cofilin通路在乳腺癌侵袭转移中的作用

摘要

肿瘤细胞的运动是侵袭的标志，也是转移的重要步骤^1,2鉴定有助于肿瘤细胞运动和侵袭的分子途径对于理解肿瘤细胞中运动是如何启动的以及肿瘤微环境如何促进细胞迁移至关重要。肿瘤细胞侵袭分子途径的识别将为转移癌的治疗提供新的诊断方法和靶点。最近使用新技术的研究，包括基于高密度微阵列的表达谱分析、活体内成像和从活肿瘤中收集侵袭性肿瘤细胞，已经开始扩展传统的转移模型，并提供新的转移疾病诊断和治疗标记物。

根据传统的转移模型，转移源于一个类似达尔文进化的过程，即自然选择作用于单个肿瘤细胞，以选择稳定的遗传变化。如此选择的细胞非常罕见，而由原发肿瘤中稳定基因突变的渐进选择产生的转移细胞会在肿瘤进展的后期导致转移^三然而，对小鼠乳腺肿瘤的研究^4–7，两种全人类乳腺肿瘤的表达谱^8,9从大鼠和小鼠乳腺肿瘤中分离的肿瘤细胞的侵袭性亚群^10–12表明乳腺肿瘤的转移能力编码于整个原发肿瘤，涉及基因表达的短暂变化，并且在肿瘤进展的早期阶段获得，比传统模型假设的要早得多。这些结果表明，达尔文式进化伴随着微环境诱导的支持侵袭和转移表型的基因表达的短暂变化，并可能有助于这种变化。这些结果导致了新的模型，其中微环境启动了诱导细胞运动、侵袭和转移的基因表达^11,13在“肿瘤微环境入侵模型”中，提出肿瘤细胞中的致癌突变导致微环境可能编码在整个肿瘤中。微环境与侵袭和转移增加相关的例子是微血管密度增加¹⁴巨噬细胞浸润¹⁵这些微环境可能是由巨噬细胞表达低氧诱导的生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）诱导的¹⁶，以及肿瘤细胞对集落刺激因子1（CSF1）的表达¹⁵推测这些微环境会引起肿瘤和基质细胞中基因表达的短暂和表观遗传变化。基因表达的这些变化将导致细胞-细胞相互作用的变化，以及原发肿瘤中具有迁移能力的肿瘤细胞亚群的迁移。在“乳腺癌转移的综合模型”中，乳腺干细胞发生致癌突变，从而产生预后不良的肿瘤。在基质细胞的影响下，乳腺癌干细胞群体获得迁移和转移的能力¹³在这两种模型中，迁移能力都需要激活运动周期，运动周期的第一步是肌动蛋白聚合，肌动蛋白的聚合推动细胞突起的形成，这些突起用于粘附细胞外基质、确定迁移方向和启动细胞爬行。Cofilin及其调节蛋白（Cofilin途径，最近在REFS中全面综述^17,18)参与运动周期早期步骤的启动，有证据表明，侵袭性肿瘤细胞中cofilin途径某些基因的表达发生了改变。

在乳腺肿瘤细胞系、从原发肿瘤中分离出来的乳腺肿瘤细胞的侵袭性群体以及整个乳腺肿瘤中，一致观察到基因表达的变化模式聚集在cofilin途径中¹¹(表1). 在细胞迁移过程中，这些基因在侵袭性肿瘤细胞中协调调节体内，表明cofilin途径在决定侵袭性和转移性表型中具有直接作用^10,12,17,18.

cofilin途径由一组激酶和磷酸酶组成，它们调节cofillin并协调启动肌动蛋白聚合和细胞运动，以响应乳腺肿瘤微环境中的刺激(图1). 这些刺激包括表皮生长因子（EGF）、转化生长因子-α（TGFα）、基质细胞衍生因子1（SDF1）和血红细胞凝集素，它们与刺激细胞迁移有关，并与各种肿瘤的进展相关。然后，Cofilin由四个独立的过程进行调节。首先，通过LIM激酶1（LIMK1）及其相关激酶（LIMK2，骨骼肌特异性激酶Nik相关激酶（NRK，也称为NESK）和睾丸蛋白激酶1（TESK1）和TESK2）在丝氨酸3上磷酸化cofilin，通过抑制其肌动蛋白结合活性来调节cofilin^19–22; 第二，cofilin的丝氨酸3被1、2A和2B型磷酸酶、弹弓（SSH）和计时蛋白磷酸酶去磷酸化，导致cofelin激活肌动蛋白结合^23–26第三，cofilin与肌动蛋白的结合被磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）的结合所抑制^27,28，cofilin活性依赖于磷酸脂肪酶Cγ（PLCγ）介导的PIP2（REFS）水解^29,30); 第四，Na-H交换蛋白介导的生理范围（6.8–7.4）内pH值的变化可以激活处于去磷酸化状态的cofilin的切断活性^31–34此外，在额外的调节水平中，LIMK通过p21-活化激酶1（PAK1）、PAK4和Rho-依赖性蛋白激酶（ROCK1）的磷酸化激活^31,105并通过SSH1脱磷抑制（参考。106)从而加强了cofilin的去磷酸化(图1).

