分子细胞。作者手稿;PMC 2016年1月8日提供。
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丙酮酸激酶亚型表达改变核苷酸合成影响细胞增殖
,1,2 ,1,三 ,1,4 ,1,4 ,1,4 ,2 ,2,5 ,1,6 ,1 ,1 ,2 ,1 ,1,4 ,7,8 ,7,8 ,1 ,9 ,1,6 ,1,4,6 ,2 ,7,8和1,4,10,*
索菲亚·伦特
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
2密歇根州立大学生理学系,美国密歇根州东兰辛48824。
维纳亚克·穆拉利达尔
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
三哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部,哈佛医学院,波士顿,马萨诸塞州02115,美国。
亚伦·霍西奥斯
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
威廉·J·伊斯雷尔森
1美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院科赫综合癌症研究所,邮编02139。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
丹·桂
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
劳伦·纽豪斯
2密歇根州立大学生理学系,美国密歇根州东兰辛48824。
马丁·奥格罗津斯基
2密歇根州立大学生理学系,美国密歇根州东兰辛48824。
5密歇根州立大学人类医学院,密歇根州东兰辛,48824,美国。
维维安·赫赫特
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
6麻省理工学院生物工程系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
卡莉·徐
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
Paula N.MaríN Acevedo
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
丹尼尔·霍勒恩
2密歇根州立大学生理学系,美国密歇根州东兰辛48824。
加里·贝林格
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
塔利亚·戴顿
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
斯特凡·克里斯滕
7比利时鲁汶3000 VIB Vesalius研究中心。
8比利时鲁汶大学肿瘤科,3000鲁汶。
伊利亚·伊利亚
7比利时鲁汶3000 VIB Vesalius研究中心。
8比利时鲁汶大学肿瘤科,3000鲁汶。
安·T·丁
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
斯特凡诺普洛斯
9美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学工程系,邮编02139。
斯科特·马纳利斯
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
6麻省理工学院生物工程系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
迈克尔·亚菲
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
6麻省理工学院生物工程系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
埃兰·安德烈切克
2密歇根州立大学生理学系,美国密歇根州东兰辛48824。
萨拉·玛丽亚·芬特
7比利时鲁汶3000 VIB Vesalius研究中心。
8比利时鲁汶大学肿瘤科,3000鲁汶。
马修·范德·海登
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
10Dana-Farber癌症研究所,美国马萨诸塞州波士顿02115。
1科赫癌症综合研究所,麻省理工学院,剑桥,马萨诸塞州02139,美国。
2密歇根州立大学生理学系,美国密歇根州东兰辛48824。
三哈佛大学-麻省理工学院健康科学与技术部,哈佛医学院,波士顿,马萨诸塞州02115,美国。
4麻省理工学院生物系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
5密歇根州立大学人类医学院,密歇根州东兰辛,48824,美国。
6麻省理工学院生物工程系,美国马萨诸塞州坎布里奇02139。
7Vesalius研究中心,VIB,比利时鲁汶3000号。
8比利时鲁汶3000号鲁汶大学肿瘤科。
9美国马萨诸塞州剑桥市麻省理工学院化学工程系,邮编02139。
10Dana-Farber癌症研究所,美国马萨诸塞州波士顿02115。
*通信:美国麻省理工学院剑桥综合癌症研究所Matthew G.Vander Heiden Koch研究所,马萨诸塞州02139电话: +1 617 715 4471传真: +1 617 253 3189ude.tim@hvm - 补充资料
1
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2
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三。
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总结
代谢调节影响细胞增殖。丙酮酸激酶亚型对肿瘤细胞的影响已被广泛研究,但PKM2是否是正常细胞增殖所必需的尚不清楚。我们研究了PKM2缺失如何影响非转化、非永生化表达PKM2的原代细胞的增殖和代谢。我们发现原代细胞中PKM2的缺失导致PKM1的表达和增殖停滞。PKM1的表达,而不是PKM2的丢失,是导致这种效应的原因,细胞分化、衰老、死亡、基因表达变化或阻止细胞生长不能解释增殖停滞。相反,PKM1的表达损害了核苷酸的产生以及合成DNA和细胞周期进程的能力。核苷酸的生物合成受到限制,因为增殖停滞的特点是胸腺嘧啶严重耗竭,而供应外源胸腺嘧啶可以拯救核苷酸水平和细胞增殖。因此,PKM1的表达促进了无法支持DNA合成的代谢状态。
结果
PKM1表达导致原代胚胎成纤维细胞增殖停滞
为了研究PKM2在细胞增殖中的作用,我们从小鼠中提取了胚胎成纤维细胞(MEFs),其中LoxP位点位于PKM2特异性外显子10的侧面(PKM2(平方公里)飞行/飞行)并含有可诱导的Cre重组酶等位基因(Cre-ER公司) (Israelsen等人,2013年). 外显子10的缺失会破坏细胞产生PKM2或任何具有PKM2活性的截短蛋白产物的能力,但不会阻止PKM1的产生(Israelsen等人,2013年). 当Cre重组酶保持不活动时,PKM2表达于PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司单元格(),根据野生型MEF的报告(Anastasiou等人,2011年). 添加4-羟基三苯氧胺(4-OHT)激活Cre重组酶,导致PKM2蛋白和PKM1表达缺失(). 4-OHT治疗1天后观察PKM1表达;然而,4-OHT处理后4天内可以检测到残留的PKM2,可能是因为PK蛋白的半衰期长达104小时(Ill和Pette,1979年;Yee等人,2010年).
