内质网（ER）介导跨膜和分泌蛋白的折叠和成熟(1,2). 蛋白质折叠的生理需求增加会导致错误折叠的蛋白质积聚在内质网腔中，这种情况称为内质网应激。UPR感知这种压力，并通过扩大内质网的蛋白质折叠能力，同时减少其合成负荷来调节细胞适应。蛋白激酶R（PKR）样激酶（PERK）和肌醇需要酶1α（IRE1α）是后生动物UPR的两个关键传感器(1,2)：位于内质网膜中，每个内质网都有一个管腔结构域，用于检测折叠错误的多肽。PERK含有磷酸化真核翻译启动因子α（eIF2α）的细胞质激酶部分。这抑制了一般翻译，但促进了包括ATF4在内的首选因子的合成，ATF4激活了UPR转录因子C/EBP同源蛋白（CHOP）和其他基因。IRE1α同时具有激酶和内核糖核酸酶（RNase）细胞质部分(三). 激酶控制RNase活性，RNase介导ER-associated mRNA的调节IRE1α依赖性衰变（RIDD）(4)，并生成UPR转录因子X-box结合蛋白1剪接（XBP1s）。某些病理状况会导致无法解决的内质网应激(5)，经常导致细胞凋亡(1,2,6). 两个相互连接的信号级联控制细胞凋亡：内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径(7). 每一种都与不同的蛋白酶结合，称为启动子胱天蛋白酶，以激活一组常见的执行子胱天蛋白酶(8). 未缓解的内质网应激通过几个Bcl-2家族蛋白调节内在途径(1,2,6,9,10). 此外，IRE1α裂解特异性micro-RNA以抑制caspase-2的表达(11)；然而，胱天蛋白酶-2对于内质网应激诱导的细胞凋亡可能是可有可无的(12)从而使潜在的启动机制变得模糊不清。
生物和药理学内质网应激源的实验表明，caspase-8持续激活，caspase8是外源性途径中的关键启动子(8) (). 细菌AB5枯草酶细胞毒素SubAB通过裂解伴侣Bip诱导病理生理性内质网应激(13). SubAB导致KMS11多发性骨髓瘤细胞中的剂量依赖性Bip耗竭和ER应激，明显表现为CHOP和XBP1s上调(). 与数据一致，当IRE1α激活是暂时的时，PERK活性持续存在(14)24小时后，CHOP保持升高，而XBP1s下降。SubAB还诱导了24小时后caspase-8和caspase-3的激活，裂解的caspase和poly-ADP核糖聚合酶（PARP）产物证明了这一点。SubAB显著增加了caspase-8和caspase-3/7的酶活性，以及DNA片段化，这是凋亡的标志(图S1 A至C). Brefeldin-A（BfA）-一种ER-Glgi转运抑制剂-同样诱导SK-MES-1肺癌细胞的ER应激、caspase激活和凋亡(，以及图S1 D至F). 肌浆内质网钙ATP酶抑制剂thapsigargin（Tg）诱导野生型和非野生型持续CHOP和短暂XBP1s表达Bax公司−/−HCT116结肠癌细胞；而凋亡是必需的Bax公司，caspase-8激活没有(，以及图S1 G至I). 此外，caspase-8而非caspase-2的siRNA缺失通过不同的内质网应激源阻断了caspase-3/7的激活和凋亡(，以及图S1 J至O). Caspase-8激活Bcl-2-家族蛋白Bid，通过Bax参与内在途径(15,16). Tg诱导的caspase-8激活导致全长Bid下降(图S1I)，表示投标处理。Bid siRNA敲除相应地减弱了Tg诱导的细胞凋亡，而caspase-8 siRNA同时抑制了Bid处理和细胞凋亡(图S1 P至S). Tg还上调了Bim(图S1I)如报告所示(10)；然而，caspase-8和Bid处理发生得更早，提示Bim可能支持后期的凋亡信号。因此，caspase-8在内质网应激诱导细胞凋亡过程中起着关键作用，而caspase-2似乎是不必要的。
未缓解的内质网应激通过胱天蛋白酶-8触发细胞凋亡(A类)用SubAB处理KMS11细胞并进行免疫印迹分析。cC8：裂解的胱天蛋白酶-8；cC3：裂解半胱天冬酶-3。(B类)用BfA处理SK-MES-1细胞（24小时）并进行免疫印迹分析。(C类和D）通配符（WT）或Bax公司−/−用Tg（100 nM）处理HCT116细胞并进行免疫印迹分析(C类)或caspase-8活性测定（24小时）(天). (E类和F类)用对照siRNA或单个（C8a）或独立的caspase-8 siRNA池（C8b）或caspase-2 siRNA转染HCT116细胞（48小时）。用Tg（100 nM）处理细胞并进行免疫印迹分析(E类)或FACS通过亚G1 DNA含量测量细胞凋亡(F类). 图表描述了三倍的平均值±SD(天)或重复(F类).