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图1

EGF调节的cofilin途径

cofilin途径在肿瘤细胞中通过微环境中的刺激激活，例如表皮生长因子（EGF），EGF受体（EGFR）和ErbB家族的一个未知亚单位（可能是ERBB2或ERBB3）检测到EGF。在动物模型中，ERBB2对EGF刺激的乳腺肿瘤突起和细胞迁移有很大的增强作用¹⁰⁰EGFR异二聚体与ERBB2或ERBB3均可激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K），然后激活一组小G蛋白（Rho、CDC42（细胞分裂周期42）和Rac）及其辅丝素调节激酶（ROCK1和Pak）。这些激酶刺激LIM激酶（LIMK）磷酸化辅酶丝蛋白（P-cofilin），从而使其失活。磷脂酶如弹弓（SSH）、计时蛋白、1型、2A型和2B型磷脂酶可在活化时将辅酶丝脱磷酸化，使其具有潜在活性（如果不与磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）结合）如果pH值高于7.0）。虽然SSH可以通过F-actin结合和PAK4磷酸化激活在体外¹⁰⁶目前尚不清楚计时蛋白激活的机制。此外，EGFR–ERBB2可以激活磷脂酶Cγ（PLCγ）¹⁰¹其被提出通过PIP2的水解来激活辅菲林（参考。29)从而从细胞膜中释放cofilin。由任一路径激活的Cofilin切断母丝（旧的预先存在的丝），产生自由倒刺末端，导致新聚合的肌动蛋白丝伸长，而这些肌动蛋白纤维被ARP2/3复合物优先用于树突成核(方框1)以及G肌动蛋白，其来源于同一切断反应产生的尖端的解聚。在侵袭性肿瘤细胞中，ARP2/3复合物的亚单位与cofilin途径的基因一起过度表达^10,12从而可能增加cofilin和ARP2/3复合物之间的协同作用，导致树突状成核，从而推动细胞膜，导致细胞突起^45,47ARP2/3复合物由WASP（Wiskott-Aldrich综合征蛋白）家族成员激活，包括WAVE2和NWASP。已知NWASP在侵略者体内被激活^38,102在CDC42和Rho和/或Src介导的磷酸化的调节下。在细胞迁移过程中，cofilin通路在侵袭性肿瘤细胞中协调调节体内（大鼠乳腺肿瘤中上调的基因以粗体突出显示），表明cofilin途径（以红色方框和圆圈显示）在决定侵袭和转移表型方面有直接作用。

肌动蛋白聚合可以产生驱动膜突起形成的力。这些力量是形态发生过程中细胞形态、突起、迁移和趋化性变化的基础³⁵驱动细胞突起的肌动蛋白聚合力主要取决于自由倒刺肌动蛋白丝末端的形成，这些末端可以通过肌动蛋白单体（肌动蛋白单体被称为G-actin）的添加而伸长，从而形成生长的肌动素丝（肌动分子丝被称为F-actin），推动细胞膜(方框1). 这会导致细胞内的细胞器运输和细胞膜突起³⁶自由倒刺丝末端的出现，再加上肌动蛋白丝所含细胞骨架的进一步重塑，可以产生突出的结构，如足爪虫、侵入虫和丝状足虫，这些结构可以启动细胞运动并决定细胞极性³⁷这些类型的细胞突起在趋化性、细胞迁移和侵袭中是重要的路径指向结构³⁸cofilin途径最近已成为自由倒刺末端产生的核心参与者³⁹和肌动蛋白丝周转⁴⁰在各种运动细胞中，包括乳腺癌细胞^38,39，成纤维细胞⁴⁰,盘状网柄菌⁴¹和胶质母细胞瘤细胞⁴²在这些路径指向结构的形成过程中。

方框1

肌动蛋白丝动力学

肌动蛋白丝水解与肌动蛋白亚基结合的ATP，形成由含ADP（绿色）和含ATP（红色）亚基组成的肌动蛋白纤维。ATP亚基偏向于灯丝的优选生长端（倒刺端），如图中所示的初始母灯丝所示⁹⁰Cofilin切断会增加有倒刺端和尖头端的数量，因为在最初的母丝切断后，它不会与细丝片段的有倒刺末端结合。如果肌动蛋白亚基可以聚合到纤维碎片的倒刺和尖头端上，这将导致净肌动蛋白聚合大幅增加（纤维的绿色区域用星形表示）。倒刺端与G-actin的亲和力高于尖头端，并且倾向于迅速伸长，而尖头端在生理条件下解聚缓慢。在没有肌动蛋白亚基的情况下，片段将从尖头和倒刺末端解聚（未显示）。在存在G-肌动蛋白结合蛋白profilin的情况下，推测肌动蛋白亚基仅添加到有刺端，导致有刺端的净聚合和尖端的解聚（未显示）¹⁷ARP2/3复合物是一种蛋白质的七亚单位复合物，当被WASP（Wiskott-Aldrich综合征蛋白）家族蛋白激活时，它将结合到肌动蛋白丝的一侧，使新的子丝作为母丝的分支成核⁹¹这称为枝晶成核。活化的ARP2/3复合物优先结合到最近由含ATP的G-actin（纤维的红色区域）聚合而成的母纤维一侧，而cofilin通过切断形成新的倒刺末端来供应这些新的纤维，以支持其聚合⁴⁵.

