最近发现的变构抑制剂阻断转化细胞谷氨酰胺代谢的机制

重要性

摘要

最近，线粒体谷氨酰胺酶（GLS1）作为癌症的治疗靶点受到了广泛关注(1–三). GLS1催化谷氨酰胺水解为谷氨酸，谷氨酸用于癌细胞的柠檬酸循环（TCA）中，癌细胞经历异常的糖酵解通量（即Warburg效应），作为非葡萄糖衍生的补体来源。许多癌细胞表现出的谷氨酰胺代谢的提高（“谷氨酰胺成瘾”）对于维持其增殖能力以及其转化表型的其他方面至关重要(4–9). 我们实验室的工作表明，一种特殊的GLS1剪接变异体谷氨酰胺酶C（GAC）在Rho GTPases转化NIH 3T3成纤维细胞以及各种癌细胞的增殖和侵袭活动中起着重要作用(10,11). 因此，鉴于GAC表达和激活对致癌转化的重要性，针对这种代谢酶的抑制剂的鉴定为抗癌药物的开发提供了新的机会。

由于谷氨酰胺是一系列生化反应所必需的，包括核苷酸和蛋白质合成，谷氨酰胺类似物如GLS1抑制剂重氮-O（运行）-去甲亮氨酸（DON）(12,13)不是癌症药物的理想候选药物(14). 然而，GAC的两类变构抑制剂已被鉴定，并作为癌症治疗药物开发的先导化合物提供了更有前景的选择。其中一种由双-2-（5-苯基乙酰氨基-1,2,4-噻二唑-2-基）乙基硫醚（BPTES）的类似物组成，BPTES是一种可逆的GAC抑制剂，已被广泛表征(15,16). GAC–BPTES复合物的X射线晶体结构表明，BPTES有效地将GAC捕获为非活性四聚体(16–18).

最近发现的第二类变构GAC抑制剂是苯并菲啶酮968，它对抑制癌细胞生长具有高度特异性，但对正常（非转化）细胞几乎没有影响(11). 然而，到目前为止，对于这类分子是如何起作用的，我们知之甚少。在这里，我们确定新型GAC抑制剂968对转化细胞中的谷氨酰胺分解产生负面影响，并确定其如何影响GAC活性。首先，我们通过¹³C-同位素标记研究表明，968抑制伴随Rho-GTPase依赖性转化的谷氨酰胺代谢的升高。我们继续确定968如何在体外调节GAC活性。通过开发FRET分析，读取GAC进行酶激活所必需的二聚体到四聚体转换的能力(15,19,20)，我们表明，尽管BPTES的结合诱导了稳定的高亲和力GAC四聚体，但968既不抑制也不促进四聚体的形成。然而，我们发现968与FRET受体标记的GAC的结合导致供体荧光的显著剂量依赖性猝灭，即使没有FRET受体，这与968抑制GAC活性的能力直接相关。使用这种新型968结合分析，结合最近开发的GAC低聚缺陷突变体，我们表明968优先与GAC的单体形式相互作用。此外，968与单体GAC结合的剂量反应与其抑制致癌转化的剂量反应相匹配。这些发现为968阻断GAC活化和谷氨酰胺代谢的机制提供了重要见解，并为开发针对谷氨酰胺依赖性癌细胞的新型治疗药物开辟了道路。

结果

GAC抑制剂968阻断转化细胞中的谷氨酰胺分解。

我们实验室先前的工作通过发现小分子抑制剂968，确定了谷氨酰胺代谢与Rho-GTPase依赖性致癌转化之间的潜在联系(11). 我们发现，968通过阻断GAC激活，特异性抑制了转化细胞和各种癌细胞的生长，尽管详细机制尚不清楚。在这里，我们已经开始通过在一个定义明确的致癌转化模型系统中检查968对谷氨酰胺代谢的影响来更好地了解968的功能，在该模型系统中，小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中Dbl癌基因的稳定表达是通过去除多西环素（Dox）来控制的。