PKM2缺失与PKM1表达导致增殖停滞(A)4-OHT处理对丙酮酸激酶亚型表达的影响PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司通过Western blot分析评估MEF。PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用4-OHT治疗(PKM2(平方公里)Δ/Δ
Cre-ER公司)或车辆(PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER)对于所指示的天数。包括肌肉或H1299癌细胞裂解物作为分别仅表达PKM1或PKM2的对照样品。
(B)扩散PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF跟车(PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER)或4-OHT(PKM2(平方公里)Δ/Δ
Cre-ER)如图所示,通过计数细胞数量来评估处理。
(C)Cre阴性增殖PKM2(平方公里)飞行/飞行用载体或4-OHT治疗的MEF通过计算细胞数进行评估,如图所示。
(D)MEF的Western blot分析PKM2(平方公里)佛罗里达州/+
Cre-ER公司老鼠。4-OHT处理导致PKM2(平方公里)fl/Δ表达PKM2和PKM1蛋白的MEF。100 ng重组PKM1或PKM2(rPKM1,rPKM2)的Western blot分析作为对照。
(E)扩散PKM2(平方公里)佛罗里达州/+
Cre-ER公司车辆处理的MEF(PKM2(平方公里)佛罗里达州/+)或使用4-OHT(PKM2(平方公里)Δ/+)通过计算细胞数进行评估,如图所示。
(F)如图所示,用载体或1μM PKM2激活剂TEPP-46处理野生型MEF后,通过计算细胞数评估其增殖情况。
所有数据均显示为平均值±SEM,n=3。
另请参见图S1.
与野生型MEF类似,主要PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF在培养基中快速增殖,可多次传代(). 当用4-OHT治疗时,这些MEF的增殖明显减少(). 在多个线中观察到类似的增殖抑制,每个线分别来自不同的PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司老鼠(图S1A). 为了确保4-OHT治疗本身不会影响PK亚型表达或细胞增殖,我们从PKM2(平方公里)飞行/飞行没有庇护的老鼠Cre-ER公司等位基因。这些Cre-negativePKM2(平方公里)飞行/飞行MEFs表达PKM2(图S1B)并且无论4-OHT处理如何都以相似的速率增殖().