cofilin途径的生物化学

Cofilin属于一个具有类似生化活性的相关蛋白家族，称为肌动蛋白解聚因子（ADF）/Cofilin家族。单细胞生物，如酵母，通常只有一种ADF/cofilin型蛋白，而多细胞生物通常有几种异构体。在一些培养的哺乳动物细胞系中⁴⁰和侵袭性乳腺肿瘤细胞^10,43cofilin 1是最丰富的亚型，而ADF的表达水平低得多（5%）。因此，在这篇综述中，“cofilin”指的是cofilin1，一种在侵袭性乳腺肿瘤细胞中发现的最丰富的亚型^10,12.

Cofilin是一种普遍存在的小蛋白（~19kDa），能够结合G-actin（单体）和F-actin（丝状actin）。利用光学显微镜直接观察cofilin与肌动蛋白丝之间的相互作用，这些肌动蛋白纤维丝通过交联固定在基质上，从而阐明了cofillin如何既能增加聚合过程中自由倒刺末端的数量，又能增加肌动蛋白解聚的速度（从而补充细胞中的G-actin）^40,44–46这些研究表明，nM浓度的cofilin可以有效地切断肌动蛋白丝，从而产生自由肌动蛋白纤维的倒钩端和尖端，可根据游离G-actin浓度和倒钩端盖蛋白的可用性进行聚合或解聚^44–46(方框1). 由于在这些研究中测量到的切断所需的cofilin浓度比之前在散装溶液中进行的实验估计的浓度低100倍，因此cofelin是一种比之前怀疑的更强大的切断蛋白^45,46这些结果使我们能够直接分析cofilin对肌动蛋白解聚速率常数的影响。以前，在本体溶液中的实验中提出，cofilin增加了肌动蛋白单体从肌动蛋白细丝尖端解聚的速率。然而，当在肌动蛋白丝的解聚率中考虑到由辅丝素切断产生的新的有刺和尖端的数量时，发现每个丝端的脱落率没有显著增加，并且对尖端的解聚也没有偏差⁴⁴用全内反射显微镜直接观察尖头处的纤维解聚速率，支持这一结论，并表明cofilin不会将脱聚速率提高到ADP–actin单体的脱聚速率之上，而ADP–actin单体通常是在没有cofillin的情况下出现的⁴⁶这大大简化了我们对cofilin如何影响肌动蛋白丝动力学机制的理解。也就是说，在有cofilin存在的情况下观察到的肌动蛋白丝的聚合和解聚都可以用cofillin切断肌动蛋白丝状物来解释，而无需在尖头丝状物末端引起脱聚速率的增加或解聚偏倚。

更值得注意的是，在μM浓度下，cofilin可以直接使肌动蛋白丝的组装成核⁴⁶并在nM浓度下大大增强肌动蛋白相关蛋白2和3（ARP2/3）复合体的树突成核活性⁴⁵(方框1). 后者的发生是因为cofilin切断母丝产生新聚合的肌动蛋白丝，而这些肌动蛋白纤维丝被ARP2/3复合物优先用于树突成核^45,47这两个结果都得到了动力学模拟的支持，表明当倒钩末端的加盖受到调节时，辅菲林将导致肌动蛋白聚合的大幅增加^46,48(图2). 这些结果表明，cofilin是一个比之前在体溶液中实验估计的更强大的成核因子。

