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分子系统生物学。2014年8月；10(8): 744.
2014年8月1日在线发布。 数字对象标识：10.15252/msb.20134993年
预防性维修识别码：项目经理4299514
PMID：25086087

Warburg效应的计算研究确定了抑制代谢的靶点癌症迁移

克伦·伊扎克,1,*† Sylvia E Le Dévédec公司,2,† 瓦西利基·玛丽亚·罗格科蒂,2 弗兰齐斯卡·巴恩克,三 文森特·德波尔,4 克里斯蒂安·弗雷扎,5 阿尔穆特·舒尔茨,三 鲍勃·范德沃特,2,‡和伊坦·鲁宾1,6,‡**
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补充资料

摘要

在过去的十年中，癌症代谢领域主要集中于研究致癌代谢重组支持癌症增殖。在这里，我们执行第一个癌症迁移代谢基础的基因组尺度计算研究。我们建造捕获Warburg效应（需氧）的NCI-60细胞系的基因组代谢模型糖酵解）通常发生在癌细胞中。每一种情况下的Warburg效应的程度细胞系模型通过糖酵解与氧化ATP通量（AFR）的比值进行量化，该比值为发现与癌细胞迁移高度正相关。因此，我们预测靶向通过降低AFR来缓解Warburg效应的基因可能会特异性抑制癌症迁移。通过测试沉默这17个顶级预测基因的抗迁移效应乳腺癌和肺癌细胞株中，我们发现多达13种新的预测结果显著在所有细胞系或仅在一个细胞系中减弱细胞迁移，而对细胞几乎没有影响增殖。此外，根据预测，观察到显著减少在这些扰动之后，实验测量的ECAR和OCR水平之间的比率。抑制抗迁移靶点是未来治疗癌症的一条有希望的途径，因为它可能减少困扰当前抗增殖治疗的细胞毒性相关副作用。此外，它可以减少对侵袭性更强的癌细胞的细胞毒性相关克隆选择出现阻力的可能性。

关键词：癌细胞迁移、细胞代谢、基因组尺度代谢建模

介绍

肿瘤代谢改变已成为公认的癌症标志（哈纳汉&温伯格，2011). 最初认识到新陈代谢是癌症的改变可以追溯到Otto Warburg的早期研究，表明转化细胞以异常高的速度消耗葡萄糖，并将其大量还原为乳酸，甚至在氧气存在下（Warburg，1956). 在过去十年来，癌症代谢领域的大部分研究都集中在Warburg效应在支持癌症增殖（范德海登等,2009). 然而，这一过程在支持其他基本癌症方面的作用细胞迁移等表型受到的关注要少得多。

当代的细胞毒癌症治疗主要基于抑制增殖的药物细胞通常是非选择性的，因此伴随着许多不良的副作用。药物能够抑制迁移但相对不影响细胞增殖的靶点可能能够避免此类副作用。这些目标可能还有其他好处，可以减少对由于消除了对治疗敏感的细胞，出现了更具耐药性的克隆。不断增长的一系列癌细胞高通量测量的可用性为研究许多不同癌症中代谢失调的更广泛范围。在这里，我们的目标是将相关数据与人类代谢的基因组尺度机制模型相结合，以研究Warburg效应在肿瘤进展中的作用及其与细胞的潜在联系迁移。

基因组规模的代谢建模是一种越来越广泛使用的计算框架研究新陈代谢。给定物种的基因组尺度代谢模型（GSMM）以及上下文如生长介质和“经济学”数据等信息，可以获得相当准确的多种代谢表型的预测，包括生长速率、养分吸收速率、基因重要性等（隐蔽等,2004).GSMM已用于各种应用（Oberhardt等,2009; Chandrasekaran和Price，2010; Jensen&Papin，2010; 绍保诺什等,2011; 韦塞利等,2011; 列尔曼等,2012; 诺盖尔斯等,2012;舒埃茨等,2012)包括毒品发现（Trawick&Schilling，2006; 奥伯哈特等,2013; 伊扎克等,2013)和代谢工程（伯格et（等）铝,2003; 马尔基亚等,2004). 在过去几年中，GSMM已被成功使用用于模拟人类新陈代谢（Duarte等,2007; 妈妈等,2007;什洛米等,2008; 吉勒et（等）铝,2010; 刘易斯等,2010; 马尔迪诺格鲁等,2013). 具体来说，已经重建了癌细胞的GSMM模型用于预测选择性药物靶点，以及研究肿瘤抑制剂的作用和氧化应激（Folger等,2011;弗雷扎等,2011; 阿格伦et（等）铝,2012,2014;杰比等,2012; 戈尔茨坦et（等）铝,2013; 加托等,2014). 在研究Warburg效应的背景下人类代谢模型不能预测最大生物产量下的强迫乳酸分泌速率，即使氧气消耗速率为零。这使得它不适合研究正如（Shlomi）已经指出的那样，沃堡效应等,2011). 虽然增加了溶剂容量限制原则上克服这个障碍（Shlomi等,2011)，此添加需要酶动力学数据，但在基因组规模。

