PD-1/SHP-2抑制肿瘤微环境中Tc1/Th1表型反应和T细胞活化

收集外周血单个核细胞（PBMC）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）

将来自HNSCC患者的静脉血抽取到肝素化管中，并在Ficoll-Hypaque梯度上离心（GE Healthcare Life Sciences，Piscataway，NJ）。回收PBMC，在RPMI-1640培养基（西格玛，圣路易斯，密苏里州）中清洗，并立即用于实验，或在含有10%二甲基亚砜的冷冻培养基中再次悬浮，转移到弗罗斯蒂先生容器（马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Scientific）中，并在−80°C下保存，直到流式细胞仪分析。对于TIL分离，将来自HNSCC患者的新鲜肿瘤手动或使用gentleMACS分离器（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）切成小块，然后转移到70μm细胞过滤器（BD）中，并使用5-mL注射器的柱塞进行机械分离。收集通过细胞过滤器的细胞，并进行Ficoll-Hypaque梯度离心。离心后，回收单核细胞并将其储存在−80°C下，直至流式细胞仪分析或立即用于实验。

抗体和流式细胞术

以下抗人抗体用于染色：CD3-Alexa Fluor 700、FOXP3-PerCP/Cy5.5、phospho-STAT1（pY701）-PE、phosphal-STAT4（pY693）-Alexa Fluxor 488和T-bet-BV711，购自BD Biosciences（加州圣何塞）、CD3-PE-Cy7、PD-1-PerCP/Cy 5.5和CD25-PE-Cy7，购自Biolegend（加州圣地亚哥）、CD8-PE-TR、，CD4-PE-TR购自Life Technologies（加利福尼亚州卡尔斯巴德）、PD-1-APC（克隆号：MIH-4，eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥）、phospho-S6（Ser235/236）-Alexa Fluor 488（Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯）、SH-PTP2（C-18）（德克萨斯州达拉斯圣克鲁斯生物技术）和APC-conjugated F（ab'）₂山羊抗兔IgG片段（宾夕法尼亚州西格罗夫Jackson ImmunoResearch）。FOXP3、SHP-2、p-STAT1、T-bet、p-STAT4和p-S6的细胞内染色如下：PBMC或TIL用表面标记抗体染色，用固定/渗透缓冲液（eBioscience）固定，洗涤，并在1X渗透缓冲液中染色细胞内抗原。在LSRFortessa（BD）或CyAn（Dako，Ft.Collins，CO）流式细胞仪上分析细胞，并分别使用flow Jo（Treestar，Ashland，or）或Summit V4.3软件（Dako）分析数据。基于正向和侧向散射中细胞的特征特性，采集和分析门仅限于淋巴细胞门。根据活性染料染色（僵尸水固定活性染料，Biolegend）排除死细胞。

免疫组织化学（IHC）

将福尔马林固定石蜡包埋组织切片在二甲苯和分级乙醇溶液中脱蜡和脱水。在Tris-EDTA缓冲液中进行抗原检索。根据Ventana Benchmark Ultra平台上的标准方案进行免疫过氧化物酶染色。PD-L1抗体由Dana Farber癌症研究所的Gordon Freeman博士提供。PD-1用单克隆抗体NAT105以1:500滴定法染色。IFN-γ抗体购自Abcam（马萨诸塞州剑桥），并在1:500滴定条件下培养。口腔颌面病理学家对染色进行了解释。评估染色强度和染色面积百分比。匹配区域的代表性照片拍摄于400×。

使用抗CD3/-CD28/hIgG1或抗CD3/-CD28/PD-L1珠对TIL的再刺激

LEAF纯化的抗人CD3（克隆UCHT1，Biolegend）、LEAF提纯的抗人CD28（克隆CD28.2，Biolenged）加上PD-L1-hIgG1-Fc融合蛋白（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统）或对照人IgG1（阿拉巴马州伯明翰Southern Biotech）根据制造商协议（生命技术），与Dynabeads M-450环氧树脂珠共价偶联。我们将蛋白质总量保持在5μg/10⁷如前所述的珠子(20). 一般来说，10⁷珠涂有1μg抗CD3（占总蛋白的20%）、1μg抗CD28和60%PD-L1-hIGg1-Fc融合蛋白或对照人IgG1。蛋白质与珠的共价偶联在0.1M磷酸钠缓冲液中进行，在室温下进行24小时，轻轻倾斜和旋转。