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图2

表皮生长因子刺激下cofilin活性的时空定位

一|体内对肿瘤细胞的研究表明，EGF刺激的磷脂酶Cγ（PLCγ）水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），导致活性cofilin从其与质膜中PIP2的复合物中局部释放。这会不对称地激活肿瘤细胞内的cofilin，使其在细胞膜附近产生自由的倒刺末端，朝向表皮生长因子（EGF）的来源。短暂的cofilin活性是由于cofillin途径中的分子几乎同时激活的结果，这些分子通过EGF受体激活cofelin（PLCγ，slingshot（SSH）和chronophin）并抑制cofilin-（LIMK）。因此，cofilin在局部切断纤丝，开始聚合和细胞突起，而整体LIMK活性使从最初激活位点扩散的cofillin失活，从而在空间上增强cofilin-活性。受体通过G蛋白和LIMK的信号通路与图1但在这里重画是为了展示LIMK如何捕获从激活位点扩散的cofilin。这导致cofilin依赖的自由倒刺末端产物的定位更加清晰，并启动定向细胞运动和趋化性。b条|cofilin活性循环符合趋化性的局部兴奋-全局抑制（LEGI）模型。Cofilin在细胞内被不对称激活，以响应细胞表面受体从细胞前部到后部检测到的EGF梯度。细胞内cofilin激活的不对称性可能遵循EGF梯度的斜率。然而，由于LIMK活性的整体刺激，cofilin激活的这种浅梯度在局部变得尖锐，这被认为是为了使整个细胞中的cofillin失活，从而导致仅在细胞面向EGF源的一侧（正面）残留cofilin-活性。这由两条线所示，这两条线表示cofilin激活梯度（斜线）和全局LIMK活性（水平线），这是由浅EGF梯度的相同刺激产生的，从而压缩它们之间的有效cofilin-活性，使cofilin-activity向细胞面向EGF源的一侧锐化。

Cofilin受上述四个独立过程的监管。然而，感光性笼状cofilin的局部激活表明，cofillin在乳腺癌细胞中的局部激活产生游离肌动蛋白丝倒刺末端，引发肌动蛋白聚合，诱导细胞膜局部突起，并决定细胞迁移的方向³⁹Cofilin活化对形成稳定的侵袭足类至关重要，侵袭性肿瘤细胞迁移过程中使用这些侵袭足类，将Cofilin与肿瘤细胞侵袭联系起来⁴⁹因此，通过上述任何机制（去磷酸化、PIP2水解和增加pH值）局部激活cofilin原则上都可以启动肿瘤细胞的定向运动和侵袭。

然而，在侵袭性乳腺肿瘤细胞中，响应EGF而启动的cofilin激活与cofilin去磷酸化无关⁵⁰，所以假设这种耦合的模型⁵¹可能不适用于乳腺肿瘤的侵袭。这里需要谨慎一点。有时人们认为，细胞中去磷酸化的辅酶丝蛋白的量是辅酶丝活性的直接量度。然而，鉴于cofilin活性有四种调控机制似乎是解耦联的，因此无法通过测量去磷酸化cofilin-与总cofilin/的比值来评估细胞中cofilin-x的活性状态。对乳腺肿瘤细胞的研究表明，EGF刺激和PLCγ介导的PIP2水解可以激活乳腺肿瘤细胞中的cofilin²⁹这是从去磷酸化中分离出来的⁵⁰事实上，在用EGF刺激期间，乳腺肿瘤细胞中磷酸化cofilin的水平增加^29,50在这种情况下，从其与PIP2的复合物中局部释放cofilin导致其活化，同时LIMK1在整个细胞中全局磷酸化cofillin导致磷酸化cofelin的净增加，使肿瘤细胞内的cofilin-活性不对称地增强(图2). 这可能导致定向细胞运动和趋化性的启动^30,39如果在刺激时仅测量辅因子的磷酸化状态，则磷酸化非依赖性辅因子激活和磷酸化依赖性抑制之间的这种平衡（这对趋化性是必不可少的）可能被错误地解释为抑制辅因子对趋化性的要求。

cofilin途径的细胞生物学

普遍认为cofilin活性是细胞运动所必需的在体外然而，cofilin如何在细胞运动中发挥作用，以及运动周期的哪些部分受到cofelin活性的影响是复杂的，需要仔细的细胞类型特异性分析。在乳腺肿瘤细胞中，观察到在用EGF刺激乳腺肿瘤细胞60秒后，cofilin活性作为一种短暂的活性发生，并负责肌动蛋白丝倒刺末端形成的早期短暂性^29,50(图3). 这种有刺末端的早期瞬态是cofilin途径的输出²⁹这种输出与乳腺癌细胞的侵袭和转移活性呈正相关体内^12,43.

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图3

Cofilin活性是引起趋化性的早期倒钩末端瞬变所必需的

一|用表皮生长因子（EGF）刺激乳腺肿瘤细胞导致两个倒刺末端形成的瞬间(b条)位于细胞膜上¹⁰³第一个瞬态是启动肌动蛋白聚合和向EGF源突起所必需的，从而导致趋化性，第二个瞬态是维持细胞迁移所需的细胞突起所需的^29,30在趋化细胞中观察到两个倒刺末端形成的瞬间(粘液菌哺乳动物成纤维细胞和巨噬细胞）对各种趋化因子的反应，表明这种事件序列在爬行趋化细胞中是保守的。c（c）|在乳腺肿瘤细胞中，第一种（而非第二种）瞬态需要磷脂酶Cγ（PLCγ）和cofilin活性，这与cofillin途径的趋化作用有关（红线显示抑制PLCγ或cofelin活性的作用）^29,30.d日|依赖于Cofilin的自由倒刺端急剧局部化体内响应EGF梯度。引入EGF微量移液器源60秒后，第一次出现自由倒刺端（染成红色），主要出现在细胞面对EGF源的一侧（右侧图像；*表示充满EGF的微量移液管的位置）与非刺激细胞中自由倒刺末端分布更均匀相比（0秒）。零件一图中的数字取自REF。103并经生物学家公司许可复制；部分b条和c（c）图的第页复制自REF。29©（2004）洛克菲勒大学出版社；部分d日取自REF³⁰©（2006）爱思唯尔科学。au，任意单位。

