活性依赖性基因转录对于维持长期增强(LTP)和记忆巩固(1,2). 单个树突状细胞中LTP的诱导脊椎激活的信号可以局限于受刺激的脊椎或传播在5-10μm以上的母枝晶中(三-5). 然而,这是未知的在单个树突棘启动的信号是否可以传递到细胞核调节基因转录。细胞外信号相关激酶(ERK)对受刺激脊柱和相邻树突内的信号传导(三,6,7)也用于激活细胞核中的转录因子长期有形资产(2,8-11). 因此,ERK信号可能在将信号从受激脊髓传递到细胞核中起着重要作用。
为了监测细胞核中ERK的活性,我们采用弹道转染法核靶向ERK活性报告大鼠器官型海马脑片(EKAR核子) (12)、和用2光子荧光寿命成像显微镜(2pFLIM)对CA1锥体神经元成像。EKAR的表达核子高度局限于细胞核(12). 在中使用弱EKAR表达式细胞溶质、荧光强度测量用于监测二级和三级顶端树突分支上的树突棘().
以连续方式刺激7个棘触发ERK激活核(A类)7脊椎刺激示意图。(B类)转染的神经元使用EKAR核子箭头表示7个受刺激棘的位置。(C类)谷氨酸去钙诱导脊髓sLTP的典型图像如(B)所示的神经元。(D类)荧光寿命图像EKAR公司核子在与(B)和(C) ●●●●。(E类)瞬态(1-2分钟)和持续(~70心电图中7棘刺激后sLTP的min)相核子-表达神经元以及mEGFP表达神经元。N显示在图表的底部。(F类)EKAR荧光寿命变化的时间过程核子在没有(Ctrl)或存在ERK抑制剂FR180204的情况下进行7-脊柱刺激。(G公司)40-70以上平均荧光寿命变化的量化最小值(F)。(H(H)到我)刺激7个脊椎导致增加核磷酸化-ERK水平(pERK;H)和ERK2核易位(I)。(J到L(左))药物和基因操作对细胞核的影响ERK激活(J)、sLTP公司。对40-70分钟内的平均荧光寿命变化进行了量化如所示图S5和(F)。*P(P)<0.05,无显著性差异。N=14用于控制,7用于APV和CdCl2,6用于控制和MCPG,6用于车辆和NPS 2390,7用于pCI,8用于并且对于U0124和U0126为7。误差线为SEM。
当用低频序列刺激单个脊柱时(1Hz,60s;)双光子谷氨酸开盖脉冲镁的缺乏2+脊柱体积在1-2年内迅速增加了275±18%min(瞬态),衰减到比持续超过1小时的原始音量(持续阶段)(),如预期(三-5,13). 音量增加与之类似在表达单体增强型绿色荧光蛋白(mEGFP)的神经元中诱导(). 该结构LTP(sLTP)已知脊髓与电生理LTP有关(三-5,13). 在不同的脊椎中逐个重复此协议(~60秒区间;),我们诱导了sLTP在3-5个不同的树突分支上的7个棘中依次排列(). 在7脊椎刺激后,我们观察到细胞核中ERK活性缓慢持续升高,如EKAR荧光寿命逐渐缩短(超过30分钟)核子(~-0.02 ns),保持至少40 min().ERK抑制剂FR180204(50μM)对ERK的药理抑制作用防止荧光寿命下降(). 经典上游分子Ras的抑制和MEK(14)带有显性负片Ras(dnRas)表达或MEK抑制剂U0126阻止荧光寿命降低(和图S5). 因此EKAR的荧光寿命核子担任ERK激活的可靠报告人原子核。
我们进一步证实,我们的7脊椎刺激方案激活了核ERK使用两种独立于心电图2pFLIM成像的方法核子首先,我们表演了表达mEGFP的CA1神经元磷酸化ERK的免疫染色。与EKAR公司核子结果:细胞核内磷酸化ERK水平持续升高7脊椎刺激后升高(15) (和图S1). 其次,我们在器官型切片中对mEGFP标记的ERK2进行实时成像。mEGFP-ERK2已定位在基础状态下主要向细胞质转移,但缓慢转移到细胞核7脊柱刺激后(和图S2)(8,15). 因此,核ERK是由几个脊椎。
接下来,我们确定了细胞内钙的来源2+引道标高核ERK激活。未老化诱导的Ca2+海拔高度受到很大限制并沿枝晶扩展限制在2-3μm(图S3和S4系列) (15,16). 这个当地的Ca2+海拔为主要依赖于N个-甲基-d日天冬氨酸型谷氨酸受体(NMDAR),电压敏感Ca的贡献可以忽略不计2+通道(VSCCs)、代谢型谷氨酸受体(mGluR)介导的内钙2+释放,或钙2+-渗透性α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)(图。S4F系列). 用2-氨基-5-磷酸(APV,50)抑制NMDARμM)完全阻止核ERK活化(和图。