检查点阻断癌症免疫治疗靶向肿瘤特异性突变抗原

肿瘤移植

本研究中使用的MCA诱导肉瘤是在雄性129S6野生型或抹布2^−/−如前所述，小鼠和小鼠被储存为低侵袭性肿瘤细胞¹本研究中使用的所有细胞系均进行了支原体检测。从冷冻库存中提取并繁殖的肿瘤细胞在体外在RPMI培养基（Hyclone）中，辅以10%FCS（Hyclone）进行广泛清洗，并以6.67 x 10的密度重新悬浮⁶细胞ml⁻¹然后将150μl皮下注射到受体小鼠的侧翼。根据台盼蓝排除法评估，注射时肿瘤细胞存活率>90%。肿瘤生长通过卡尺测量进行量化，并表示为两个垂直直径的平均值。肿瘤生长测量是盲法进行的。样本量的选择基于之前对该动物模型的大量研究。未使用随机分组。对于抗体耗竭研究，在第1天和之后每隔7天向小鼠腹腔注射250μg对照单抗（PIP）、抗CD4（GK1.5）或抗CD8α（YTS169.4）。

MHCⅠ类表位预测

对d42m1-T3的所有错义突变进行分析，以确定形成与H-2D结合的MHC I类表位的可能性^b条或H-2K^b条分子。稳定矩阵法（SMM）算法³²，人工神经网络（ANN）算法³³，以及NetMHCpan算法³⁴由免疫表位数据库和分析资源提供(http://www.immuneacidepe.org)用于预测表位处理和结合亲和力，结果最终表示为亲和力值（1/IC₅₀× 100). 通过取SMM、ANN和NetMHCpan算法预测亲和力值的中位数，计算亲和力中值。为了预测表位处理，NetChop算法³⁵可从获取http://www.immuneacidepe.org使用，筛选潜在的表位，优先考虑NetChop评分为0.6或更高的表位。过滤器还用于消除假想Riken蛋白中发生的突变，并将导致亲和力值小于野生型序列预测值的突变去优先化。

抗体

抗-H-2K^b条（B8-24-3）和反H-2D^b条（B22/249）抗体由T.H.Hansen（华盛顿大学医学院）提供。A.J.Korman（Bristol-Myers Squibb）提供了抗PD-1（鼠嵌合IgG1克隆4H2）和抗CTLA-4（鼠IgG2b克隆9D9）抗体。分别从Bio X Cell和Leinco Technologies购买了同种对照抗体（小鼠IgG2a OKT3和小鼠IgG1 GIR-208）。抗CD4（GK1.5）、抗CD8α（YTS169.4）、抗IFN-γ（H22）单克隆抗体和对照免疫球蛋白（PIP，一种对细菌谷胱甘肽特异的单克隆抗体S公司-转移酶）由杂交瘤上清液产生，并通过蛋白G亲和层析（Leinco Technologies）以无内毒素形式纯化。CD3ε、CD4、CD8、CD45、LAG-3、TIM-3、PD-1、IFN-γ和TNF-α的荧光偶联抗体购自BioLegend。对于四聚体染色，CD8抗体购自Accurate Chemical（克隆CT-CD8α），推荐用于埃默里的NIH四聚体核心设施的四聚体染色。Fc块（抗CD16/32）购自BD Bioscience。

多肽

所有8、9和10肽均购自肽2.0。所有肽均经HPLC纯化至>95%纯度。疫苗实验用肽由ISA Therapeutics B.V.合成。这些肽在PTI Prelude肽合成器上使用固相Fmoc/tBu化学合成，并在Gilson制备HPLC系统上纯化至>95%纯度。在Waters Acquity UPLC/TQD系统上使用UPLC-MS确认疫苗实验所用肽的身份和纯度。

检查点阻断免疫治疗

肿瘤细胞以1 x 10的比例皮下移植到小鼠体内⁶细胞150μl注入侧翼。在肿瘤移植后第3、6和9天，用200μg抗PD-1或抗CTLA-4对小鼠进行腹腔注射，单独或联合使用。对照组小鼠分别注射200μg IgG2a和IgG1同型对照抗体。