由于EGF受体（EGFR）几乎同时激活了辅因子途径中的分子，这些分子既激活了辅因子（PLCγ、SSH和计时蛋白），又抑制了辅因子（LIMK），因此产生了短暂的辅因子活性(图1,​,2).2). 在乳腺肿瘤细胞中，cofilin的激活和抑制必须保持平衡，才能发生短暂的cofillin活性，并在空间上定位³⁰并以最佳方式突出^29,30过多或过少的cofilin活性会抑制突起、趋化性和运动性。此外，这种短暂活性的空间定位对于肿瘤细胞对EGF的定向细胞迁移和趋化性是必需的³⁰(图2,​,3).三). 瞬时cofilin活性的空间定位是由局部兴奋-全局抑制（LEGI）型模型引起的，该模型涉及cofilins的局部兴奋（激活）和LIMK1（REF）的全局抑制。30) (图2). LEGI模型已成功用于拟合其他细胞类型的趋化行为，如粘液菌，并解释趋化信号如何局部放大⁵²在乳腺肿瘤细胞中，放大器的一部分是PLCγ介导的对辅因子的激活和LIMK1介导的对辅因子的抑制之间的平衡，并且这种平衡被微量注射不能被LIMK1磷酸化的组成型活性辅因子突变体S3A、，磷酸化细胞中的所有cofilin，或抑制LIMK1的表达，在这种情况下，cofillin磷酸化不会发生。所有这些操作都破坏了cofilin和LIMK1之间的平衡，从而破坏了倒刺末端的早期瞬态生成，从而抑制了突起²⁹和对EGF的趋化性³⁰.

乳腺肿瘤细胞的结果与发现的结果一致，即不同细胞类型中cofilin的不平衡激活或抑制可改变突起和运动。然而，文献有时令人困惑。令人困惑的一个原因是，在操纵cofilin的表达时，在各种细胞类型中观察到的表型取决于操纵对co filin通路输出的影响，即早期的倒钩末端瞬变启动运动，但通常不测量倒钩末端的瞬变，因此很难知道该操作是增加还是减少了cofilin途径的输出。例如，cofilin在蛋白质水平的适度（2倍–4倍）过度表达增加了细胞迁移的速度粘液菌⁴¹和人类胶质母细胞瘤细胞⁴²，但据报道，较高水平的表达会抑制细胞运动⁵³第二，选择用于分析的细胞行为通常不同，导致明显的相互矛盾的结论。例如，用小干扰RNA（siRNA）抑制哺乳动物细胞系中的cofilin活性⁴⁰或组成活性LIMK域的表达⁵⁴抑制细胞运动，但据报道在黑腹果蝇S2电池⁵⁵野生型或非磷酸化cofilin突变体S3A的表达增加了黑色素瘤细胞在玻璃体凝集素上的迁移⁵⁶但据报道S3A可抑制乳腺肿瘤细胞的趋化性³⁰由于cofilin途径的复杂和短暂调控，需要仔细分析每种细胞类型每次操作的途径输出，以及相同细胞室和不同细胞类型之间的细胞行为的比较，以确定可推广到所有细胞的结论。

形态发生中的cofilin途径

cofilin通路的正常功能是形态发生过程中正常细胞迁移和极性所必需的。在低等真核生物中，如秀丽隐杆线虫，不同的cofilin亚型需要不同的形态发生步骤，包括胚泡定位和体壁形成⁵⁷.英寸果蝇属胚胎，cofilin是卵巢发育和卵子发生过程中细胞迁移所必需的⁵⁸以及维持翅膀、眼睛和其他上皮细胞的平面细胞极性⁵⁹此外，编码参与调节cofilin磷酸化的蛋白质的基因发生突变的苍蝇为cophilin途径在调节果蝇属形态发生(方框2).

有越来越多的证据表明，辅菲林途径在哺乳动物形态发生过程中也发挥着重要作用。虽然缺乏cofilin 1（非肌肉亚型）的突变小鼠在大体形态上与E9.5时的对照小鼠胚胎无法区分，但在足月时未发现胚胎，这表明cofilin1突变是胚胎致死性的⁶⁰在E9.5期之前，cofilin可能不是原肠胚形成期间广泛的形态发生运动所必需的，这增加了额外的cofillin亚型如ADF可能在这种类型的细胞迁移中进行补偿的可能性，与野生型对照胚胎相比，cofilin亚型ADF的过表达是野生型对照胚的3-4倍。然而，原肠胚形成后ADF的过度表达不足以补偿非肌肉cofilin的丢失。在非肌肉cofilin突变胚胎中观察到神经嵴极化和迁移缺陷，导致神经管闭合失败。cofilin定向激酶、磷酸酶、pH值和PIP2结合对cofilin-家族不同亚型的调节差异尚未常规检测到。然而，ADF对pH值的变化比cofilin更敏感⁶¹。此外，在鼠标和秀丽线虫，非肌肉亚型cofilin 1和ADF在解聚F-actin方面更有效在体外而不是cofilin的肌肉亚型^62,63这些发现表明，特定的cofilin亚型可能对胚胎发育和形态发生的不同阶段发生的细胞形状和迁移的变化至关重要。