由于Rho GTPases激活引起的细胞骨架重排，MEF中致癌Dbl的诱导导致细胞形态发生显著变化(图1A类) (10,21–23). 这些形态变化伴随着致癌Dbl表达细胞克服接触抑制形成病灶的能力。与我们之前的结果一致(11)968例阻断病灶形成治疗表达致癌Dbl的MEF(图1B类). 我们检查了这些影响是否伴随着谷氨酸分解的抑制。MEF中致癌Dbl表达的诱导增加了谷氨酰胺分解和谷氨酰胺依赖性再灌注¹³来自[U的TCA循环中间产物中的C富集-¹³C] -谷氨酰胺(图1C类和D类). 用968治疗Dbl表达细胞导致谷氨酰胺衍生物的显著减少¹³TCA循环中间产物中的C同位素富集，但并没有导致每种代谢物的相对池大小耗竭，细胞内谷氨酸几乎减少了两倍(图S1A类，标记谷氨酸的直方图，将红色和黄色与黑色、绿色和蓝色进行比较）。细胞内谷氨酸的减少以及¹³如果968确实抑制谷氨酰胺酶活性，C标记将是一个预期结果。为了进一步证实这些观察结果，我们还测量了生长培养基中分泌氨和谷氨酸（即谷氨酰胺酶反应产物）的绝对速率，发现事实上968能有效抑制谷氨酰胺水解直接产物的积累(图S1B类). 在不表达Dbl的MEF中也观察到968对谷氨酸分解的适度抑制（参见图S1C类对于¹³C富集图和Dbl-OFF的M+5直方图，±968，in图S1D类，以及中的M+4直方图图S1E–G公司). 然而，Wang等人先前的研究(11)据报道，未转化NIH 3T3的细胞增殖没有显著下降(图1D类和E类)和人类乳腺上皮细胞；图4F类和G公司)这表明谷氨酰胺代谢对于支持伴随致癌Dbl表达的转化表型至关重要，但对于正常MEF的增殖能力则不重要。使用效力较低的968-类似物化合物27进行治疗，对¹³C代谢物富集(图1D类)，与抑制酶活性的降低效力一致（见下文）。

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图1。

968抑制了Dbl诱导的转化和增加的谷氨酸分解。(A类)在用抗肌动蛋白（红色）和抗HA（绿色）抗体诱导Dbl诱导的MEF 24小时后（+Dox）和（−Dox）进行荧光染色。(B类)Dbl的表达赋予MEF形成病灶的能力，而用10μM 968治疗可以阻断这种能力。(C类)图表显示¹³来自[U的C富集-¹³C] -谷氨酰胺转化为TCA循环中间产物，其中突出显示了Dbl下游的GAC活化。¹³碳原子显示为黑色填充圆圈¹²C-碳作为充满光的圆圈。(D类)谷氨酰胺衍生代谢物（谷氨酸M+5、富马酸M+4、苹果酸M+4、柠檬酸M+4）归一化为¹³对不表达Dbl的MEFs观察到的C富集。对968的治疗进行了比较，968是一种效力较低的类似物27（参见图3D类分子结构）和未经处理的细胞。条形代表三次测定的平均值（±SD）。P（P）值由学生确定t吨测试(*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.005).

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图4。

检测968与单体和二聚体GAC突变体的结合。(A类)GAC四聚体（人类亚型）与BPTES和谷氨酸盐（PDB 3UO9）复合物的晶体结构，建议的968结合囊由指向C末端单体-单体界面的箭头指示。插图突出关键单体单体(上部)和二聚体(下部)触点，带有相应的人和鼠GAC亚型残基编号(B类)WT GAC（红色）、D391K-GAC（蓝色）和K316E-D391K-R459E-GAC（绿色）的多角度光散射剖面，250μg（每个），其中实线表示通过监测折射率（R.I.）对每个物种进行洗脱，虚线表示当时洗脱物种的计算分子量。酶的单体、二聚体和四聚体形式的分子量参考线分别包括在58、116和232 kDa。(C类)将200 nM WT QSY9-标记的GAC（红色）、二聚体QSY9-GAC（D391K）（蓝色）和单体QSY8-GAC（K316E、D391K、R459E）（绿色）添加到20 nM WT488-标记的GA中，进行FRET分析。(D类)968结合，通过其猝灭WT 488标记的GAC、二聚体488-GAC（D391K）和单体GAC（K316E、D391K和R459E）的荧光来监测（每个样品中的总单体为10nM）。数据点代表三个独立实验的平均值（±SD），并与图3C类. (E类)50 nM的体外抑制曲线(●) 和5 nM WT GAC(○) 以968的浓度进行预培养。数据点代表三个独立实验的平均值（±SD），并符合逻辑四参数曲线。重叠是968对Dbl诱导的病灶形成（三角形）的剂量依赖性抑制。