CTL线的生成

为了产生d42m1-T3特异性CTL系，向野生型小鼠注射1×10⁶d42m1-T3肿瘤细胞，并用αPD-1处理，诱导肿瘤排斥反应。或者，给野生型小鼠注射1×10⁶d42m1-T3肿瘤细胞，未经αPD-1治疗，导致形成进行性生长的肿瘤，然后进行手术切除。50天后，这些小鼠被重新注射1×10⁶d42m1-T3肿瘤细胞，然后被排斥。在两种方案的情况下，在排斥两周后采集排斥肿瘤的独立小鼠的脾脏，通过刺激40×10建立CTL系⁶脾细胞2×10⁶d42m1-T3肿瘤细胞用100 U ml预处理48小时⁻¹重组小鼠IFN-γ，然后照射（100 Gy）。用照射过的IFN-γ刺激的肿瘤细胞加照射过的脾细胞和CD8再刺激培养两次⁺使用磁珠（Miltenyi Biotec）纯化T细胞。

肽结合分析

与RMA-S细胞的肽-MHCⅠ类结合分析³⁶通过将RMA-S细胞与肽的系列稀释液孵育24小时来完成。用单克隆抗体对细胞进行h-2K染色^b条和H-2D^b条其次是次级PE结合山羊抗鼠Ig（BD Biosciences），并用流式细胞仪进行分析。

四聚物

为了确定mLama4-或mAlg8-特异性T细胞浸润肿瘤的动力学，H-2K^b条与PE结合的四聚体由NIH四聚体核心设施（埃默里大学）生产的突变的Lama4或Alg8肽制备。用于筛选H-2K^b条或H-2D^b条预测表位，我们在家中生成肽-MHC I类复合物。用可紫外裂解的条件配体重新折叠的肽-MHC类I配合物如经修饰后所述制备³⁷简而言之，重组H-2K^b条和H-2D^b条重链和人β2微球蛋白轻链产生于大肠杆菌，分离为包涵体，溶于4M尿素，20 mM Tris pH 8.0。MHC I类复性反应是通过将重链：轻链：肽的摩尔比为1:1:8与10 mM磷酸钾（pH 7.4）透析48小时来进行的。可紫外线照射的肽SIINFEJL用于复性h-2K^b条购自肽2.0。通过离子交换（HiTrap Q HP，GE）捕获折叠肽-MHC I类复合物，生物素化，并通过凝胶过滤FPLC纯化。如前所述，对MHC I类多聚体进行紫外线诱导的配体交换和组合编码³⁸除了用于流式细胞术染色的肽-MHC多聚体是通过添加滴定量的链霉亲和素荧光色素以10μL格式制备的³⁹.

IFN-γ产生量的测量

为了产生靶细胞，用100 U ml⁻¹IFN-γ48小时，使用前用100 Gy照射。CTL细胞（20000个细胞）与肿瘤靶细胞（200000个细胞）在96周的圆底培养板中共培养48小时，总体积为200μl。为了对CTL系进行肽刺激，在37°C下用各种8或9聚肽对100000个照射过的（30 Gy）脾细胞进行脉冲处理1小时。洗涤脾细胞，添加20000个CTL，培养48小时。使用IFN-γELISA试剂盒（eBioscience）对上清液中的IFN-γ进行量化。用于阻断分析，25μg ml⁻¹抗H-2K^b条（B8-24-3）或反H-2D^b条在添加CTL细胞之前，将（B22/249）添加到靶细胞（肿瘤）中1小时。对于干扰素-γELISPOT，用PBS清洗预涂的96-well PVDF滤板（Millipore），并用含有10%FCS的介质进行调节。将来自脾脏的无红细胞单细胞悬浮液一式三份添加，并与1μM突变或野生型肽孵育20 h。大量清洗后，1μg ml⁻¹加入生物素化的检测抗体。随后使用链霉亲和素碱性磷酸酶和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸/硝基蓝四唑（BCIP/NBT）（Moss底物）进行显色。钢板在ImmunoSpot阅读器（C.T.L.）上进行扫描和分析。ELISPOT试剂从Mabtech购买。

肿瘤和脾脏收获

从小鼠身上切除已建立的肿瘤，切碎并用1 mg ml⁻¹HBSS（Hyclone）中的IA型胶原酶（Sigma）在37°C下放置1小时。脾脏也被采集、压碎并大力再悬浮，制成单细胞悬浮液。为了去除聚集物和团块，细胞通过40微米的过滤器过滤。