在哺乳动物中，两种不同的LIMK亚型LIMK1和2被描述为可以磷酸化Rho家族GTPases下游的cofilin^20,64,65.LIMK可由Pak在上游激活⁶⁶以及ROCK^65,67和MRCK（强直性肌营养不良激酶相关CDC42-结合激酶）⁶⁸正常的中枢神经系统发育可能部分依赖于LIMK1，因为其缺失与人类遗传病Williams综合征有关，这与跛行1基因剔除小鼠⁶⁹威廉姆斯综合征是一种以多种行为和神经异常为特征的发育障碍，包括视觉空间认知缺陷。威廉姆斯综合征患者在染色体7q11.23上的一个区域具有杂合缺失，该区域包含大约20个基因，包括直线电机1然而，由于与该缺失相关的基因数量众多，尚不清楚这些发育缺陷是否可归因于直线电机1仅删除。此外，没有确凿的报告将威廉姆斯综合征与肿瘤发生和进展的增加联系起来。跛行1敲除小鼠的突触功能，特别是树突状棘的形态发生出现显著异常，树突状脊是一种富含F-actin的结构。跛行1含有磷酸化cofilin水平降低的基因敲除小鼠也表现出空间学习障碍和海马长时程增强⁶⁹以及海马体兴奋性突触功能受损⁶⁹这些小鼠的空间学习缺陷表明，LIMK1在树突棘形态发生和大脑功能中发挥着至关重要的作用，这可能导致威廉姆斯综合征患者的视觉空间认知受损以及其他行为和神经症状。尽管跛行2敲除小鼠的磷酸化cofilin水平几乎没有变化，海马突触功能也有轻微异常⁷⁰或出生后生长发育的重大变化⁷¹，睾丸生殖细胞精子发生潜能、存活率和睾丸缩小均存在缺陷⁷¹事实上，cofilin缺乏症对胚胎致命，而跛行1或Limk2型敲除是可行的，这表明磷酸化诱导的cofilin调控机制，如pH变化或PIP2结合，在形态发生和发育过程中可能很重要。此外，通常局限于睾丸（TESK1和2）和骨骼肌（NRK）的其他激酶可能在这些极端条件下进行补偿。

cofilin途径在肿瘤侵袭中的作用

正如研究所预期的那样，cofilin途径对细胞运动和形态发生至关重要在体外和体内，cofilin途径也与肿瘤细胞的侵袭和转移有关(表1). Cofilin在高侵袭性C6大鼠胶质母细胞瘤细胞系中过度表达⁷²，A549人肺癌细胞⁷³和人类胰腺癌细胞⁷⁴在来源于T细胞淋巴瘤（Jurkat）和宫颈癌（HeLa）、结肠癌（KM12）、肝癌（HepG2）和肾癌（COS1）的细胞系中，磷酸化cofilin的数量减少⁷⁵在大鼠乳腺肿瘤的肿瘤细胞浸润亚群中检测到cofilin的自发过度表达¹⁰此外，在口腔鳞癌的临床肿瘤样本中检测到cofilin表达水平增加⁷⁶、肾细胞癌⁷⁷和卵巢癌⁷⁸使用蛋白质组学和cDNA微阵列方法。野生型或非磷酸化cofilin突变体S3A的表达增加了黑色素瘤细胞通过重组基底膜的侵袭⁵⁶然而，一些研究发现，cofilin在癌症中下调，并且过表达与侵袭具有拮抗作用。在高转移潜能的MHCC97-H肝癌细胞中观察到cofilin下调⁷⁹卵巢表面上皮（OSE）细胞来源于有卵巢癌和/或乳腺癌家族史的女性，并且巴西航空公司1肿瘤抑制基因⁸⁰cofilin的调节过表达通过破坏细胞前沿的肌动蛋白细胞骨架来抑制人类肺癌H1299细胞的侵袭性⁵³显然，这些研究不同意cofilin表达水平对肿瘤侵袭的影响。因此，仅cofilin的表达状态不太可能足以确定癌细胞的运动和侵袭状态。如上所述，cofilin和其他分子（包括LIMK1）在cofilin途径中的平衡作用是肿瘤细胞趋化性和运动所必需的。在这些案例中，如果没有关于cofilin途径活性状态的信息，很难预测或解释改变该途径单个成分活性的结果。