在这项研究中，我们利用单独定制的单个基因组代谢模型NCI-60癌细胞系研究Warburg效应在支持癌细胞中的作用迁移能力。我们首先根据现有和新的模型测试和验证单个模型生物能量实验数据。然后，我们检查了华伯格效应在通过量化糖酵解与氧化ATP通量比（AFR），获得癌细胞株。我们发现AFR与癌细胞迁移高度正相关，强调了糖酵解通量支持肿瘤发展中更具侵袭性的转移阶段。收件人确定AFR水平和细胞迁移之间是否存在因果关系，我们预测基因沉默会降低这个比率。然后进一步过滤这些潜在目标以排除这些预计会导致细胞死亡。令人放心的是，预测的目标是在转移性和高级别乳腺癌肿瘤中显著更高表达。实验通过siRNA-介导的击倒对顶级预测靶点的研究表明其中一部分能够真正减弱癌细胞的迁移，而不会产生致命的影响。此外，根据预测，ECAR之间的比率显著降低这些基因沉默扰动后的OCR水平。

结果

化学计量和通量容量约束成功捕获了高电池的耦合单个NCI-60肿瘤模型的乳酸分泌增殖率

作为这项研究的起点，我们开发了一套针对每种药物的代谢模型NCI-60细胞系。我们使用我们最近开发的一种新算法来构建这些模型PRIME，用于根据相关组学数据构建单个细胞模型（Yizhaket（等）铝，已提交，补充信息和补充图S1). PRIME使用通用人体模型作为支架并设置根据在每个靶细胞系中相应催化酶的表达水平。

癌细胞的一个重要特征是通过Warburg效应产生乳酸（沃堡，1956). 作为验证基本NCI-60模型的功能，我们评估了生物量最大化是否会促进乳酸的产生，这将意味着生物量生产与乳酸输出的适当耦合，就像癌症一样细胞。我们发现，在生物量最大化的情况下，模型确实必须分泌乳酸（补充信息和补充图S2系列). 因此，与人类新陈代谢的原始通用模型相比，它们使我们能够系统评估乳酸分泌的程度，并研究广泛的Warburg效应无需添加（大多未知）溶剂容量限制的癌细胞系范围，从而在基因组水平上确定其功能相关性。

生物能量学预测容量与实验测量容量的比较

我们将所有细胞系的预测乳酸分泌率与测量值进行了比较Jain实验等（耆那教等,2012)，获得中等但显著的相关性（Spearman相关性R（右）= 0.36,P（P）-值=5.7e−3，图​图1A，1A、 材料和方法）。为了进一步测试模型在不同的环境条件下，我们测量了四个乳腺癌细胞系T47D、MCF7、BT549和Hs578T(补充数据集S1)在常压和缺氧条件下（参见材料和方法）。利用NCI-60集合中相应的细胞系模型，我们发现两种情况下乳酸分泌水平的测量值和预测值之间的高度相关性（斯皮尔曼相关R（右）= 0.95,P（P）-价值=1.1e−3，图​图11B） ●●●●。

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实验与预测的比较生物信息学的测量不同癌细胞株的乳酸分泌（或ECAR）和OCR
  1. Jain现有59个细胞系的乳酸分泌率测量值与预测值等(2012).
  2. 低氧（红色）和常氧（蓝色）条件下测定的乳酸分泌率与预测的乳酸分泌速率用于四种乳腺癌细胞系：T47D、MCF7、BT549和Hs578T。条形图表示测量值乳酸分泌率和线代表相应的预测速率。误差线代表SD；实验数据的样本数（巴）为n个= 7;预测数据的样本数（行）为n个= 1000.
  3. 抑制扰动后A549和H460细胞系模型预测ECAR和OCR在糖酵解途径中。模型预测显示ECAR（红线）下降而增加OCR（蓝线）。实验发现，H460细胞的OCR增长预测值低于为A549细胞发现的。这个x-轴表示施加的抑制水平，从零开始到最大抑制（材料和方法）。特定扰动包括抑制己糖激酶2的3BpRA；抑制酶的碘乙酸盐甘油-3-磷酸脱氢酶；抑制酶烯醇化酶的氟化物；和Oxamate抑制乳酸脱氢酶。