CD8（CD8）⁺TIL肽再刺激

肿瘤细胞的CD8富集⁺使用Miltenyi小鼠CD8的细胞⁺按照制造商的协议进行浓缩试剂盒。用CFSE标记幼年小鼠的脾细胞，并在30 Gy照射。然后用1μM肽和100000 CD8脉冲照射100000标记的照射脾细胞⁺随后添加TIL并在37°C下培养。1小时后，添加BD GolgiPlug（BD Bioscience），将细胞再培养4小时。进行表面染色，然后固定细胞并用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒进行渗透。然后对细胞进行IFN-γ和TNF-α染色。

H-2K的隔离^b条呈递肽

对于H-2K^b条分离后，肉瘤细胞株d42m1-T3和F244分别扩增为5×10⁸细胞。收获前，用300 U ml刺激细胞⁻¹IFN-γ48小时增加MHC表达。用100 U ml孵育可促进细胞分离⁻¹37°C，5%CO，PBS中胶原酶IV（Gibco）10分钟₂孵化器。用PBS清洗细胞两次，随后将细胞颗粒快速冷冻。如前所述，分离出MHC I类分子⁴⁰简而言之，将细胞颗粒放入1ml裂解缓冲液（1.2%CHAPS（德国达姆施塔特阿普利钦）、PBS中的1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏））中，并通过超声波均质。通过离心（2500g，30分钟）并通过0.2μm过滤器（德国哥廷根Sartorius），从剩余的细胞碎片中清除裂解液。使用H-2K通过免疫亲和纯化分离MHC I类分子^b条-特异性抗体Y3共价偶联到溴化氰活化的sepharose 4B（GE Healthcare）。用0.2%三氟乙酸（TFA）洗脱MHC分子，并通过带有10kDa截止膜的中心粒通过超滤进一步分离释放的肽（Millipore，Schwalbach，德国）。在LC-MS分析之前，根据制造商的说明，使用C18拉链头（Millipore）对肽进行脱盐，并通过真空离心调整体积。

H-2K的识别^b条肽发现MS

为了发现质谱⁴¹，在LTQ OrbitrapXL混合质谱仪上进行质谱分析（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA），该质谱仪配备了一个与反相液相色谱UHPLC系统（Ultimate 3000 RSLCnano，Dionex，Sunnyvale，CA，USA，）耦合的纳米电子喷雾离子源。样品以4μl min的流速注入75μm x 2 cm的捕集柱（Acclaim PapMap RSLC，Dionex）⁻¹持续5.75分钟。然后在50°C的柱烘箱中以175 nl分钟的流速在50μm x 50 cm的分离柱（Acclaim PapMap RSLC，Dionex）上分离肽⁻¹在140分钟内，乙腈的梯度为2.5%至32%。使用前五种方法实现数据依赖性采集（在每个扫描周期中，选择电荷为2+或3+的五种最丰富的离子进行碎片化）。在轨道飞行器中以60000的分辨率和350-600 mz的质量范围进行测量扫描⁻¹肽在离子阱中通过碰撞诱导解离（CID，归一化碰撞能量35%，激活时间30ms，隔离宽度2mz⁻¹). 使用包含列表对mLama4和mAlg8的双电荷质量进行碎片排序。

使用Proteome Discoverer 1.3（Thermo Fisher）和Mascot搜索引擎（Mascot 2.2.04，Matrix Science）进行数据处理。针对瑞士保护公司搜索了峰值列表小肌肉数据库（9月10日导出^第个2013年，16633个审查过的蛋白质序列）通过62个突变的H-2K延伸^b条候选序列。搜索限制为5 ppm前体质量耐受性和0.5 Da片段质量耐受性，未选择酶切特异性。使用Percolator算法评估错误发现率，目标值为0.05（5%FDR）。额外的后处理过滤器是离子得分≥20，搜索引擎排名1，肽长度在8到12个氨基酸之间。