为了确定PKM1的表达或PKM2的丢失是否与细胞增殖停滞有关,我们从PKM2(平方公里)佛罗里达州/+
Cre-ER公司老鼠。未经4-OHT处理,这些MEF仅表达PKM2()并增殖几代(). 4-OHT处理PKM2(平方公里)飞行/+
Cre-ER公司MEF导致PKM2条件等位基因缺失,导致PKM1表达,野生型等位基因持续表达PKM2(). 如中所述PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF,4-OHT的添加在PKM2(平方公里)佛罗里达州/+
Cre-ER公司尽管PKM2表达保持不变,MEF(). 与Cre介导的PKM2缺失相比,Cre单独表达也能减缓增殖而不影响丙酮酸激酶亚型的表达,但不会增加γ-H2AX水平,对细胞增殖的影响较小(图S1C-S1E). 为了测试与PKM1表达增加相关的丙酮酸激酶活性的增加是否有助于阻止增殖,我们监测了添加小分子PKM2激活剂TEPP-46后野生型MEF的增殖(Anastasiou等人,2012年). TEPP-46减少增殖(),外源性PKM1 cDNA表达也减少野生型MEF的增殖(图S1F). 总之,这些数据表明增殖在PKM2(平方公里)Δ/Δ由于PKM1的收益而非PKM2的损失而产生的MEF。
PKM2的缺失不会诱导细胞死亡、衰老或分化
PKM1表达抑制增殖的潜在解释包括细胞死亡、细胞衰老和/或向非增殖细胞群分化的增加。为了在PKM2缺失和未缺失的细胞中检测这些可能性,我们通过排除碘化丙啶来量化活细胞的百分比,并通过乳酸脱氢酶释放来量化细胞死亡的数量(Decker和Lohmann-Matthes,1988年;Nicoletti等人,1991年). 两组之间的细胞活力或LDH释放没有差异PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ尽管细胞数量差异很大,但在溶媒或4-OHT治疗后的9天内出现MEF(和S2A公司). 与这些结果一致,这两个群体中超过90%的MEF在这个时间点不包括台盼蓝。这些数据表明,PKM2缺失后PKM1的表达会抑制细胞增殖而不会增加细胞死亡。
PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞周期停滞(A)通过碘化丙啶染色对治疗后的细胞活力进行定量PKM2(平方公里)飞行/飞行带车辆的MEF(PKM2(平方公里)飞行/飞行)或4-OHT(PKM2(平方公里)Δ/Δ). 数据显示为平均值±SEM,n=3。
(B)用酸性稳定的β-半乳糖苷酶活性测定经典细胞衰老。顶部面板(标记为早期传代)评估PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ分别在溶媒或4-OHT治疗后9天出现MEF。底部面板(标记为Late passage)评估PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ培养12天后的MEFs。这个PKM2(平方公里)飞行/飞行在这个时候,MEF已经经历了防扩散。
(C)从三种不同来源分离的成肌细胞在12天内的群体倍增PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司用载体治疗的小鼠(PKM2(平方公里)飞行/飞行)或4-OHT(PKM2(平方公里)Δ/Δ). 数据显示为平均值±SEM,n=3。
(D)生成的成肌细胞图像PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司小鼠用溶媒治疗9天后(PKM2(平方公里)飞行/飞行)或4-OHT(PKM2(平方公里)Δ/Δ)如图所示。PKM2(平方公里)飞行/飞行还展示了低血清培养9天诱导分化的成肌细胞(右图)。
(E)EdU摄取量PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF测量单位为PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司用药后7天或4-OHT治疗后出现MEF。数据显示为平均值±SEM,n=3。
(F)用碘化丙啶染色和流式细胞术评估DNA含量PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF 7天后PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用载体或4-OHT治疗。
(G)在FxCycle紫和EdU双重染色后,使用流式细胞术评估DNA含量PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF 7天后PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用载体或4-OHT治疗。
另请参见图S2.
原代MEF在培养中连续传代后会衰老,从而进入不可逆转的增殖停滞状态(坎皮西,2011年;Kuilman等人,2010年;Odell等人,2010年). 因此,PKM1的表达可能诱导早期衰老。衰老细胞的一个标志是酸稳定的β-半乳糖苷酶活性(Castro等人,2003年;Dimri等人,1995年;van der Loo等人,1998年). 在早期传代增殖过程中,酸稳定性β-半乳糖苷酶活性没有发现差异PKM2(平方公里)飞行/飞行并阻止增殖PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF最迟在使用载体或4-OHT治疗后9天(,上部面板)。延迟通过PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF的衰老表现为增殖停滞、形态改变和酸性β-半乳糖苷酶染色。令人惊讶的是,尽管几天没有扩散,PKM2(平方公里)Δ/ΔMEFs染色同时呈酸性β-半乳糖苷酶活性阳性PKM2(平方公里)飞行/飞行高通道数导致MEF老化(,下部面板)。这些数据表明,通过连续原代细胞传代观察到的衰老程序诱导与细胞增殖抑制无关PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞。
初级MEF在特定培养条件下可以分化。例如,MEF可以沿着脂肪细胞样谱系分化并积累中性脂质(Green和Kehinde,1974年;Russell和Ho,1976年). 确定是否PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF积聚脂质,我们用油红O染色,没有发现脂质积聚的证据(图S2B). 为了进一步测试PKM2(平方公里)缺失导致分化,并确定是否在PKM2(平方公里)Δ/Δ除MEF外的原代细胞,我们从PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司老鼠。成肌细胞可以被诱导分化为具有特征形态的肌管(威克兰,1985年)、和是一个经过深入研究的差异化模型(Abmayr和Pavlath,2012年). 与观察到的表型相似PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF,治疗PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司含有4-OHT的成肌细胞导致PKM2缺失和PKM1表达(图S2C)阻止扩散(). 类似于永生C2C12成肌细胞(Clower等人,2010年),我们确认了主要PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司成肌细胞能够在有利于肌管形成的条件下分化()并在分化时表达PKM1(图S2D). 然而,成肌细胞中PKM2缺失不会导致分化为肌管().
PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF不包含EdU
缺乏PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF增殖意味着无法进行整个细胞周期。调查是否PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF复制DNA,与EdU孵育,EdU是一种在细胞周期S期并入DNA的胸腺嘧啶类似物。与缺乏DNA合成一致,PKM2(平方公里)Δ/Δ与PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司(). 缺乏营养的细胞典型地停滞在细胞周期的G1期(Bohnsack和Hirschi,2004年). 确定是否PKM2(平方公里)Δ/Δ在G1期捕获MEF,用流式细胞术分析DNA含量。G1期和G2/M期DNA含量峰值均以最符合S期更多细胞的模式加宽(). EdU掺入和DNA含量的双重染色也与无法在细胞周期中进行一致,因为在所有DNA含量中观察到较少的EdU掺合,尽管没有EdU摄取,但大多数人群的DNA含量在2N到4N之间(). 要进行比较PKM2(平方公里)Δ/Δ从MEF阻滞到营养素提取诱导的细胞周期阻滞,在去除必需氨基酸赖氨酸后评估野生型MEF的DNA含量。赖氨酸的退出也会导致增殖抑制(图S2E); 然而,与PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,这些细胞聚集在G1(图S2FM). 综上所述,这些结果表明,PKM1表达引起的增殖缺乏与营养缺乏引起的G1期阻滞不同。相反,这些数据与PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF将核苷酸并入DNA。
尽管进行了防扩散逮捕,PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF继续吸收营养并生长
真核细胞的细胞分裂取决于细胞大小(Johnston等人,1977年;Montagne等人,1999年). 细胞停止增殖的一个可能的解释是,新陈代谢的变化导致支持细胞生长的新陈代谢前体不足,并且无法获得足够的大小来完成细胞周期。确定是否阻止扩散PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF与有氧糖酵解减少有关,我们测量了葡萄糖消耗量和乳酸排泄量。令人惊讶的是,尽管核扩散已被阻止,PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF的葡萄糖摄取率和乳酸排泄率高于PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司(). 总的葡萄糖氧化也在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEFs:测量14一氧化碳2从均匀放射性标记的葡萄糖中获得的产量增加了约40%14一氧化碳224小时内葡萄糖的生产PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF大于PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司(). 此外,细胞体积评估表明PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞比增殖细胞大约1.7倍PKM2(平方公里)飞行/飞行单元格(). 事实上,被捕者的平均数量PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞大于循环的85%PKM2(平方公里)飞行/飞行单元格,建议PKM2(平方公里)Δ/Δ尽管核扩散被阻止,但MEF的规模仍在扩大。细胞体积的增加伴随着蛋白质数量的增加,总蛋白质含量为PKM2(平方公里)Δ/ΔMEFs约为自行车运动中总蛋白质含量的1.9倍PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司().PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF还含有较高水平的脂肪酸,棕榈酸、油酸和甾酸的总量比PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF与PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司(图S3). 为了证实细胞体积、总蛋白和特定脂肪酸的增加伴随着细胞质量的增加,我们使用了悬浮微通道谐振器(Burg等人,2007年)测定单细胞水平的干质量(Feijo Delgado等人,2013年). 干质量PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞的干质量大于PKM2(平方公里)飞行/飞行细胞(783 pg用于PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF与455 pg相比PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF;). 一百万PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF的重量也比相同数量的PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF在滤纸上干燥并使用分析天平称重。总的来说,这些数据表明,尽管核扩散已被阻止,PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF继续以高速代谢葡萄糖,并增长到比增殖更大的尺寸PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司。
PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞保持代谢活性,并且大于PKM2(平方公里)飞行/飞行细胞(A)葡萄糖摄取率;(B)乳酸排泄率;(C)相对产量14C-标记CO2从一致14C-标记葡萄糖;(D)平均细胞体积;(E)总蛋白含量;和(F)单电池干质量PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF治疗后7天PKM2(平方公里)飞行/飞行带有车辆或4-OHT的MEF。所有数据均显示为平均值±SEM,n=3(*p<0.0001)。
另请参见图S3.