细胞中糖酵解能力与氧化能力的比率可以使用其细胞外酸化率（ECAR，乳酸分泌的代表）及其耗氧量速率（OCR）。为了进一步研究我们的细胞系模型捕获Warburg相关数据的能力我们利用测量的ECAR和OCR水平来响应基因扰动对两个NCI-60肺癌细胞系（A549和H460）进行扰动，并将结果与我们的模型预测（材料和方法）（吴等,2007). 定性相似的ECAR和OCR变化见对糖酵解途径中各种酶扰动的反应。具体而言糖酵解抑制导致两种细胞的ECAR降低和OCR升高，而在所有糖酵解抑制剂作用后观察到H460细胞的最大细胞呼吸增加低于A549细胞的相应增加（图​（图11C） ●●●●。

量化Warburg效应及其与扩散和迁移的关系NCI-60细胞系

ECAR和OCR是实验定量生物能量的常用方法细胞的容量以及由此产生的Warburg效应，GSMMs的全基因组范围使我们能够同时检查其他假定措施。我们研究的一个有希望的此类指标是糖酵解中的ATP通量速率与OXPHOS（AFR）中的ATP流速。显然，AFR值较高表示更多的“Warburgian”细胞系，反之亦然。我们新AFR指标的比较与上述最先进的ECAR/OCR比（EOR）（材料和方法以及补充数据集S3)显示出显著的NCI-60模型之间的相关性（Spearman相关性R（右）= 0.66,P（P）-值=2e−8）。使用全基因组NCI-60测试这两项指标药物反应数据集（谢尔夫等,2000),我们发现所有细胞系模型中的模型预测野生型AFR水平显著相关（斯皮尔曼P（P）-值<0.05；用α校正的FDR=0.05），这些细胞系中30%的化合物的Gi50值（经验性P（P）-值<9.9e−4），而模型预测的EOR测量完成这项任务只针对19%的化合物（材料和方法）。有趣的是，我们发现在30%AFR-Gi50相关化合物中，97%为正相关，这表明“Warburgian”细胞系反应性更强，因此需要更高剂量的化合物来抑制其生长。大多数这些化合物的作用是也与细胞的生长速度呈负相关，表明细胞缓慢增殖细胞对治疗有更强的抵抗力（之前针对靶向化合物的研究也显示了类似的结果细胞生长（Penault-Llorca等,2009;文森特·沙龙等,2004)).有趣的是，该数据集中对许多化合物的反应与AFR测量与细胞生长速度无关。133种此类化合物已确定(补充数据集S4),可能表明其机制可能与细胞的Warburg水平有关，而不是而不是扩散。最后，预测的AFR值在上皮细胞和间充质乳腺癌细胞系（表现为侵袭性更强的间充质细胞系更大的Warburg效应（Sarrio等,2008),图​图2A）。2A） ●●●●。AFR再一次更能预测这一点实验观察比EOR(补充数据集S3).

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AFR水平与细胞增殖和迁移的关系
  1. 预计20个细胞株表现出最大/最小程度的Warburg效应根据AFR测量。这个x-轴和年-轴表示糖酵解和OXPHOS中归一化ATP通量速率的平均值和标准差（材料和方法）。AFR测量正确区分间充质细胞（橙色）和上皮细胞系（绿色），表明前者（已知更具攻击性）具有更高的AFR水平。
  2. 我们使用活细胞分析了一组六种乳腺癌细胞系的迁移能力成像。六种细胞系的差分干涉对比度（DIC）图像各自的迁移速度（从低到高），比例尺为100μm（材料和方法）。
  3. 细胞在完全培养基中的平均迁移速度为12h。误差条表示扫描电镜；样本数量介于n个=100和n个= 200.
  4. 基于预测模型的EOR和AFR指标与增长率和迁移率的相关性实验测量。这两个指标都与增长呈负相关与迁移率的相关性。重大成果(P（P）-值<0.05）为用星号标记。