5安)以及sLTP() (13). 在对比,用CdCl阻断VSCC2(200μM)不能阻止核ERK激活(和图S5A),尽管sLTP持续期受到部分抑制(). 因此,非趋化诱导的核ERK活化不是由直接靠近细胞核的膜去极化和生成的钙2+进入通过VSCC。事实上,uEPSP记录显示,在开盖(1.5–4 mV;图。第3页). α-甲基-4-羧基苯基甘氨酸(MCPG,1 mM)或NPS 2390(20μM)减弱了核ERK的活化(和图S5,B-C). 然而,mGluRs的抑制不影响sLTP(13) (). 因此,核ERK活化的要求与钙活化的要求不同2+高程或sLTP。因为I组mGluR激活增加了二酰甘油导致蛋白激酶C(PKC)活化(17),我们进一步测试了是否需要PKC持续的核ERK激活。因为PKC抑制剂阻断sLTP(三),我们应用了PKC抑制剂双吲哚甲酰胺I(BIM,0.2μM)~60分钟后诱导核ERK活化。令人惊讶的是,BIM的延迟应用导致核ERK活性恢复到基础水平逐渐地(图S6),这表明维持核ERK活化需要持续的PKC活性。
核ERK所需突触激活的空间模式是什么激活?我们首先测试了核ERK激活需要多少突触。我们以固定密度刺激不同数量的棘(即1、3、7)(即每根1-3个棘树枝状分支,相隔10μm以上;). 谷氨酸开盖单个脊柱不能在细胞核中引起任何可检测的信号,而谷氨酸盐则不起作用3个脊髓导致核ERK活性显著升高(). 与数字的类似相关性EKAR的刺激脊髓核子近生理信号温度(34o个C)(和图S7)以及核磷酸化ERK和ERK2转位到细胞核的水平(和图S1-S2).
核ERK激活所需的空间刺激模式(A类)EKAR荧光寿命变化的时间历程核子在固定刺激密度下刺激不同数量的脊椎。在2个分离的树突分支上刺激3个脊柱。近端树枝晶(<200μm)在大多数实验中受到刺激,但在远端在一些实验中刺激了树突(<200μm)(红色)。(B类)持续荧光寿命变化的量化(平均值近端7脊椎刺激超过40-70分钟,1脊椎和3脊椎刺激30-60分钟刺激,65-75分钟用于远端7脊柱刺激)。作为阴性对照,7-spine进行无笼式谷氨酸刺激实验(W/o笼式谷氨酰胺)。N代表每个条件都显示在数据点旁边*P(P)< 0.05,***P(P)< 0.001. (C类)震级的相关性mEGFP-ERK2(黑色)和pERK在细胞核(绿色)中的核移位刺激树突棘。刺激后75分钟测量pERK水平(请参见图S1). 这个单脊椎刺激的核体比平均为55-70分钟,60-75分钟对于其他组(请参见图S2).(D类)EKAR荧光寿命变化的时间历程核子刺激位于同一分支或7个不同分支上的7个脊椎分支。(E类)持续荧光寿命变化的量化刺激不同数量的树突状分支。数据以平均值表示±扫描电镜。
在大多数实验中,我们刺激了200μm范围内的近端分支躯体。然而,当我们刺激距离胞体ERK激活在开始增加到与近端刺激引起的水平相似(). 这个缓慢的过程表明快速的生化反应钙等过程2+波浪(18)和电化学信号(2,19)不太可能成为基础通过激活一些棘诱导的核ERK激活。
接下来,我们问哪些聚集或分散的输入产生核ERK激活更有效的方法是改变受刺激脊椎的树突分支数量已居住。对单个分支上的所有7个脊椎的集群刺激未能诱导任何核ERK活性增加(). 相反,刺激3-7个棘分布在2-7个分支上导致核ERK显著激活(; 全部的P(P)< 0.05). 因此,信号多个树突状分支的整合需要诱导ERK的核激活。我们进一步研究了为什么分散刺激通过成像ERK激活更有效在树突内刺激后初级树突主干的分支点分支(图S8). ERK公司当树枝状分支内的2个棘刺激。因此,对分支的额外刺激不应导致额外的ERK初级枝晶或细胞核中的活化。
核ERK活化的时空整合范围是什么?为了解决这个问题,我们首先刺激树突分支中的2个棘,等待30min,然后刺激同一分支或另一树突分支中的另外2个棘距第一支管5-80μm(). 正如预期的那样,第一组刺激没有激活核ERK因为两个受刺激的脊椎位于同一分支上(参见). 然而,当应用于另一分支相隔30μm以上,核ERK显著增加活动(). 因此,核ERK信号可以整合超过30分钟的突触刺激我们对同一分支或附近分支(30μm内)进行了刺激未观察到核ERK活性显著增加(). 因此,通过以下方式更有效地激活核ERK刺激的空间分布模式。