根据¹³使用[U时柠檬酸盐中的C富集-¹³C] -葡萄糖作为示踪剂（参见图S2A类)，证明谷氨酰胺代谢的高度特异性刺激伴随着Rho GTPase依赖性转化。然而，观察到968抑制柠檬酸盐同位素的葡萄糖标记（参见图S2B类). 这可能是由于968年谷氨酸流量受到抑制。总的来说，这些结果显示了968如何减弱细胞谷氨酰胺代谢，并在表达致癌Dbl的细胞中恢复正常生长表型，从而突出了谷氨酰胺在细胞转化过程中作为补体关键来源的作用。

研究968对GAC二聚体到四聚体转变的影响。

GAC从二聚体到四聚体的转变被认为对酶的活性至关重要(15,19,20). 一种公认的GAC变构抑制剂BPTES已被证明能稳定酶的非活性四聚体状态(15). 因此，我们通过开发GAC二聚体到四聚体转变的实时读数来检查968是否以类似的方式起作用。图2A类描述了提议的FRET分析，其中监测两个纯化重组GAC群体之间的低聚物形成，用高荧光AlexaFluor 488（供体）探针或非荧光QSY9（受体）发色团标记。使用FRET作为GAC四聚体形成的直接读数的一个主要优点是能够在通常用于测定其酶活性的低浓度GAC下监测低聚物的形成。

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图2。

实时荧光分析检测GAC四聚体的形成。(A类)FRET分析的示意图。(B类)25 nM 488-GAC（供体）荧光在以剂量依赖的方式添加QSY9-GAC（受体）后熄灭，并通过添加10倍多余的未标记GAC而反转。(C类)随着QSY9-GAC量的增加，25 nM 488-GAC的滴定产生的FRET(○) 覆盖GAC的浓度依赖性体外激活(●). FRET数据符合二次结合等温线。点表示三个独立实验的平均值±SD。(D类)将越来越多的BPTES添加到25 nM 488-GAC和25 nM QSY9-GAC中，以检查抑制剂对GAC四聚体形成的影响。添加10倍多余的未标记GAC，试图逆转四聚体的形成。(E类)968诱导488-GAC荧光的剂量依赖性猝灭，这与添加QSY9-GAC诱导的猝灭不同。(F类)在没有QSY9-GAC的情况下，添加不同浓度的968至10 nM 488-GAC时的荧光猝灭。

将QSY9-GAC添加到488-GAC中，由于FRET导致施主488发射的剂量依赖性猝灭，这在添加未标记的GAC时是可逆的，表明GAC四聚体的形成是一个动态过程(图2B类). 从QSY9-GAC滴定曲线中获得的剂量依赖性结合等温线与GAC的基础活化直接相关，GAC在蛋白质浓度增加时发生基础活化（即由于通过质量作用形成四聚体），产生明显的K_D类四聚体形成164 nM（±20 nM）(图2C类)支持GAC四聚体是酶活性的最小单位的论点。

然后我们比较了968和BPTES对GAC二聚体到四聚体转变的影响。与之前的研究结果一致，BPTES将GAC稳定为非活性四聚体(16)，我们发现，当添加到488-GAC和QSY9-GAC的混合物中时，它会立即猝灭488-GAC的荧光发射(图2D类)即，由于BPTES能够促进488-GAC:QSY9-GAC（供体：受体）四聚体的形成。这些稳定的GAC:BPTES四聚体复合物不太容易通过添加未标记的GAC进行逆转(图2D类，比较在车辆控制DMSO存在下添加未标记GAC的绿色轨迹与在5μM BPTES存在下添加无标记GAC时的黑色轨迹）。有趣的是，968引发了明显不同的反应，导致488-GAC的荧光发射发生显著变化，随后在添加过量的未标记GAC后部分荧光恢复(图2E类). 当添加过量的未标记GAC时，488荧光的恢复是由于488-GAC和QSY9-GAC之间的FRET被消除，随后488-GAC或QSY9-GA和未标记的GAC之间形成混合四聚体。因此，968似乎不会干扰GAC四聚体的形成。然而，不能实现荧光发射的完全恢复表明968结合直接影响488-GAC供体荧光发射。事实上，我们发现968导致488-GAC发射的剂量依赖性猝灭（在没有FRET受体QSY9-GAC的情况下），与968介导的GAC活性抑制相匹配(图2F类和图S3). 综上所述，这些发现表明，968并不是通过将GAC捕获到非活性四聚体状态来模拟BPTES的作用，而是通过一种独特的变构机制来调节GAC的活性。