接下来，我们转向了我们的主要目标，即检查Warburg效应与肿瘤增殖和迁移。为此，我们通过实验测量了6株NCI-60乳腺癌细胞系（图​（图2B2B和C，材料和方法，补充图S3、和补充数据集S3)并被利用这些细胞系的公开测量生长率。AFR显著相关与细胞生长率呈负相关（Spearman相关性R（右）= −0.55,P（P）-值=4.53e−6，图​图2D2D和补充表S1)，甚至相关与癌细胞迁移呈正相关（Spearman相关性R（右）= 0.88,P（P）-值=0.03，图​图2D2D和补充表S1（第一阶段）). 控制细胞系的测量生长率，此相关性变为甚至更显著（Spearman部分相关性R（右）= 0.96,P（P）-值=7e−3，补充表S1). 总的来说，这一发现表明糖酵解通量与迁移而非生长，而OXPHOS通量表现出相反的行为。A类似最近在一项实验中发现乳酸分泌与生长速度之间的关系Jain的研究等（耆那教等,2012)整个NCI-60收集（Spearman相关性R（右）= −0.22,P（P）= 0.09). 此外，以前的研究表明高浓度的乳酸与远处转移的高发生率相关（赫施豪斯等,2011). 总体这些相关性描述的情况是，当糖酵解碳转向生物合成时途径可能支持细胞增殖，非转移糖酵解碳支持细胞迁移和转移(补充图S4).

预测逆转AFR从而可能抑制癌症迁移的药物靶点

AFR水平和疾病严重程度之间的一致性使我们不禁要问，我们是否可以在此基础上再接再厉确定潜在新药靶点的协会。我们搜索了预计会减少的药物靶点通过模拟NCI-60模型中每种代谢反应的淘汰来确定AFR比率，以及检测敲除物对生物量生产、乳酸分泌和AFR的影响。作为乳酸分泌是Warburg效应的基本指标，我们首先确定了一组113个预测敲除可消除所有癌细胞系中乳酸分泌率的反应生物质最大化。有趣的是，催化这些反应的一组酶是NCI-60细胞系中的表达显著高于背景代谢基因（单侧WilcoxonP（P）-值<1.6e−8），表示电势这些基因的致癌性。

为了避免选择耐药克隆，开发能够降低癌细胞的毒性，但避免杀死它们。113投12中的淘汰赛乳酸还原反应降低了AFR，但相对地节省了生物量生产（材料和方法和补充表S2).重要的是，根据健康淋巴母细胞模型对这12种反应的剔除由PRIME（蔡等,2008)也包括备件他们的生物质生产（材料和方法）。此外，我们发现没有淋巴母细胞细胞系显示了癌细胞中所观察到的强迫乳酸分泌。而Warburg在文献中，这种效应有时被称为发生在一般来说，我们的分析发现，这种现象在癌细胞中更为明显至少在这里研究的淋巴母细胞群方面。

预测基因靶点的最终列表包括17种与最后12个反应，包括糖酵解、丝氨酸和蛋氨酸代谢（图​（图3A）。三A） ●●●●。10个预测目标显著高于转移性与非转移性乳腺癌患者的表达水平（Changet（等）铝,2005)（单边威尔科克森P（P）-值<0.05，图​图3B）。三B） ●●●●。此外，9在预测的靶点中，3级肿瘤的表达水平高于1级肿瘤（米勒等,2005)（单边威尔科克森P（P）-值<0.05，图​图3C）。三C） ●●●●。最后，9个预测靶点的低表达与改善长期生存（柯蒂斯等,2012)（对数秩P（P）-值<0.05，图​图3D），证明三D） ，证明了它们作为治疗靶点的潜在作用。全部P（P）-值为使用FDR校正多重假设，α=0.05。

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预测降低AFR的基因靶点及其与预后的关系乳腺癌患者的标志物
  1. 12个预测基因靶点的示意图，用红色标记。
  2. 10个预测靶点在转移性肿瘤中的表达显著高于非转移性肿瘤样本(n个= 295).
  3. 9个预测目标在3年级的表达明显高于1年级肿瘤样本(n个= 236).
  4. 九个预测靶点，其低表达与长期改善显著相关生存(n个= 1568).

siRNA-介导的基因敲除实验检测预测靶点

为了实验验证我们的预测，我们沉默了17个预测的AFR减少基因检测了它们在MDA-MB-231、MDA-MB-435、BT549和A549细胞系中的表型效应。使用Dharmacon的SmartPools进行敲除实验，使用活细胞迁移和固定增殖分析（材料和方法）。17种酶中有8-13种（8-10种在12种代谢反应中，发现它们显著降低了每个细胞的迁移速度线（双面t吨-测试P（P）-值<0.05，FDR用α=0.05，图​图4，4、材料和方法以及补充数据集S5). 这个结果是高度显著，因为只有17%的代谢基因被发现影响细胞迁移190个代谢基因的siRNA筛选（Fokkelman M，Rogkoti VM等，未发布数据，伯努利P（P）-值在3.9e−3和1.18e−7范围内）。值得注意的是，预测靶基因表达与测量迁移之间的关联速度对于除一个以外的所有目标来说都是微不足道的，这证明了基于模型的固有价值预测分析(补充表第3章). 还应注意，烯醇化酶基因的三个剪接的敲除可能是同工酶的作用，对这些细胞的迁移速度几乎没有显著影响备份机制。重要的是，大多数基因敲除实验都没有发现对细胞增殖有显著影响（图​（图4）。4). 在根据Simpson的调查结果等（辛普森等,2008)，我们发现迁移速度和增殖率的降低大多微不足道(补充数据集S5)，表明观察到的迁移减少不仅仅是阻碍扩散的常见机制的结果，而是由于不同的迁移相关代谢的中断路径。