不同来源ERK信号的宽范围时空整合分支(A类)EKAR的时间进程核子荧光寿命响应连续刺激树枝上的2个脊椎(绿色箭头),不会导致核ERK激活(根据预测),然后在第一次刺激30分钟后刺激另外两个脊椎(蓝色箭头)。当第二次刺激在同一分支或靠近的分支(分支间)上时距离<30μm),细胞核内ERK未激活。然而,当第二次刺激施加在与第一次刺激相隔很远的树突分支上分支(分支间距>30μm)发生显著激活。(N=同、近、远神经元分别为6、6和5个)。(B类)荧光寿命变化之间的关系[数据中70-80分钟的平均值如(A)所示]和沿一次枝晶测得的支间距离。(C类)ERK信号的量化如(B)所示(**P(P)< 0.01). 数据表示为平均值±SEM。
核ERK激活是由刺激少数树突棘引起的吗足以调节基因转录?为了解决这个问题,我们使用免疫染色测量转录因子cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和E26-样转录因子-1(Elk-1)(),因为已知这些分子通过以下途径被神经元活动激活ERK激活(14). 谷氨酸后将表达mEGFP的CA1神经元的7个棘取下,对切片进行CREB免疫染色Ser-133磷酸化()或Elk-1在Ser-383磷酸化(),所需的磷酸化位点它们的转录活性(20,21). 磷酸化CREB和Elk-1水平在45和90分钟时,未被激活的神经元比周围未被转染的神经元高开盖后(). 相反,同一切片中的mEGFP阳性、非刺激神经元磷酸化CREB和Elk-1没有增加(). 此外,CREB和Elk-1磷酸化被消除刺激前应用ERK抑制剂FR180204时(). 因此,刺激一些脊椎通过ERK调节转录因子CREB和Elk-1的活性。
转录因子被磷酸化以响应7-脊柱刺激依赖ERK的时尚(A类)磷酸化CREB(pCREB;红色)的免疫荧光图像。七刺激表达mEGFP(绿色)的神经元的脊髓,并将切片固定45刺激后min(“未老化”)。非刺激性mEGFP神经元相同的切片也显示为负控件(“Unstim”)。原子核是DAPI染色(蓝色)。在一个亚群中,pCREB的基础水平相对较高神经元可能是由于自发的回路活动(7). (B类)荧光定量用DAPI鉴定细胞核中pCREB的强度。核内的荧光mEGFP表达神经元被归一化为5个细胞核的平均荧光周围未转染神经元。未老化的神经元总是与未刺激的神经元配对同一切片中的神经元(15).神经元的数量显示在图表的底部(*P(P)< 0.05). (C类)ERK抑制剂FR180204阻断非趋化诱导的CREB磷酸化。DMSO被用作车辆控制。(D类到F类)相同作为(A)到(C),除了磷酸化Elk-1(pElk-1)而不是pCREB外,其他数据都进行了分析。数据表示为平均值±SEM。
这里,在一些(3-7)棘中诱导结构LTP导致核ERK下游转录因子CREB和Elk-1的激活和随后的调节。因为每个CA1锥体神经元大约有10000个突触,所以只有很小的一部分被激活它的突触部分(<0.1%)可以激活调节基因的核信号转录。许多研究表明,体细胞核钙2+瞬变,由体细胞去极化和钙引起2+波的传播,起着重要作用活性依赖性基因转录的调控[(19,22),审核人(23)]. 然而,在我们的在实验条件下,这种机制不太可能发挥作用。我们的sLTP诱导协议产生的钙2+高度限制在受刺激脊柱附近只有很小的体电压变化。此外,不需要激活VSCC核ERK激活。此外,缓慢的信号传输强烈表明生物化学信使从激活的突触向细胞核传递信息(10,11,24-27).因为已知Ras活性在单脊椎上扩散约10μm刺激(三),下游ERK可能由于多针刺激,进一步扩散并侵入细胞核。一致根据这个假设,我们观察到ERK2易位到细胞核,以响应刺激一些脊椎。此外,ERK激活对远端的反应树突刺激与ERK扩散速度一致(15). 考虑到原子核的大小是比普通脊柱大2000倍(2)富含磷酸酶的胞浆需要通过磷酸化ERK,其他机制,如PKC-ERK正反馈环和物理需要保护才能帮助长距离、持续的突触-核ERK信号(27,28).
诱导核ERK激活的长距离时空整合可能对树突输入的功能组织具有重要意义。许多研究表明,突触增强往往以空间聚集的方式发生(29-31),由于内部的电气集成和生化串扰枝晶短伸长(32-35). 然而,因为增强的突触会在周围招募更强的局部膜去极化和生化信号区域,这种机制可能导致一个树突分支中的增强突触(36). 空间分散有效诱导的核信号输入可能对平衡在一个分支和发展突触重量的平衡空间分布。