PKM2支持合成代谢的特定方面
尽管生长到更大的尺寸,特定的代谢物或代谢流量限制可以解释PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞增殖。为了探索这一假设,我们使用同位素标记的营养素和基于质谱的代谢产物分析来探测PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF与PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司。均匀标记培养后细胞内代谢物的分析13C-葡萄糖([U-13C类6]葡萄糖)和谷氨酰胺([U-13C类5]谷氨酰胺)揭示了这一点PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF减少了一些生物合成前体中葡萄糖和谷氨酰胺的标记,包括核苷酸尿苷单磷酸(UMP)和脂肪酸棕榈酸酯(和第4页). 此外,13C-葡萄糖并入丝氨酸和甘氨酸的量在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司。相反,较高百分比的TCA循环中间产物标记自[U-13C类6]葡萄糖PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司()表明TCA循环中葡萄糖的贡献增加和/或谷氨酰胺的贡献减少。使用[U标记研究-13C类5]谷氨酰胺表明PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF对TCA循环中间产物的谷氨酰胺贡献较低()意味着增殖被抑制PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF更多地依赖葡萄糖而不是谷氨酰胺来支持TCA循环。这些结果证实,PKM1表达导致葡萄糖分解代谢增加,并支持一个模型,即PKM1的表达减少了葡萄糖和谷氨酰胺用于生产某些生物合成前体的使用。
丙酮酸激酶亚型表达影响特定代谢途径的使用(A)用[U标记细胞内代谢物-13C] 葡萄糖或(B)[美]-13C] 谷氨酰胺是用质谱法在PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF 7天后PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用载体或4-OHT治疗。用于计算这些值的完整同位素分布包括在表S1中所有图形的y轴(A)是总葡萄糖的计算百分比(Fendt等人,2013年a).
另请参见图S4.
葡萄糖是从头开始两者中棕榈酸的合成PKM2(平方公里)Δ/Δ和PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF,尽管从葡萄糖和谷氨酰胺合成的棕榈酸较少PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF相对于PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司(图S4). 随着PKM2的缺失,这些细胞中的总脂肪酸合成率降低了22%,这与之前在PKM1表达时观察到的脂质合成减少一致(Anastasiou等人,2012年). 棕榈酸的一部分是由谷氨酰胺在PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,在这两种情况下都具有与还原代谢合成一致的标记模式(Fendt等人,2013年b;Metallo等人,2012年). 尽管PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF的脂肪酸合成减少,与MEF相比,MEF的细胞内脂肪酸含量更高PKM2(平方公里)飞行/飞行对应方(图S3). 尽管生物合成减少,但要积累高水平的脂肪酸,很可能是PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF输入外源性脂肪酸。以前曾在癌细胞中观察到从培养基中清除脂质(Kamphorst等人,2013年).
扩散PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF受核苷酸限制
测量细胞内代谢物的池大小,以评估特定代谢物是否限制细胞增殖PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司。而大多数代谢物的水平PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞相对于PKM2(平方公里)飞行/飞行单元格(图S5A),核苷酸水平较低,在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF是指一磷酸胸苷(dTMP;). 这与在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(),因为UMP是dTMP的生物合成前体。
核苷酸缺乏限制了PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(A)细胞内核苷酸的池大小PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ术后7天测量MEFPKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用载体或4-OHT治疗。细胞内核苷酸的池大小PKM2(平方公里)Δ/Δ在4-OHT治疗7天后,还测量了补充250μM胸腺嘧啶的MEF。数据显示为平均值±SEM,n=4。
(B)用[U动态标记细胞内代谢物-13C] 葡萄糖和[U-13C] 谷氨酰胺在PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF 7天后PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用载体或4-OHT治疗。所有测量的完整同位素分布包括在表S2.
(C)年中心碳代谢的代谢通量PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司。通量基于动态和稳态[U-13C] 葡萄糖和[U-13C] 谷氨酰胺标记数据。除NTP和乳酸外,未描述生物量和提取通量(完整通量模型见补充)。PKM2通量之间的显著差异(>40%,基于95%置信区间)飞行/飞行和PKM2Δ/ΔMEF以灰色突出显示。
另请参见图S5,补充实验程序、和13C-代谢通量分析模型.