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标准化以控制预测的每个SmartPool基因沉默的平均速度目标
  • A–D所分析的四种不同细胞系：MDA-MB-231、MDA-MB-435s、BT549和A549.显著成果（双边t吨-测试，P（P）-值<0.05使用α=0.05的FDR修正多重假设后）标记为星号。使用两种不同的对照：（1）非靶向siRNA（=阴性对照）；和（2） 已知能阻止迁移和增殖的阳性对照DNM2（Ezratty等,2005). 左侧面板显示迁移速度和右侧面板显示核数。误差条代表SD；样本数量为n个= 3.

选择性基因沉默后的ECAR和OCR水平

为了进一步研究AFR水平降低与细胞迁移受损之间的关系，我们使用Seahorse XF96细胞外通量分析仪，用于测量MDA-MB-231中的ECAR和OCR通量细胞系，在敲低选定的一组靶标后（材料和方法以及补充图S6). 由于AFR测量非常很难通过实验测量，我们测试了传统测量的EOR（ECAR/OCR）代理。我们重点研究了七个基因的子集（图​（图5）5)谁的据预测，敲除对细胞迁移的影响最大，并且跨越了所有三种预测代谢途径。如图所示​图5，5，显著提高采收率与对照组相比，所有七个检测基因（双侧t吨-测试P（P）-值<0.05，用α校正FDR=0.05，材料和方法补充的表S4). 四种糖酵解基因的沉默(香港2号,PGAM1型,PGK2系列、和GAPDH公司)结果两者都减少了ECAR和OCR水平增加，而丝氨酸和蛋氨酸相关基因沉默(PSPH公司,AHCY公司、和PHGDH公司)结果减少仅ECAR（图​（图5A）。5A） ●●●●。此外，匹配显著实验测量的EOR水平在最低和最高之间存在差异AFR减少基因（单侧WilcoxonP（P）-值=0.05）。总体而言我们的结果证明，正如预测的那样，敲除排名靠前的基因会导致伴随EOR和AFR水平降低的细胞迁移减弱。

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最高预测基因靶点的ECAR和OCR水平
  1. 七种不同基因沉默后ECAR和OCR水平的平均值和SEM（归一化为核数）基因(香港2号,PGAM1型,PGK公司2,GAPDH公司,PSPH公司,AHCY公司、和PHGDH公司)与对照组相比。四个糖酵解基因的沉默导致ECAR水平降低(x-轴）和OCR级别的增加(年-轴），而丝氨酸-蛋氨酸相关基因仅显示ECAR水平下降。误差条代表SEM样本数量为n个= 18.
  2. 对照和选定基因沉默的计算ECAR/OCR（EOR）水平的平均值和SD（材料和方法）。对于所有基因，观察到EOR水平显著降低。误差条表示SD。样本数量为n个= 18.

讨论

在本研究中，我们探讨了Warburg效应在支持肿瘤迁移中的作用除了最近关注其在协助癌症扩散中的作用的调查之外。基于模型跨癌细胞系的研究表明，糖酵解和氧化ATP之间的比率流量率与癌症迁移行为显著相关。基因沉默干扰预测会降低这一比例，事实上发现会减弱细胞迁移，结果是ECAR显著降低至OCR水平。值得注意的是，我们的建模方法依赖于基因细胞之间的表达差异并没有考虑特定的摄取率。它是因此，更适合捕捉两者之间的定性差异，而不是精确的定量差异如本文所示。此外，我们的分析主要集中在在没有特定摄取率的扰动模拟中。尽管如此，利用这种摄取测量可以显著增加与测量值的相关性乳酸率（斯皮尔曼相关R（右）= 0.67,P（P）-价值=1.5e−8），表明摄动状态下的摄取率测量可以显著提高了模型的预测能力。

我们的AFR测量在概念上类似于之前由库兹瓦语等（库兹瓦语等,2002). 在该研究中，糖酵解酶的表达甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）和ATP合成酶β-催化亚基研究发现，BEC指数的形成对评估早期结直肠癌患者。AFR测量值和BEC指数（根据其相应的RNA水平）显著相关（斯皮尔曼R（右）=0.58,P（P）-值=1.6e−6）跨NCI-60细胞系和BEC该指数与六种乳腺癌细胞系的迁移速度密切相关（斯皮尔曼R（右）= 1,P（P）-值=2.8e−3）。然而，BEC指数在预测药物反应方面表现不佳(补充表S1).