在同源细胞外配体结合后，死亡受体Fas、DR4或DR5在质膜上形成死亡诱导信号复合物（DISC），通过适配器Fas-associated death domain（FADD）激活caspase-8(17). 与ER压力上调的证据一致DR5（数字参考5）转录(18)，定量RT-PCR（QPCR）显示为2-4倍DR5（数字参考5）通过Tg、BfA、SubAB或糖基化抑制剂衣霉素（Tm）诱导mRNA，对DR4、Fas，或肿瘤坏死因子受体1(，以及图S2 A至C). 内质网应激源通常同时升高DR5的长（DR5L）和短（DR5S）剪接变体(和图S2 D至H) (19). Tg在6小时内上调DR5，与CHOP和XBP1诱导一致，但在caspase-8处理之前(和图S2D). 此外，Tg诱导了与FADD和caspase-8的DR5核复合物，具有升高的caspase-8活性，与Bax公司(和图S2 I至K). DR5或caspase-8的免疫沉淀（IP）显示出类似的caspase-8活性(图S2L). 持续地，其他内质网应激因素增加了多个细胞系中DR5-associated caspase-8的活性(图S2 M至O). Tm治疗小鼠的肝脏也显示DR5升高，caspase-8裂解与凋亡相关(图S2 P和Q). 不同细胞系DR5 siRNA敲除强烈抑制caspase激活和凋亡，以应对各种内质网应激(，以及图S2 R至X). 因此，DR5对caspase-8介导的未缓解内质网应激的凋亡参与至关重要。
未缓解的内质网应激通过DR5激活caspase-8(A类)用Tg（100nM）处理HCT116细胞，并通过QPCR（标准化为GAPDH）测量mRNA水平。(B类)用Tm（1μg/ml）、Tg（100 nM）、BfA（1μg/ml）或SubAB（1µg/ml）处理HCT116细胞，并通过QPCR（归一化为GAPDH）进行分析。(C类)用Tg（100 nM）处理HCT116细胞并进行免疫印迹分析。(天)重量或Bax−/−HCT116细胞按C类（24小时），接受DR5 IP，并通过免疫印迹分析。(E–H（E–H）)HCT116细胞按天并分析了caspase-8的活性(F类)，caspase-3/7活性(G公司)和凋亡(H（H）). 图表描述了三倍的平均值±SD。
值得注意的是，与caspase-8敲除不同，单一DR5配体Apo2L/TRAIL的siRNA缺失对Tg诱导的HCT116或SK-MES-1细胞凋亡没有影响(和图S3 A和B). 此外，使用可溶性DR4-和DR5-Fc融合蛋白中和细胞外Apo2L/TRAIL（阻断外源性配体）并不能抑制Tg或BfA对细胞凋亡的激活(和图S3 C和D). 因此，内质网应激诱导配体依赖性DR5激活。DR5在静止的SK-MES-1细胞中几乎无法通过免疫荧光检测到，但在添加Tm、Tg或BfA后显示出更高的丰度(). 在Tg处理的细胞中，DR5与高尔基体标记RACS1共定位，而与ER标记KDEL共定位；然而，在含有少量高尔基体的BfA处理细胞中，DR5确实与KDEL共定位(和图S3 E和F). 尽管总DR5显著升高，但BfA并没有显著上调细胞表面DR5，也没有增加对外源性Apo2L/TRAIL的敏感性(图S3 G至J). 然而，上调总DR5和细胞表面DR5的Tg确实提高了对添加配体的敏感性(图S3 K至N). 在Tg处理的细胞内，DR5与裂解的caspase-8部分共定位(图S3O)支持细胞内激活。HCT116细胞洗涤剂提取物的尺寸排除色谱显示Tg驱动的低分子量（MW）组分中DR5L和DR5S的上调-代表DR5低聚物；DR5L升高也出现在高MW馏分中，表明DR5L多聚体(). 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8活性出现两个峰值：一个与高MW组分中的DR5L相一致，另一个与低MW组分的DR5相分离(). 化学交联证实了Tg诱导的DR5低聚物和多聚物的形成(图S3P). 此外，选择性DR5L siRNA敲除可减弱Tg驱动的caspase-8激活和凋亡(图S3 Q至T). 因此，Tg上调两种DR5变体，但DR5L优先多聚化，募集和激活胱天蛋白酶-8，并将加工过的酶释放到较低的MW级分中。
未缓解的内质网应激通过诱导配体非依赖性的细胞内DR5激活与胱天蛋白酶-8结合(A类)用对照siRNA或靶向Apo2L/TRAIL或caspase-8的siRNA转染HCT116细胞（48小时）。用Tg处理细胞（100 nM，24小时）并分析细胞凋亡。(B类)在载体或DR4-Fc加DR5-Fc（各10µg/ml）存在下，用Apo2L/TRAIL（1µg/ml）或Tg（100 nM）处理HCT116细胞（24小时），并分析细胞凋亡。(C）用指示的内质网应激源处理SK-MES-1细胞（24小时），并用DR5特异性抗体进行免疫荧光分析。(天)用Tg（20 nM，24小时）处理SK-MES-1细胞，并通过免疫荧光分析DR5或RACS1。(E类和F类)用1%Triton X-100提取的Tg（100 nM，24小时）处理HCT116细胞，并进行尺寸排除色谱；通过DR5 IP和免疫印迹分析组分(E类)或caspase-8活性测定(F类)：控制：直接从Tg处理的细胞获得DR5 IP。图表描述了重复项的平均值±SD(B类)或一式三份(F类).