探索以下可能性从头开始核苷酸合成减少PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,我们进行了动态标记实验和通量建模。统一标记的动态标记13C-葡萄糖和13C-谷氨酰胺证实葡萄糖和谷氨酰胺对UMP的流量降低PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(). 同样的标记研究也表明,葡萄糖碳流入IMP和AMP的通量在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,而谷氨酰胺标记并不能提供信息,因为这种氨基酸不会对从头开始嘌呤合成。稳态标记数据的代谢通量分析(Antoniewicz等人,2007年;Young等人,2008年)支持以下观点从头开始核苷酸合成、谷氨酰胺到谷氨酸的转化以及3-磷酸甘油酸(3PG)到丝氨酸的流量在PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(). 3PG到丝氨酸的流量减少与以前关于PKM2表达将碳分流到丝氨酸生物合成中的报道一致(Chaneton等人,2012年); 然而,尽管丝氨酸合成减少,但丝氨酸水平保持不变(图S5A). 确定丝氨酸代谢是否会限制从头开始核苷酸生物合成,我们基于13C-葡萄糖掺入丝氨酸和甘氨酸以及从培养基摄取丝氨酸和甘氨酸的速率(图S5B,补充材料). 而模型显示3PG向丝氨酸的转化率降低PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,丝氨酸摄取似乎足以补偿从头开始丝氨酸合成,表明缺乏丝氨酸本身的可用性不太可能解释核苷酸合成受损的原因。
防扩散PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF不是由基因表达变化引起的
我们进行了基因组水平的基因表达分析,以探讨基因表达的变化是否导致PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF防扩散。微阵列数据分析PKM2(平方公里)Δ/Δ和PKM2(平方公里)飞行/飞行从两个不同的独立衍生MEF系获得的细胞显示,基因表达变化与丙酮酸激酶亚型表达之间没有相关性(). 事实上,无监督的层次聚类结果是由产生MEF的胚胎而不是丙酮酸激酶亚型表达进行聚类。作为另一种方法,我们使用折叠变化分析来比较PKM2(平方公里)Δ/Δ和PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司。该分析揭示了少数基因根据丙酮酸激酶亚型的表达表现出差异,这些结果通过RT-PCR得到了证实(图S6A); 然而,没有一个基因与代谢或细胞周期控制直接相关。
基因组水平的基因表达分析表明,基因表达与细胞增殖抑制无关PKM2(平方公里)Δ/Δ细胞(A)的无监督分层聚类PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF表达谱。RNA是从PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF 7天后PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF用载体或4-OHT治疗。MEF由两个独立的PKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre-ER公司MEF公司。使用Affymetrix基因芯片小鼠基因1.0ST阵列分析RNA。
(B)的无监督分层聚类PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ核苷酸代谢相关基因的MEF表达谱。
另请参见图S6.
自代谢分析PKM2(平方公里)Δ/Δ和PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF揭示了核苷酸代谢的缺陷,我们重新分析了仅检测核苷酸代谢基因的基因表达数据(). 同样,无监督的层次聚类并没有显示表达变化与丙酮酸激酶亚型表达之间的相关性,大多数基因的表达水平变化最小。为了证实这些结果,我们通过Western blotting和RT-PCR检测了几个关键核苷酸代谢基因的相对蛋白质和基因表达水平(图S6B和S6C). 两者之间的表达无差异PKM2(平方公里)Δ/Δ和PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF公司。这些结果表明,基因表达的改变并不能解释核苷酸合成受损或细胞增殖停滞PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司。
PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF不能完成DNA合成
确定是否从头开始嘧啶的生产限制了PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,我们试图通过在添加4-OHT时补充胸腺嘧啶来阻止增殖。补充胸腺嘧啶可阻止PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(). 补充胸腺嘧啶还可以防止细胞内dTMP和dTTP水平以及其他核苷酸水平的耗竭()和其他一些耗尽的代谢物(图S5A),但对PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF或Cre表达的MEF(图S7A和S1C). 胸腺嘧啶补充剂维持细胞增殖的能力PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF最多可维持10天,且不会增加PKM2(平方公里)Δ/Δ加入胸腺嘧啶后,通过诱导增殖爆发来增加MEF细胞数量。嘧啶胞嘧啶、尿嘧啶和嘌呤肌苷、鸟嘌呤和腺嘌呤也部分阻止了PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,但程度较低(). 为了证实丝氨酸的变化不会限制细胞增殖,我们补充道PKM2(平方公里)Δ/Δ丝氨酸MEF;然而,在核苷酸合成中使用的丝氨酸或其他底物都没有拯救增殖().