糖酵解活性增强在癌细胞迁移中起关键作用的发现也是与德博克最近的一项研究一致等，表明糖酵解是内皮细胞ATP生成的主要来源以及糖酵解的沉默调节因子PFKFB3削弱细胞迁移能力并干扰血管萌芽（De Bock等,2013). 此外，静音PFKFB3被证明抑制约50%的细胞增殖（De Bock等,2013). 总的来说，本研究的结果也正如其他人报告的结果（辛普森等,2008)表明扩散和迁移并非相互排斥应仔细检查这两个过程的潜在目标。

我们预测的一些靶点以前曾在细胞增殖的背景下进行过研究还有（张等,2012). 波塞马托等（波塞马托等,2011)已经表明抑制PHGDH公司在升高的细胞系中PHGDH的表达抑制细胞增殖，但在没有PHGDH表达的人中没有。因此，作为PHGDH公司未在MDA-MB-231细胞系中扩增，该细胞系在两种细胞中均检测到研究表明，它的抑制确实是非致命的。然而，我们发现其抑制作用显著减弱细胞迁移，表明代谢酶可以促进不同的癌症不同癌细胞的表型。

值得注意的是，分析模型预测的通量率成功地揭示了一个基本原理AFR和癌症迁移之间的联系，即使考虑到相对较小的细胞系对其迁移进行了测量。我们的分析还揭示了其他潜在关联个体通量与细胞迁移之间(补充图S4). 然而，未来的研究测量跨更广泛的细胞系阵列（我们已经有增殖数据的顺序）是需要确定这些潜在线索的实际重要性。正如本研究所示，细胞增殖和迁移具有明显的潜在代谢物相关性；理解力与细胞迁移密切相关的代谢相关性可能导致新的抗转移治疗机会。然而，值得注意的是，虽然抑制单靠迁移可能是避免细胞毒性副作用的好策略治疗中，细胞迁移也是正常生理学中的一个关键过程，例如在免疫中反应和组织修复（Förster等,1999; 雷德利等,2003).因此，未来的抗迁移药物可能会带来不同的药物选择性挑战在未来的研究中仔细讨论。毫无疑问，它们可能导致较少的克隆因此，它们的使用可能伴随着较少的耐药克隆。

材料和方法

计算方法

基因组尺度代谢模型（GSSM）

代谢网络包括米代谢物和n个反应可以用化学计量矩阵S，其中条目S公司ij公司表示的化学计量系数代谢物我反应中j个（价格等,2004). CBM模型施加了质量平衡、方向性和通量代谢网络反应中可能通量空间的容量约束通过一组线性方程：

方程式图像
(1)

方程式图像
(2)

哪里v（v）代表模型中所有反应的通量向量（即。这个通量分布). 代谢物与环境的交换是表示为一组交换（运输）反应，启用预定义集从生长介质中吸收或分泌的代谢物。稳态假设用等式表示(1)限制生产每种代谢物的速率应等于其消耗速率。酶的方向性和通量容量约束定义了通量的上下限，并嵌入到方程中(2). 在下面，满足这些条件的通量向量这些条件将被称为可行的稳态通量分布。基因敲除是通过将通过相应代谢反应的通量限制为零来模拟。生物量此处使用的函数取自（Folger等,2011). 本文所有分析中模拟的介质是RPMI-1640介质用于实验性地生长细胞系（Lee等,2007; 崔（Choy）等,2008).

建立细胞特异性代谢模型并计算乳酸分泌

我们重建NCI-60癌细胞系的方法（参见补充材料，基于尚未伊扎克未发表的方法等，提交）需要几个关键输入：（a）通用人体模型（Duarte等,2007)，（b）来自（Lee）的每个癌细胞系的基因表达数据等,2007)和（c）增长率测量。那么算法通过修改与基因表达相关的生长相关反应（注：生长速率为仅用于确定约束模型时应使用哪些反应，以便获得尽可能与生理相关的模型；它们不是用来测定反应的边界）。使用类似的程序重建淋巴母细胞代谢模型（Choy等,2008)用于与正常值进行比较增殖细胞。有关更详细的说明，请参阅补充材料.