LIMK1已被证明影响细胞运动和侵袭，但最初的报道不一致，即LIMK1的过度表达是增加还是减少侵袭。组成活性LIMK1的表达增加了磷酸辅酶filin的量体内抑制乳腺癌细胞对EGF的反应中肌动蛋白聚合和运动⁵⁴此外，LIMK1的过度表达抑制了神经母细胞瘤细胞系中的细胞运动⁸¹和Ras转化成纤维细胞⁸²，而显性阴性LIMK1增加了神经母细胞瘤细胞系的细胞活力⁸¹然而直线电机1siRNA表达抑制Jurkat T细胞运动⁵¹前列腺上皮细胞中LIMK1的过度表达增加了其侵袭性在体外⁸³和裸鼠溶骨性病变的形成⁸⁴此外，在meta-static前列腺细胞系中LIMK1表达减少会降低其侵袭基质凝胶的能力在体外⁸³显然，改变LIMK1的表达和活性对肿瘤细胞的运动和侵袭具有主要影响。然而，与对cofilin的研究一样，对LIMK1的研究也不同意LIMK1表达增加对肿瘤侵袭的影响，再次支持需要研究cofilin-通路的输出，将其作为研究的一个重要部分，在该研究中，对cofillin、LIMK1-或通路中其他蛋白质的活性进行调控。

关于cofilin和LIMK1如何影响肿瘤细胞侵袭的文献中不一致的来源，从大鼠和小鼠乳腺肿瘤中收集的侵袭性肿瘤细胞的基于微阵列的表达谱分析中得出了见解^10,12在这些实验中，将肿瘤细胞侵袭性亚群中的基因表达与从原发肿瘤中分离出来的平均肿瘤细胞中的基因表示进行了比较。研究发现，在原位注射乳腺肿瘤细胞系产生的大鼠乳腺肿瘤中，侵袭性肿瘤细胞增加了cofilin和LIMK1（REFS）的瞬时表达^10,43). 单独考虑cofilin或LIMK1可能会得出一个自相矛盾的结论，即导致cofelin活性受到抑制的LIMK1-过度表达与侵袭增加相关，同时导致cofillin活性增加的cofilin-过度表达也与侵袭增加有关。然而，当EGF刺激自由倒刺末端的早期瞬态时，在这些侵袭性肿瘤细胞中测量cofilin通路的活性(图3)与LIMK1和cofilin表达水平正常的同一肿瘤中的非侵袭性肿瘤细胞相比，它显著增加⁴³此外，增加LIMK1在这些乳腺肿瘤细胞中的表达可抑制cofilin途径并抑制侵袭和转移⁴³在患有多瘤中间T癌基因（PyMT）衍生乳腺肿瘤的小鼠中，侵袭性细胞增加了LIMK1和SSH的表达，但没有增加cofilin的表达。同样，对这些由PyMT-肿瘤衍生的侵袭性肿瘤细胞中cofilin途径的输出量的测量表明，与来自同一肿瘤的非侵入性肿瘤细胞相比，cofillin途径的输出增加了¹²因此，必须将cofilin途径作为一个整体来考虑，以预测操纵该途径的任何单个成分的效果，并要求将该途径的抑制（LIMK1）和刺激（cofillin和SSH）分支视为一种平衡。如果两个分支同时增加，抑制和刺激成分的成对过度表达可能会增加cofilin途径的整体活性，从而增加细胞迁移和趋化性（请参阅“cofillin途径的细胞生物学”一节）。这些结果在大鼠和小鼠中的另一个重要含义是，在解释表型时，查看单个基因的表达状态可能会产生误导，因为是通路中多个基因的集体活动决定了通路的综合输出，因此也决定了表型。

cofilin途径肿瘤转移

尤其是在乳腺肿瘤中，转移的微环境严重依赖巨噬细胞，巨噬细胞为血管生成、肿瘤生长、肿瘤细胞趋化性和侵袭提供信号¹⁵在大鼠和小鼠中，巨噬细胞和肿瘤细胞之间的通讯是旁分泌的，包括巨噬细胞产生EGF和肿瘤细胞产生CSF1，分别刺激肿瘤细胞和巨噬细胞的趋化性和侵袭性^7,85因此，在乳腺肿瘤中，肿瘤细胞的侵袭和转移受巨噬细胞提供的EGF的控制^7,85如上所述，在乳腺肿瘤细胞中，对EGF的趋化性由cofilin途径调节，并涉及cofilin-和LIMK活性之间的平衡，以游离肌动蛋白丝倒钩末端的形式产生EGF梯度的短暂和空间局部放大(图3,方框3). 因此，乳腺肿瘤的转移潜力被预测为部分取决于cofilin途径的输出。通过制备具有正常cofilin表达水平但过度表达LIMK1（在正常cofillin水平存在的情况下抑制cofilin-通路的输出）或表达显性-阴性LIMK结构域（增加cofilin-way的输出）的大鼠乳腺肿瘤细胞来验证这一假设⁴³当这些细胞被注射到乳腺形成肿瘤时，乳腺肿瘤的转移潜能与cofilin途径的输出直接相关。含有cofilin通路活性受到抑制（LIMK1过度表达）的肿瘤细胞的动物表现出侵袭和转移减少，并与生存率增加相关；而来源于cofilin通路活性增加的细胞的肿瘤（LIMK显性阴性）表现出侵袭和转移增加，并与生存率降低相关。特别有趣的是，来自肿瘤细胞的肿瘤中cofilin和LIMK1的过度表达显著增加了侵袭性体内与LIMK1过表达但cofilin表达正常的肿瘤侵袭水平相比⁴³这些结果表明，从整体上考虑cofilin通路的调控和活性状态，可以简单地解释LIMK1表达对癌细胞侵袭、灌注和转移的影响。更广泛地说，这些结果强调了改变的基因产物是决定肿瘤侵袭和转移表型的一部分的途径，而不是单个基因。这与我们关于信号通路（但不一定是其中的单个基因）如何影响肿瘤发生、发展的知识是一致的⁸⁶和迁移⁸⁷.