H-2K的识别^b条靶向SRM肽

生成SRM⁴²在SRM-触发MS2模式下，合成肽首先在AB Sciex QTRAP 5500质谱仪上进行分析。肽（PEPotec SRM Grade 2）由Thermo Fischer Scientific GmbH（德国乌尔姆）合成。62个强结合H-2K中的51个^b条之所以选择肽进行分析，是因为它们具有理化性质，如果存在，可以通过质谱检测。肽的色谱分离是通过纳米LC超2Dplus系统（Eksigent）与内径75μm的15cm熔融二氧化硅发射器耦合，并用Magic C18 AQ 5μm树脂（Michrome BioResources）进行的。从冷却的（4°C）纳米LC-AS2自动取样器（Eksigent）将肽加载到柱上，并在60分钟内通过乙腈（5–35%）和水的线性梯度分离，其中含有0.1%甲酸，流速为300 nl min⁻¹质谱仪在SRM模式下运行，在检测到SRM痕迹时触发采集完整碎片离子光谱（阈值1000离子计数）。SRM采集是在第一季度和第三季度以单位分辨率（0.7 m z）运行的情况下进行的⁻¹最大峰宽的一半），每次过渡的停留时间为20 ms。对于每个肽，带有mz的y系列的第一个片段离子⁻¹高于mz⁻¹双电荷肽前体的前体+20汤姆逊（Th）被用作触发跃迁。使用四极（q2）碎片，低Q1分辨率，扫描速度10000 Da s，在增强产物离子模式下获得MS/MS光谱⁻¹和mz⁻¹范围为250–1000。根据以下公式计算碰撞能量（CE）：CE=0.044 x m z⁻¹双电荷前体离子的前体+5.5。使用ProteoWizard（版本1.6.1455）中的msConvert将原始数据文件（wiff）转换为mzXML格式。使用SEQUEST算法和肽噬菌体将Qtrap MS2光谱分配给肽序列。软件Skyline⁴³用于从Qtrap mzXML文件生成光谱库。如前所述，通过使用合成肽来确定单个肽的最佳SRM过渡条件（碰撞能和片段离子选择）⁴⁴从光谱中提取保留时间，并使用加标肽（Biogonosys）将其转换为与系统相关的保留时间（iRT）⁴⁵对于每个目标突变肽，在H-2K中添加重同位素标记的参考肽^b条肽混合物用于鉴定。对于每个肽，对重和轻版本的三到七个转换进行监测，并使用软件Skyline手动显示和分析生成的SRM数据。突变型MHCⅠ类H-2K的明确检测^b条-相关肽是通过比较参考重同位素标记肽和其内源性肽之间的三个特性而获得的：（a）它们的保留时间必须一致，（b）它们必须同时触发所有SRM转换，（c）SRM转换必须在正确的丰度层次中。

荧光激活细胞分选分析

流式细胞术中，细胞在室温下用500 ng Fc块（抗CD16/32）染色5分钟，然后用200 ng CD45、CD4或CD8α抗体在100μl染色缓冲液（含2%FCS和0.05%NaN的PBS）中染色_三（西格玛））在4°C下保持20分钟。碘化丙啶（PI）（Sigma）以1μg/ml的量加入⁻¹在FACS分析之前。对于四聚体染色，细胞在室温下用500 ng Fc块（抗CD16/32）染色5分钟。然后用抗CD8抗体（来自Accurate Chemical的克隆CT-CD8α）在4℃、1:100稀释度下对细胞染色20分钟。CD45和CD3ε抗体以及H-2K^b条然后以1:100的浓度在4°C下添加共轭于PE的四聚体30分钟。为了对肿瘤浸润淋巴细胞进行细胞内细胞因子染色，用GolgiPlug（BD bioscience）分离细胞培养5小时。然后收集细胞，清洗，用抗CD3ε和CD8α染色15分钟，然后用BD固定和渗透试剂盒（BD Biosciences）固定和渗透。然后用抗IFN-γ或抗TNF-α对细胞进行染色。为了分选mLama4特异性细胞，肿瘤滤过细胞富集CD45⁺细胞使用CD45细胞纯化磁珠（Miltenyi Biotec）。然后对富含CD45的细胞进行PI门控分类⁻CD3ε⁺CD8α⁺mLama4-四聚体-PE⁺或PI⁻CD3ε⁺CD8α⁺mLama4-四聚体-PE⁻细胞。在BD FACSAria II（BD Biosciences）上进行排序。将分选好的细胞制成颗粒并进行处理，以进行RNA分析。分选后的细胞分析中评估，用于输入RNA的分选细胞纯度大于90%。所有流式细胞术均在FACSCalibur（BD Biosciences）或LSR Fortessa（BD生物科学）上进行，并使用FlowJo软件（TreeStar）进行分析。