Warburg效应的模拟包括最低乳酸产生率的检查在不同的生物质生产需求下，葡萄糖、谷氨酰胺和氧气吸收率(补充材料). 我们检查了最小值乳酸分泌的价值，因为它可以证明细胞是否被迫分泌乳酸在给定条件下(补充图S1（第一阶段）). 本文中报告的所有相关性都是Spearman秩相关及其相关P（P）-使用精确的置换分布计算值。

计算野生型和扰动型乳酸分泌率和OCR水平

用于模拟正常氧条件下的乳酸分泌（与Jain相比et（等）铝（耆那教等,2012)，吴等（吴）等,2007)和本文收集的乳腺癌数据），氧最大摄取率设置为最高最小乳酸分泌为阳性的值。由于代谢模型旨在最大限度地提高生长产量，而不是生长速度，在GSMM中使用无限量的氧气模拟将导致最小乳酸分泌率等于零的状态。然而，值得注意的是，即使在这里模拟的有限氧气水平下，通用人类模型没有显示乳酸分泌（与NCI-60癌细胞系模型相反如上所述）。用于模拟此处测量的乳腺癌细胞缺氧条件根据描述，我们将最大摄氧量降低了正常氧状态的50%以上。在这些条件下，我们在最大生物产量和获得了1000个可行的通量分布（Bordel等,2010). 预测的乳酸分泌率是平均乳酸分泌通量在这些样本上。用于在吴模拟微扰实验等我们逐渐降低相应复合目标的界限（从最大界限降至0）重复上述用于计算ECAR（乳酸盐分泌）和OCR的程序以类似的方式定义为所有样品的平均耗氧量。

计算EOR和AFR测量值以评估细胞系的Warburg水平和用它们预测药物反应

EOR和AFR测量值的计算方法与上述类似。具体来说，EOR是所有样本的平均乳酸分泌量除以所有样本的平均耗氧量。同样，AFR计算为平均值糖酵解中产生ATP的反应所携带的流量与OXPHOS中产生ATP的反应。确定经验P（P）-药物的价值反应分析：我们随机将药物反应数据整理了1000次，每次检查结果WilcoxonP（P）-值。

预测反应击倒的效果

每个细胞系模型中的每一个代谢反应都会因将其流量限制为零而受到干扰。在每个扰动下，最小乳酸分泌量（在最大生长速率下）和最大乳酸分泌量计算了增长率。消除强迫乳酸分泌的一系列反应保持细胞生长水平大于野生型生长预测的10%是进一步测试AFR水平。每个细胞系的平均AFR水平如上所述，在1000个通量分布样本上计算扰动。最后一盘预测的反应包括那些将AFR降低到其60%以下的反应野生型级别。

数据集集合

生长率测量和药物反应数据从NCI网站下载。

增长率：http://dtp.nci.nih.gov/docs/misc/common_files/cell_list.html

药物反应：http://discover.nci.nih.gov/nature2000/natureintromain.jsp

乳腺癌细胞株乳酸分泌率的实验测定

细胞培养

MCF7、T47D、Hs578T和BT549乳腺癌细胞系取自American Type文化收集和伦敦研究所细胞服务。细胞在DMEM/F12中培养（1:1），添加2 mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素。培养基中添加10%用于癌细胞系的FCS（GIBCO）和5%马血清，20 ng/ml EGF，5μg/ml氢化可的松、10μg/ml胰岛素和100ng/ml霍乱毒素对非恶性细胞的作用线。

乳酸分泌测量

细胞在常压（20%O）下培养2)缺氧（0.5%哦2)在72小时的条件下，细胞饥饿葡萄糖和谷氨酰胺1小时并充满添加培养基1小时。测定常压和缺氧细胞的乳酸分泌，并归一化为细胞生长（正常氧培养72小时期间总蛋白增加）。使用乳酸测定法测定有细胞或无细胞培养基中的乳酸浓度套件（BioVision）。通过磺胺基罗丹明B测定的总蛋白质含量用于标准化。用三个或四个生物学上独立的复制品进行了两个实验（共七个重复）。

用于活细胞成像和细胞迁移分析的细胞培养

T47D、MCF-7、MDA-MB-435、BT549、MDA-MB-231和Hs578t在RPMI（GIBCO、Life）中培养Technologies，Carlsbad，CA，USA）补充10%FBS（PAA，Pashing Austria）和100国际单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）。