TIL是从肿瘤标本中新鲜分离出来的，并进行再刺激实验。总TIL以1:10的固定细胞/珠比与珠培养。简言之，0.5×10⁶在含有100μg/mL抗PD-1（BMS-936558）或Bristol-Myers Squibb提供的hIgG4同型对照品或50μM镰刀菌苷的200μL RPMI-1640完整培养基中，将TIL接种在96 well U形底部组织培养板中，并在其中加入珠子(6)如图所示。在37°C下与5%CO孵育48小时后₂收集上清液，对细胞进行染色并进行流式细胞仪分析。

西部印记

使用磷酸化-SHP-2（Tyr580）抗体（马萨诸塞州丹弗斯市细胞信号技术）、SH-PTP2抗体（C-18）（德克萨斯州达拉斯市圣克鲁斯生物技术）和单克隆抗β-肌动蛋白抗体（密苏里州圣路易斯市西格玛）进行Western blot。

Luminex分析

使用人类磁性细胞因子/趋化因子面板6复合试剂盒（Millipore，Billerica，MA）测试TIL培养上清中的IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5和IL-10水平，并由UPCI Luminex核心设施进行分析。

PD-1抑制TCR刺激的p-STAT1、T-bet和p-S6上调

尽管PD-L1是PD-1的主要配体，但它在HNSCC肿瘤细胞上的表达是可变的和异质的(4和补充图1)，我们观察到PD-1的共定位⁺TIL与PD-L1⁺肿瘤微环境中的体内肿瘤细胞(图3)表明PD-1抑制信号在肿瘤浸润性T细胞中具有相关性和功能性。在证明Tc1/Th1反应受损和TIL激活后，我们研究了PD-1信号是否可以直接调节肿瘤微环境中Th1表型的重要调节因子p-STAT1和T-bet。为了探索这种可能性，我们制备了抗CD3/-CD28/PD-L1或抗CD3/-CD28/hIgG1（对照抗体）涂层珠。在存在或不存在抗PD-1阻断剂（BMS-936558）的情况下，用这些珠刺激从HNSCC患者分离的总TIL。有趣的是，与用抗CD3/-CD28/hIgG1珠刺激相比，高表达PD-1的TIL在用抗CD3/4-CD28/PD-L1珠刺激时表现出更低的p-STAT1和T-bet。这一结果表明，与多价PD-L1连接的PD-1抑制了TCR刺激引起的p-STAT1和T-bet的上调。此外，抗PD-1阻断剂可以恢复抗CD3/-CD28/PD-L1微球刺激的TIL中p-STAT1和T-bet的表达(图4A-C，p=0.02和补充图2A-B)这表明，使用临床有效的阻断单克隆抗体抑制PD-1信号可以逆转PD-1对Th1表型反应的抑制作用。然而，抗PD-1阻断并没有增加用抗CD3/-CD28/hIgG1（同型控制单克隆抗体）珠刺激的TIL中p-STAT1或T-bet的表达。

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图3

产品开发-1⁺TIL与PD-L1共同本地化⁺肿瘤微环境中的HNSCC细胞

进行H&E（左面板）和PD-1/PD-L1双重免疫过氧化物酶染色（右面板），显示5例（n=5）肿瘤的典型匹配区域。PD-1阳性淋巴细胞被标记为红色色原，PD-L1阳性HNSCC细胞被标记为棕色色原。在200倍的条件下拍摄图像。

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图4

用涂珠PD-L1结扎PD-1可抑制TCR刺激时p-STAT1、T-bet、p-S6和Th1细胞因子的产生，而阻断PD-1抗体可逆转PD-1的抑制作用

在100ug/mL hIgG4或抗PD-1（BMS-936558）存在下，用抗CD3/-CD28/hIgG1或抗CD3/-CD28/PD-L1包衣珠（珠：细胞=10:1）刺激总TIL 48h，然后用流式细胞仪分析p-STAT1、T-bet和p-S6。收集每个条件下的上清液，并将其储存在−80°C下。Luminex测定上清液中的Th1（IFN-γ和IL-2）和Th2（IL-10）细胞因子。A） 显示CD8中p-STAT1（Y701）、T-bet和p-S6（S235/236）水平的代表性数据⁺TIL在所述条件下。CD8中p-STAT1（Y701）+（B）、T-bet+（C）和p-S6（S235/236）+（D）的频率汇总数据⁺和CD4⁺显示了具有指示条件的TIL（n=7）。E） 显示了在指定条件下培养的TIL上清液中IFN-γ、IL-2和IL-10数量的汇总数据。图表显示了8名HNSCC患者的平均±SEM。F） 典型HNSCC肿瘤连续切片中PD-1和IFN-γ的免疫组化分析。通过Wilcoxon（非参数配对）检验确定统计显著性*p<0.05，**p<0.01。p> 0.05被视为不显著（n.s.）。

