲低A549细胞、6周龄雌性NOD/SCIDγ（NSG）小鼠的肿瘤生长(n个=6只小鼠/组）（杰克逊实验室）皮下注射8×10⁶含有shEV或shPC55与Matrigel（BD Biosciences）混合的细胞。每周用卡尺测量肿瘤直径3次。肿瘤大小计算为πab/4，其中a和b是最大和最小尺寸的长度。36天后，通过尾静脉向小鼠注射100μl 1.075 M[U-¹³C] -每隔15分钟葡萄糖3次。首次注射后立即在眶内采集血样，60分钟后在处死时采集血样。在液体N中闪速冷冻之前，立即切除肿瘤并称重₂。代谢物按上述方法提取(43).

体外组织切片示踪研究。

这些实验是在单个患者切除的成对肿瘤和非肿瘤肺组织的新鲜切片上进行的(26). 肺切除后，在手术室使用Weck切片机切下薄片（0.5–1 mm厚）组织。立即将这些切片放入含有DMEM和适当示踪剂（10 mM[U-¹³C] -葡萄糖或2 mM[U-¹³C中，¹⁵N] -谷氨酰胺），然后转移到CO₂培养箱设置为37°C和5%CO₂。连续摇晃烧瓶24小时，以通风，并保持组织表面的恒定营养供应，同时避免酸等废物局部堆积。然后将切片放入冷PBS中清洗，并在N液体中冷冻₂如上所述粉碎，提取极性和非极性代谢物和蛋白质，用于细胞培养。

SIRM分析。

如前所述，通过GC-MS、NMR和FT-ICR-MS分析来自细胞、患者组织和小鼠肿瘤的极性代谢物组分(10,42). 如前所述，通过FT-ICR-MS分析非极性组分的脂质(10,28).¹³计算代谢物等位异构体的C分数富集度(¹³C在不同的原子位置）和同位素（不同数量的¹³C原子）作为给定同位素或同位素的水平除以所有同位素或同位素水平的总和。通过将代谢物摩尔数归一化为可提取蛋白质含量，获得标记代谢物的绝对水平。

统计。

使用SPSS19.0（IBM-Somers）和Kaleidrograph（Synergy Software）进行统计分析。采用双尾学生配对Wilcoxon检验评估患者队列之间的差异t吨测试数值的对数（即分数差），并检查平均值、中值和模态值的分布项。PC或GLS的表达比率（CA/NC）高度非正态分布，并相应计算平均值、中位数和模态值。模态值是根据频率-相对频率直方图中的最大值估计的，因此受到箱大小的轻微影响。

使用未配对的Welch版本的t吨测试(44). 首先，在注射后的每个时间点评估其显著性。其次，所有的增长曲线都被拟合到不同的模型中，包括指数增长、幂增长和二次增长，并且最佳拟合参数和相关的标准偏差都服从Welch的t吨测试。给出良好拟合统计数据的最简单形式是一个简单的二次方程：size=a+bt吨²在这种形式中，a是初始肿瘤大小t吨=0，b为具体增长率。第三，将尸检时的肿瘤重量作为两组进行比较。shEV组和shPC组之间在增殖和代谢物方面的差异的显著性是用Welch的t吨测试。在所有分析中P（P）小于0.05的值被认为是显著的。

这项工作得到了国家科学基金会EPSCoR基础设施拨款EPS-0447479（给T.W.-M.Fan）和EPS-0132295（给R.J.Wittebort，用于18.8 T核磁共振波谱仪）的部分支持；NIH国家研究资源中心（NCRR）授予5P20RR018733（授予D.M.Miller和A.N.Lane）、1R01CA118434-01A2、1RO1CA10199-01、3R01CA18434-02S1和1R01ES022191-01（授予T.W.-M.Fan）、P01CA163223-01A1（授予A.N.Line）和1U24DK097215-01A1（给R.M.Higashi）；路易斯维尔大学CTSPGP/ARRA拨款20044；肯塔基州肺癌研究计划资助OGMB090354B1和OGMB101380（给T.W.-M.Fan和A.N.Lane）；罗伯特·W·鲁萨瓦尔（Robert W.Rounsavall Jr.）家庭基金会；以及肯塔基州卓越挑战和消除癌症运动。我们感谢谭金莲、亚历克斯·贝尔肖夫、拉迪卡·伯拉和陶旭的技术援助；Pawel Lorkiewicz帮助进行FT-ICR-MS分析；罗纳德·布伦茨（Ronald Bruntz）执行了加扰向量实验；Melissa Hall和Bridgett Curry负责临床支持。