实时监测968与GAC的结合及其对酶活性的抑制。

我们开发了一种实时酶活性测定法，同时监测968与GAC的结合及其对酶活性的影响。488-GAC的酶活性通过监测伴随谷氨酸（GAC-催化反应的产物）转化为α-酮戊二酸（由谷氨酸脱氢酶催化）而产生的NADH（即460nm处的荧光发射）来测定。图3A类描述了这两种荧光分析的耦合图3B类显示了同时监测968与GAC（绿色实线）的直接结合及其对酶活性的抑制的实验结果（蓝色实线；蓝色虚线表示溶剂载体DMSO处理的控制酶活性）。与968不同，BPTES在强烈抑制GAC活性的条件下不会直接影响488-GAC荧光(图3B类，分别参见绿色和蓝色点迹）。

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图3。

开发实时968结合和抑制分析。(A类)实时968结合和抑制分析的示意图模型。监测488-GAC荧光猝灭作为968结合的读数，通过向含有标记GAC、10单位谷氨酸脱氢酶（GDH）和2 mM NAD的分析培养基中添加20 mM谷氨酰胺和50 mM磷酸盐生成NADH荧光来监测酶活性⁺. (B类)在指定时间添加20μM 968（–）、10μM BPTES（•••）或DMSO（-），监测10 nM 488-GAC（520-nM发射，绿色曲线）的荧光。同时，在120秒添加20 mM谷氨酰胺和50 mM磷酸盐后，监测NADH荧光（460-nm发射，蓝色曲线）(C类)实时968结合和抑制试验适用于96 well板格式，显示10 nM 488-GAC和10 nM WT未标记GAC的重叠抑制和荧光猝灭曲线。数据点是三个独立实验的平均值±标准差。实线显示了与K的结合等温线的半对数图_D类=3微米。(D类)实时结合和抑制分析中使用的968和968-like类似物的结构。(E类)绘制的IC₅₀抑制数据和测量K的（±SD）值_D类968个类似物代表组的荧光猝灭数据的（±SD）值（如D类). 化合物a–i对应于中所示的字母名称D类从抑制数据和猝灭数据中获得的值适用于生物分子相互作用的配体结合方程。该线表示具有以下值的线性回归拟合(R（右）²=0.92，斜率=1.10）。

然后，我们将这些分析方法应用于96周的平板格式，结果表明，968对488-GAC和未标记的GAC活性表现出重叠的剂量依赖性抑制(图3C类，分别为黑色闭合和开放圆圈），以及与488-GAC直接结合的重叠剂量反应(图3C类，绿色闭合圆圈）。我们通过检测一组新合成的968种衍生物（化合物SU-1、SU-2、SU-7、SU-8和SU-14图3D类)以及之前表征为GAC抑制剂的分子031、27和742(11,24). 不同968类似物与GAC结合并抑制其酶活性的能力之间存在直接相关性(图3E类). 这些分析的结果，特别是发现用喹啉部分（例如化合物27）取代968的萘基，显著影响了结合活性和抑制活性，表明此位置的疏水性是达到最大功效所必需的。

先前对968介导的重组GAC活性抑制的研究表明，与添加磷酸盐后添加968相比，968在添加谷氨酰胺和无机磷酸盐（无机磷酸盐是刺激GAC四聚体形成和GAC活性的变构激活剂）之前添加时更有效(24). 因此，我们检测了968与GAC结合的能力是否在用无机磷酸盐预处理酶并假定其处于激活的四聚体状态的条件下受到损害。事实上，我们发现968能够与由488标记的GAC和QSY9标记的GAC二聚体组成的四聚体GAC物种结合，通过488荧光发射的猝灭读出(图S4A类和B类). 此外，968能够与无机磷酸盐预培养的GAC结合(图S4C类，闭合圆圈与开放圆圈）。然而，在这些条件下，968对抑制酶活性的效果要差得多(图S4D类，闭合圆圈与开放圆圈）。因此，尽管968能够与磷酸活化的GAC结合，但磷酸诱导的活化状态对968抑制不太敏感。相反，当GAC在添加磷酸盐之前与968预孵育时，酶活性受到强烈抑制，并与968的结合直接相关(图S4C类和D类，打开圆圈）。