与早期证据一致(18,20)，CHOP的siRNA缺失被显著阻断DR5（数字参考5）Tg或BfA上调mRNA表达，而CHOP转录靶点ER氧化酶1α（ERO）1α或生长停滞和DNA损伤诱导型34（GADD34）的敲低则没有(和图S4 A至E)，支持直接CHOP控制DR5（数字参考5）mRNA。当GADD34去磷酸化eIF2α以重新启动翻译时，ERO1α对内质网腔内蛋白质二硫键异构化和折叠起着重要作用(6). ERO1α基因敲除确实抑制了DR5L蛋白的上调和相关的凋亡事件(图S4 F至H)表明ERO1α可能促进DR5L的折叠（DR5L比DR5S含有更多半胱氨酸残基）。与CHOP缺失相比，IRE1α的siRNA敲除减弱DR5（数字参考5）Tg处理细胞中mRNA的衰减(和图S4 I至L)表明IRE1α通过介导DR5（数字参考5）里德。事实上，包含IRE1α催化结构域的重组蛋白在体外转录中被裂解DR5（数字参考5）离散位点的mRNA，这被IRE1αRNase抑制剂4µ8c阻断(21) (和图S4M). 此外，虽然CHOP siRNA减弱了Tg诱导的DR5上调、caspase-8激活和凋亡，但IRE1α缺失增加了这些事件(，以及图S4N). 相反，XBP1基因敲除导致IRE1α补偿性过度磷酸化()据报道(22)-加速DR5（数字参考5）mRNA衰减和DR5上调、胱天蛋白酶-8激活和细胞凋亡减少(，以及图S4 I至L和N). 最后，4µ8c通过Tg增强caspase激活(和图S4O)，证实了IRE1αRNase的抗凋亡作用。因此，CHOP和RIDD对DR5（数字参考5）控制caspase-8的激活和凋亡。
DR5整合相反的UPR信号以控制细胞凋亡(A类)用对照或CHOP siRNA转染HCT116细胞（48小时），用Tg处理（8小时），并用QPCR（归一化为GAPDH）进行分析。(B类)用对照IRE1α或XBP1s siRNA转染HCT116细胞（48小时），用放线菌素D（2µg/ml）加Tg（20 nM）处理DR5（数字参考5）mRNA以A类. (C类)含有激酶和核糖核酸酶结构域（KR43）的纯化重组人IRE1α在体外与转录DR5S（DR5S）或DR5升mRNA在载体或4µ8c（10µM）存在下。反应在6%TBE-尿素PAGE凝胶上分解，并用SYBR金染色。(D和E)用对照、IRE1α、CHOP或XBP1s siRNA转染HCT116细胞（48小时），用Tg处理（100 nM，24小时），并用免疫印迹分析(天)或caspase-8活性测定(E类). (F类)在载体或4µ8c（30µM）存在下，用Tg（100 nM，24小时）处理HCT116细胞，并分析caspase-8活性。图表描述了三倍的平均值±SD。
我们的数据揭示了DR5整合动态UPR信号以控制与内质网应激相关的细胞凋亡的细胞自主机制(图S4P). 可逆性ER中断后，PERK-CHOP活性诱导而RIDD抑制，DR5（数字参考5）抄本。如果ER压力消失，UPR活动减弱DR5（数字参考5）mRNA恢复到基线水平。然而，如果内质网应激盛行，PERK-CHOP功能持续，而IRE1α活性减弱(14)，允许数字5mRNA升高。内质网和高尔基体中DR5的积累驱动DR5L的配体依赖性多重聚合，这与早期数据一致(23)-比DR5S更倾向于集群。ERO1α，先前与UPR驱动的细胞凋亡有关(6)促进DR5L上调，可能是通过支持二硫化物异构化。DR5L为caspase-8募集和凋亡启动提供了一个类DISC细胞内平台。有人提出内质网应激通过增加自分泌死亡信号增加细胞凋亡(18,24,25)；然而，ER的破坏会减弱配体的分泌。我们的数据显示DR5（数字参考5）充当内质网应激持续性的细胞内“量规”。反向控制DR5（数字参考5）PERK-CHOP与IRE1α的mRNA合成和衰变确定了细胞凋亡前适应的时间窗。