补充胸腺嘧啶可恢复PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF公司(A)人口在10天内翻了一番PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ在添加或不添加250μM浓度的培养基中所示代谢物的情况下测量MEF。数据显示为平均值±SEM,n=3*与PKM2(平方公里)Δ/Δ无任何补充的MEF。
(B)DNA链包含CldU(红色)和IdU(绿色)的三个代表性图像PKM2(平方公里)飞行/飞行和PKM2(平方公里)Δ/Δ五天后的MEFPKM2(平方公里)飞行/飞行
Cre急诊室MEF用载体或4-OHT处理;比例尺=15μm。
(C)显示了包含CldU和IdU的DNA链百分比的定量。对于此分析,237股来自PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF和54股PKM2(平方公里)Δ/Δ对按(B)所述制备的MEF进行评估。
另请参见图S7.
确定补充胸腺嘧啶是否能恢复停滞细胞的增殖PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,我们在添加4-OHT后5天向培养基中添加胸腺嘧啶,这是PKM2缺失细胞停止增殖的时间点(). 添加胸腺嘧啶可恢复持续数天的增殖;然而,细胞在第10天左右衰老,因此经历较少的群体倍增(图S7B). 即使每3天更换一次培养基而不重新培养PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,尽管在防扩散后18天内一直在进行培养。
为了确定DNA合成是否受到核苷酸库的限制PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF,我们进行了DNA标记研究,以直接可视化核苷酸随时间的推移并入DNA(). While期间PKM2(平方公里)飞行/飞行MEF包含5-氯-2′-脱氧尿苷(CldU)和5-碘-2′-去氧尿苷,PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF只能将CldU和IdU用于短脉冲,很少观察到同时具有CldU与IdU的绞线(). 这些数据至少表明PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF处于S期,因为观察到有限的CldU和IdU并入DNA。数据还表明PKM2(平方公里)Δ/ΔMEF无法维持DNA合成,与导致增殖停滞的核苷酸耗竭相一致。总之,我们的实验认为PKM1的表达会导致低核苷酸水平和无法复制DNA。
实验程序
所有小鼠研究均按照机构指南进行,并得到麻省理工学院动物护理委员会的批准。
小鼠原代胚胎成纤维细胞的分离培养
采用已发表的方法分离和培养原代小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(Springer等人,2001年). 胚胎在妊娠E11.5–E14.5分离,每个胚胎分别处理。MEF在MEF培养基(含有10%热灭活FBS、1%链霉素/青霉素、1 mM谷氨酰胺和0.1 mM 2-巯基乙醇的Dulbecco改良Eagle's培养基)中培养,并以5×10的密度涂布6每10厘米板的细胞数。细胞在汇合前被分裂,并以每10厘米板75万个细胞的速度重新放置。使用乙醇中的1μM 4-羟基三苯氧胺诱导重组PKM2(平方公里)佛罗里达州等位基因。将缺乏赖氨酸的细胞培养在无赖氨酸DMEM中,并在10天内分析加倍时间。
细胞增殖分析
将750000个细胞分三次接种在10 cm的平板中,并使用试管自动T4细胞计数器(Nexcelom)获得细胞计数。细胞在70%的汇合处重新放置、计数,并以每10 cm板750000的密度重新播种。使用以下公式计算人口倍增(PD):
使用时,将所有代谢物补充剂添加到浓度为250μM的MEF培养基中。
代谢物吸收和排泄
72小时后对条件培养基进行取样。使用YSI 7100 Select生化分析仪测量葡萄糖和乳酸水平。以下等式用于计算每10人的代谢产物消耗量/排泄量6每小时细胞数(α):
哪里
和X(X)是单元格编号t吨是以小时为单位的时间。对于0的μ(比增长率为0),使用以下公式计算α:
代谢物提取和分析
为了使用气相色谱/质谱法进行代谢物分析,将细胞在无葡萄糖和谷氨酰胺的DMEM基MEF培养基中培养约72小时,并添加透析的FBS和适当的示踪剂。[美]-13C类6]葡萄糖,[U-13C类5]谷氨酰胺和[5-13C] 谷氨酰胺均来自剑桥同位素实验室。
细胞周期分析