讨论

我们实验室先前的工作旨在识别特异性阻断Rho-GTPase依赖性转化的抑制剂，从而发现了苯并菲啶酮968(11). 出乎意料的是，968的蛋白质靶点似乎是一种特殊的剪接变异体（GAC），这种酶统称为谷氨酰胺酶，可以催化谷氨酰胺水解为谷氨酸并生成氨。这突出显示了 Rho GTPases在驱动致癌转化和调节谷氨酰胺代谢中的作用之间以前未被认可的联系。鉴于968在抑制转化细胞和癌细胞方面表现出惊人的特异性，而对正常细胞的对应物几乎没有影响，因此更好地理解968的功能很有意义。

我们利用了致癌Dbl的诱导表达系统，该系统允许我们以明确的方式暂时控制Rho-GTPase上游激活物的表达。通过使用该系统，我们能够在968的能力之间建立直接的相关性，以防止Dbl诱导的转化的关键结果，即焦点形成，以及特异性抑制谷氨酰胺分解。因此，968对致癌转化的抑制作用似乎是其干扰谷氨酰胺代谢能力的直接结果。

然后我们开始了解968是如何抑制谷氨酰胺代谢关键酶GAC的活性的。由于BPTES是一种特征明确的GAC变构抑制剂，已被证明能结合并稳定酶的非活性四聚体形式，一种可能性是968具有类似的效果。以前的研究使用分析超速离心、凝胶过滤和电子显微镜来研究GAC的寡聚体转变；然而，这些分析是在高于K的GAC浓度下进行的_D类这里报道了四聚体的形成(15,19,20,25,26). 因此，我们利用实时FRET分析监测GAC四聚体的形成。高灵敏度的FRET分析使我们能够直接监测GAC四聚体的形成，并表明其与酶激活相关，同时比较968和BPTES对二聚体到四聚体转变的影响。我们发现，与BPTES不同，968不能稳定GAC的非活性四聚体状态。然而，在这些FRET实验过程中，我们发现968与GAC的结合导致报告基团荧光熄灭，从而为我们提供了该抑制剂和各种类似物与酶结合能力的直接光谱读数。

通过利用968的直接结合试验，以及作为单体或二聚体存在的GAC突变体的最新发展，我们发现968对与酶的单体形式结合有明显的偏好。尽管968能够与GAC二聚体以及由变构调节剂无机磷酸盐激活的GAC四聚体结合，但其结合力较弱，但无法抑制激活酶四聚体的活性。因此，968优先与GAC的非活性单体状态结合，防止其发生活化构象变化，而如果GAC在968结合之前达到活化状态，则968无法抑制酶活性。

这些发现突出了BPTES和968为原型的两类变构GAC抑制剂之间的区别。BPTES能够结合并抑制活化的GAC，而968优先结合并稳定酶的非活性状态。此外，当比较968个抑制重组GAC活性的剂量依赖性与致癌转化时，这些结果揭示了之前差异的原因(24). 具体而言，在这些早期实验中，常规检测的重组GAC浓度代表二聚体和四聚体的混合物。因此，IC₅₀968的值反映了其与这些低聚物GAC物种的结合较弱。事实上，当968与GAC的结合及其抑制酶活性的能力在最初主要作为单体存在的GAC浓度下进行分析时，这些结合分析的剂量-反应曲线与细胞培养中的剂量依赖性转化抑制相匹配。

总之，我们表明968通过阻断维持转化状态所必需的谷氨酰胺代谢关键步骤，发挥了致癌转化的高度特异性抑制剂的作用。我们证明968能够直接与GAC结合，GAC是负责转化细胞和癌细胞中谷氨酰胺代谢升高的关键酶，968优先与酶的单体非活性状态结合。虽然尚未获得与GAC结合的968的X射线晶体结构，但这些发现为为什么这一点如此具有挑战性提供了理论依据，因为结晶试验通常在GAC浓度下进行，其中GAC以四聚体形式存在，即对968结合最不利的物种(13,16–18). 我们产生单体GAC突变体的能力现在为实现这种结构提供了新的机会。此外，适用于平板读取器分析的直接结合读数的可用性为识别968-like变构抑制剂提供了激动人心的可能性，这些变构抑制剂可能产生新的癌症治疗策略。

方法

重组GAC，如参考文献所述制备。11用50μM荧光探针标记，并使用PD10脱盐柱从未反应探针中分离。实验方法的其他细节，包括细胞培养、转化分析、代谢示踪实验、GAC制备、荧光标记和分析、酶活性和FRET分析，以及968个类似物的合成，见SI方法。

补充材料

致谢

脚注

工具书类