接下来，我们研究了PD-1信号是否干扰TCR激活下游的信号。令人感兴趣的是，可以通过TCR信号上调的p-S6通过使用PD-L1包被的珠连接PD-1而降低。因此，抗PD-1抗体（BMS-936558）对PD-1的阻断恢复了p-S6的上调(图4A和D，p=0.02和补充图2C). 这些发现表明，PD-1信号传导干扰TCR刺激诱导的下游T细胞激活分子（如p-S6）的激活，促进肿瘤微环境中T细胞的功能障碍。

经TCR刺激后，PD-1抑制TIL分泌Th1细胞因子，但不抑制Th2细胞因子

由于我们观察到PD-1可以抑制p-STAT1和T-bet，转录因子调节CD8产生Th1细胞因子⁺和CD4⁺T细胞，我们接下来研究TCR刺激时Th1细胞因子的产生是否受到PD-1结扎或抗PD-1阻断的影响。Luminex分析与抗CD3/-CD28/hIgG1或抗CD3/-CD28/PD-L1珠培养48小时的TIL上清液（有或没有抗PD-1阻断剂（BMS-936558））分泌Th1/Th2细胞因子的情况。正如预期的那样，与抗CD3/-CD28/hIgG1刺激的TIL相比，抗CD3/-CD28/PD-L1刺激TIL中Th1细胞因子IFN-γ（p=0.008）、TNF-α（数据未显示）和IL-2（p=0.02，p=0.04）的分泌较低，而PD-1阻断抗体可以逆转PD-1:PD-L1结扎的抑制作用。PD-1结扎或PD-1阻断不会改变Th2细胞因子IL-10的产生(图4E). 为了验证我们在体内的体外发现，我们在原始肿瘤组织的连续切片中对PD-1和IFN-γ进行了免疫组织化学分析。当PD-1在TIL上的表达较高时，肿瘤微环境中IFN-γ的数量较低（肿瘤1），反之亦然（肿瘤2，图4F). 综上所述，这些发现表明PD-1信号通过抑制p-STAT1和T-bet的激活以及Th1细胞因子的分泌来负向调节Tc1/Th1反应。

SHP-2在TIL中过度表达，并与PD-1表达密切相关

配体结合后，PD-1和TCR聚集，并能将SHP-2招募到其免疫受体酪氨酸基开关基序（ITSM），其中SHP-2被磷酸化(22). SHP-2被认为是PD-1抑制信号的介体(23,24). 由于PD-1在TIL中高度表达(22,24)我们检测了SHP-2本身的表达是否与HNSCC患者TIL上PD-1的表达相关。采用流式细胞术检测HNSCC患者配对PBL和TIL中SHP-2的表达。虽然SHP-2在T细胞中广泛表达，但与PBL相比，TIL中SHP-2的MFI显著升高(图5A，CD8，CD4：p=0.002）。此外，PD-1中SHP-2的MFI更高⁺TIL比PD-1中的TIL⁻直到(图5B，CD8，CD4:p=0.002）。我们还观察到HNSCC患者肿瘤浸润T细胞中SHP-2的表达水平与PD-1的表达呈正相关(图5C，右²=0.8643，p=0.02）。总之，这些观察强烈表明SHP-2的表达与PD-1的表达相关，尤其是在肿瘤部位。

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图5

SHP-2在TIL中过度表达并与PD-1相关⁺表达

采用流式细胞术检测10例HNSCC患者TIL和配对PBL中SHP-2的表达水平。A） 显示CD8中SHP-2 MFI的代表图（上部面板）和汇总数据（下部面板）⁺和CD4⁺TIL与PBL.B比较）代表图（上部面板）和汇总数据（下部面板）显示PD-1中SHP-2的MFI⁻和PD-1⁺CD8（CD8）⁺和CD4⁺TIL公司。通过Wilcoxon（非参数配对）检验确定统计显著性**p<0.01。C） 5例HNSCC患者肿瘤浸润T细胞中PD-1和SHP-2的表达水平（以MFI显示）。

PD-L1抗体是Dana-Farber癌症研究所Gordon Freeman博士慷慨赠送的礼物。我们感谢Tan Renxiang博士（中国南京大学）生成并提供福寿糖苷(25)杨孙博士、徐强（中国南京大学）和刘刚（中国清华大学）也给予了慷慨的帮助。

由NIH拨款R01 DE019727和P50CA097190支持。该项目使用了UPCI癌症生物标记设施：Luminex核心实验室和流式细胞仪设施，该设施部分由P30 CA047904奖支持。李晶得到了中国奖学金委员会的支持。Yu Lei由T32 CA060397（至R.L.F.）和NIH K99 DE024173提供支持。