基因沉默

17个预测基因的人类siRNA SmartPools（四个单独的组合）是以siGENOME格式从Dharmacon（美国科罗拉多州拉斐特）购买。将平板稀释至1μM在互补的1×siRNA缓冲液中96 well板格式的工作浓度。A类非靶向siRNA作为阴性对照。进行50nM的反向转染根据制造商指南。复合时间为20分钟，添加5000个细胞。将培养皿放置在培养箱中过夜，第二天早上刷新培养基。48–72小时后，将细胞用于各种测定。细胞迁移和代谢通量测定实验重复进行，而细胞增殖试验在一式三份。

活细胞成像随机细胞迁移分析

玻璃底部96-well板（Greiner Bio-one，Monroe，NC，USA）涂有20层μg/μl I型胶原蛋白（从鼠尾分离）在37°C下保持1小时。48小时后沉默后，将MDA-MB-231细胞重新镀膜到胶原涂层的玻璃底板上。24小时接种后，细胞预先暴露于0.1μg/µl Hoechst 33342（Fisher科学，汉普顿，新罕布什尔州，美国）可视化核。刷新培养基后，将细胞置于配备37°C孵育室的尼康Eclipse TE2000-E显微镜，20×目标（0.75NA，1.00WD）自动舞台和完善的聚焦系统。每口井有三个位置自动定义，差分干涉对比度（DIC）和Hoechst信号使用CCD相机（像素尺寸：0.64μm）每20分钟采集一次，总成像周期为使用NIS软件（尼康）12小时。使用定制的ImagePro转换和分析所有数据Plus宏（Roosmalen等,2011). 单元格通过及时追踪细胞核来量化迁移。每次击倒的迁移速度变化为通过双面评估t吨-测试比较每个细胞的速度随后超时16h，并获得相应的控制值。所示数据标准化为控制并仅表示一个复制。值得注意的是，所有四种细胞系的两个重复都显示出R（右）2再现性高于0.75。基因实现P（P）-使用FDR和α=0.05被视为命中。

增殖试验

直接转染细胞并将其置于微透明96-well板（Greiner Bio-one）上。培养5天后，用Hoechst 33342对细胞进行染色，并用TCA固定（三氯乙酸），允许核计数和/或磺胺基丁二烯（SRB）读数。整体使用外荧光对微孔进行成像，并使用定制的ImagePro宏。如前所述，对钢板进行进一步处理，进行SRB染色（Zhang等,2011). SRB数据显示与核子计数重叠，因此所有数字都使用此度量。扩散的变化与对照组相比，击倒后的比率通过双面评估一式三份t吨-测试。所有三个复制品击倒后的平均增殖率计算并归一化为非靶向siRNA（=对照）。基因实现P（P）-使用FDR和α=0.05被视为命中。

代谢通量测定

使用海马评估了细胞对基因沉默的生物能量流XF96细胞外通量分析仪（Seahorse Bioscience）。每孔约8000个MDA-MB-231细胞（海马板）用siRNAs或对照处理72小时。每个基因（共7个）被敲除在六个不同的井中进行了两次实验（因此每个井共重复六次板和两个板）。在测量之前，用无缓冲DMEM XF分析替换培养基中等。基础耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）分别为然后使用XP96平板读取器和制造商：每个孔进行三次测量（因此每个基因获得18次测量OCR和ECAR）。测量完成后，用Hoechst 33342持续1小时，并用TCA固定，允许核计数和/或SRB读数。整体使用外荧光对微孔进行成像，并使用定制的ImagePro宏。如前所述，进一步处理板以进行SRB染色（张等,2011). SRB数据显示与核计数重叠，因此该测量用于归一化。所有值均已规范化核数。通过除以相应的ECAR和OCR值。A双面t吨-测试用于检查重大变化介于对照和敲低诱导的EOR之间。

致谢

我们要感谢Hans de Bont和Michiel Fokkelman的技术支持，YoavTeboulle、Matthew Oberhardt、Edoardo Gaude、Gideon Y.Stein和Tami Geiger，感谢他们的帮助对手稿的评论。KY得到了埃德蒙德·萨夫拉奖学金的部分资助Tel-Avv大学生物信息中心，并感谢Azrieli基金会授予该奖项Azrieli奖学金；SLD由荷兰系统生物学联合会和欧盟FP7系统显微镜NoE项目（258068）和荷兰基因组计划的BvdW。急诊室感谢以色列科学基金会（ISF）的慷慨支持癌症研究基金（ICRF）和规划和预算委员会的I-CORE计划以及以色列科学基金会（批准号41/11）。

作者贡献

KY和ER构思并设计了这项研究。SLD、VCB、CF和BvW设计了实验程序。FB和AS提供了乳酸分泌数据。KY执行了计算分析和统计计算。SLD、VMR和VCB执行了实验程序。KY、SLD、BvW和ER撰写了论文。

利益冲突

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