接种疫苗

用50μg对应于mLama4或mAlg8的肽与100μg poly I:c（Sigma-Aldrich）组合接种小鼠皮下。对于SLP，使用的mLama4肽序列是QKISFFDGFEVGFNFRTL公司QPNGLLFYT（表位下划线）和使用的mAlg8肽序列为AVGITYTWTRL公司YASVLTGSLV（表位下划线）。两周后采集脾脏，并用野生型或突变型Lama4或Alg8 8-mer肽重新刺激脾细胞。然后收集细胞进行ELISPOT分析。为了预防接种，在肿瘤移植后的第10天、第3天和第4天，向小鼠皮下注射50μg与mLama4或mAlg8相对应的肽，单独或联合使用，以及100μg poly I:C，总体积为200μl，在HBSS中稀释。d42m1-T3肿瘤细胞在1x10时移植⁶第0天肿瘤细胞。作为对照，用HBSS单独、poly I:C单独或与人类乳头状瘤病毒（HPV）对应的长肽疫苗与poly I:C免疫小鼠。除在肿瘤移植后第+3、+9和+15天接种疫苗外，以相同的方式进行治疗性疫苗接种实验。生存不足被定义为小鼠死亡或肿瘤大小为20mm。

RNA测序

经分选后细胞分析评估，分选细胞制剂的纯度大于90%。使用寡聚-dT珠（Invitrogen）从细胞裂解液中提取mRNA。对于cDNA合成，我们使用带有条形码和适配器连接序列（CCTACACGCTCTTCCGATCT-XXXXXXXX-T15）的定制寡核苷酸引物。在第一链合成后，根据Actb qPCR值将样品汇集在一起，并使用连续的酸碱处理降解RNA-DNA杂交。然后，使用T4连接酶（NEB）连接第二个测序接头（AGATCGGAAGAGCACACGTCTG），然后进行SPRI清除。然后通过16个PCR循环和SPRI纯化对混合物进行富集，以产生最终链特异性RNA-seq文库。在HiSeq 2500仪器上使用50bpX25bp对端测序对文库进行测序。第二个read-mate用于样本解复用，此时使用STAR对齐器将单个单端fastqs文件与mm9基因组对齐，并使用以下选项--runThreadN 8--outFilterMultimapNmax 15--outFisherMismatchNmax 6--outReadsUnmapped Fastx--outSAMstrandField intronMotif--outSAM type BAM SortedByCoordinate。使用ht-seq定量基因表达，使用DESeq2 R软件包定义差异表达基因，p值<0.01。如前所述，使用标准通路和免疫信号数据库进行基因集富集分析（GSEA）⁴⁶RNA-测序数据可在基因表达综合（GEO）储存库获取，网址为网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/.

我们感谢Kenneth Murphy（华盛顿大学）蝙蝠侠3^−/−小鼠，泰德·汉森（华盛顿大学）提供MHC I类抗体和H-2K^b条构建，Daved Fremont（华盛顿大学）用于人类β2m构建，以及美国国立卫生研究院（NIH）四聚体核心设施用于生产MHC I类四聚体。我们感谢Ariel Bensimon、Olga Schubert和Petri Kouvonen（瑞士苏黎世ETH）的仪器维护和MS测量的技术支持，感谢Rangan Vanganipuram、Mark Selby和Jose Valle（Bristol-Meyers Squibb）以无内毒素无菌形式生成和提供抗PD-1和抗CTLA-4。我们还感谢凯瑟琳·希恩（华盛顿大学）、保罗·艾伦（华盛顿大学，以及华盛顿大学医学院基因组研究所的许多成员。我们还要感谢Wilbur Song（华盛顿大学）对生物信息学方法的帮助，Pai Kvistborg（荷兰癌症研究所）对四聚体组合编码的帮助，以及Christopher Nelson（华盛顿大学的）对肽-MHC单体纯化的建议。这项工作得到了国家癌症研究所（RO1 CA043059，U01 CA141541）、癌症研究所和WWWW基金会对R.D.S.的资助；Siteman癌症中心/Barnes-Jewish Hospital的R.D.S.和W.E.G.（癌症前沿基金）；Susan G.Komen向W.E.G.提供治疗（承诺拨款）；来自国家人类基因组研究所的E.R.M；国家卫生研究所的G.J.F.（P50 CA101942，P01 AI054456，P50 CA101 942）；国家卫生研究所A.H.S（P50 CA101942）；以及荷兰癌症协会的T.N.S.（威廉敏娜女王研究奖）。欧洲委员会由欧洲共同体第七框架研究计划内的玛丽·居里欧洲内部研究金资助。M.M.G.获得了国家癌症研究所博士后培训补助金（T32 CA00954729）的支持，目前还获得了癌症研究所的博士后训练补助金（欧文顿博士后奖学金）的支持。华盛顿大学在人类免疫学和免疫治疗计划中心免疫监测实验室和Siteman综合癌症中心的协助下进行了多项研究。