细胞在4°C的冰镇乙醇中固定过夜,在含有1%BSA的PBS中洗涤两次,用RNase处理,并在碘化丙啶缓冲液中再次悬浮至最终浓度50μg∙ml−1细胞在Becton Dickinson FACScan流式细胞仪上进行分析。为了检测新的DNA合成,使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488试剂盒,将细胞暴露于10μM EdU(Invitrogen)下3小时{“类型”:“entrez-notide”,“属性”:{“文本”:“C35002”,“term_id”:“2371143”,”term_text“:”C35002“}}C35002型),并在Nikon Eclipse TE2000-U显微镜上以4秒的曝光时间成像,并使用ImageJ软件进行分析。分别使用Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit和FxCycle Violet Stain(Life Technologies F-10347)对细胞进行DNA含量和新DNA合成的双重染色,并使用FACS Diva软件在BD FACSCanto II上进行分析。使用BD-FACScan流式细胞仪通过碘化丙啶染料排除法评估存活率。
电池质量和体积的测量
如前所述测量单个电池的干质量(Feijo Delgado等人,2013年). 简单地说,细胞在1x PBS中重新悬浮,并加载到15x20μm横截面悬浮微通道谐振器中。首先在1x PBS中测量每个细胞的浮力质量,然后在1x D中测量2O-PBS。每个实验在室温下进行约1.5小时。用于测量分批培养的细胞干重,106细胞被捕获到膜过滤器上,在37°C下干燥数天,并使用分析天平称重。减去干燥前仅装有PBS的控制膜过滤器的重量,得到106细胞。使用Coulter计数器测量细胞体积。
DNA链标记
细胞在含有100μM CldU(Sigma-Aldrich C6891)的培养基中培养20分钟,用PBS洗涤,然后在含有250μM IdU(Sigram-Aldrich I7125)的培养液中培养20 min。胰蛋白酶化后,将标记细胞重新悬浮在PBS中,其中有10倍的未标记细胞,并将2.5μL转移到带有7.5μL铺展缓冲液(200 mM Tris-HCl pH7.5,50 mM EDTA,.5%SDS)的玻片中。将载玻片干燥并在冷的3:1甲醇:乙酸中固定2分钟。在用2.5 N HCl处理30分钟以使DNA变性后,用PBS清洗载玻片,并用PBST+2%BSA在37°C下封闭载玻片。然后将样品在含有CldU一级抗体的PBST+1%BSA中培养1小时(AbD Serotec OBT0030)和IdU(BD 347580),用PBST清洗,并在37°C的PBST+1%的BSA中培养30分钟,其中含有分别与Cy3(Jackson Immunochemicals 712-165-153)和Alexa Fluor 488(JacksonImmunoChemicals 7.15-545-151)结合的二级抗体,对小鼠和大鼠IgG的交叉反应最小。使用DeltaVision Elite成像系统(Applied Precision)和带有100倍物镜的显微镜(IX-71型;Olympus)以及CoolSNAP HQ2相机(Photometrics)对样品进行成像。
致谢
本研究得到了国防部CDMRP远见博士后奖的支持,奖项编号为(W81XWH-12-1-0466),授予SYL。SMF的工作得到了玛丽·居里CIG、FWO-Odysseus II、Concern Foundation资金和拜耳医药公司的支持。这项工作还得到了史密斯家族基金会、巴勒斯-威康基金会、达蒙·润扬癌症研究基金会、斯特恩家族、美国癌症研究协会和国家癌症研究所(包括NIH 5P30CA1405141和R01CA168653)的支持。作者感谢Gavin Reid和Julia Busik进入他们的实验室;斯蒂芬妮·亚津斯基(Stephanie Yazinski)提供实验建议;Alice Chen、Amy Liu、Olivia Czajkowski、Jordan Honeysett、Michael Monterey、Jon Rennhack、Eric Poliner、Blair Bullard、Christoph Benning和科赫研究所Swanson生物技术中心提供技术援助;Craig Thomas和Matthew Boxer提供PKM2激活剂;Christian Metallo、Eric Bell、Ben Olenchock、Caroline Lewis、Brian Fiske、Katie Mattaini、Shawn Davidson、Jared Mayers、Amelia Yu和Zach Johnson对手稿进行了深入的讨论和评论。
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