方框3

ADF和cofilin蛋白家族

肌动蛋白解聚因子（ADF）/cofilin蛋白家族在迄今为止检测的所有真核生物中都有表达。单细胞真核生物，如酿酒酵母，卡氏棘阿米巴和盘状网柄菌拥有一个ADF或cofilin基因。多细胞生物通常有几种ADF/cofilin亚型。秀丽隐杆线虫表达两种ADF/辅因子unc-60A和unc-60B，而黑腹果蝇表达一个单拷贝，双星（有关ADF/cofilins的完整系统发育回顾，请参阅REF。18). 一般来说，哺乳动物有许多根据序列同源性和生物活性分类为ADF和cofilins的亚型。据预测，所有哺乳动物都有一个ADF亚型在上皮细胞和神经元中表达最强烈，还有两个cofilin亚型，一个非肌肉型cofilin1在大多数胚胎和成年细胞中表达，一个肌肉型cofelin 2几乎只在骨骼肌中表达⁶²根据对各种小鼠细胞的研究，cofilin 1是非肌肉细胞中的主要亚型，表达量是ADF的6-11倍⁴⁰.王等.¹⁰表明cofilin1亚型在大鼠侵袭性乳腺癌细胞中选择性上调。

ADF和cofilin的所有同源物都被认为具有共同的结构，如这个空间填充模型所示。该模型基于三篇论文的发现^97–99丝氨酸3磷酸化位点以绿色突出显示，G-actin结合以红色突出显示，F-actin和PIP2结合重叠以蓝色突出显示。

未来的方向

转移编码在原发肿瘤的大部分中，这一概念将注意力集中在微环境对转移的贡献上^8,9在许多肿瘤中，炎症导致恶性进展⁸⁸特别是在乳腺肿瘤中，巨噬细胞向肿瘤细胞提供趋化和细胞运动信号，从而导致侵袭和转移。在这种情况下，巨噬细胞以与正常乳腺形态发生过程中巨噬细胞的功能相似的方式为转移提供微环境⁸⁹这表明转移可能是形态发生的无调节重复¹⁵因此，许多参与乳腺形态发生过程中上皮细胞迁移的基因可能在乳腺肿瘤转移过程中难以发挥作用。目前的结果表明，许多在形态发生和转移过程中表达状态上调的基因聚集在cofilin途径及其下游效应器中^10–12这使得cofilin通路成为抗转移治疗的潜在靶点。虽然关于cofilin活性对转移的影响的系统研究仅在乳腺肿瘤上进行，但鉴于cophilin对许多组织类型中的细胞运动和细胞生存能力至关重要，cofillin途径也可能在其他类型癌症的侵袭和转移中起主要作用，cofilin途径基因表达与各种肿瘤转移表型的相关性(表1). 在大鼠和小鼠乳腺肿瘤模型中，cofilin途径的九个基因过度表达，从而形成了多种增加cofilin-途径输出的方法组合。只有一对基因(直线电机1和cofilin）已经测试了它们对cofilin-途径活性的影响，结果表明cofilin-pathway输出可以预测转移潜能⁴³因此，针对cofilin途径输出的抑制剂，而不仅仅是单个基因的活性，更有可能对转移产生抑制作用。此外，不可能单独抑制cofilin，因为这是致命的，也会杀死正常细胞。在乳腺肿瘤细胞中，针对PLCγ1、SSH和计时蛋白的cofilin通路刺激分支的抑制剂，可用于降低通路的活性，足以抑制趋化性，可能在不杀死正常细胞的情况下具有治疗益处。目前尚无此类抑制剂。另一种方法是抑制基质细胞发出的激活肿瘤细胞中cofilin通路的信号。这将具有对转移性微环境中的肿瘤细胞更特异的优势。为了设计基质细胞抑制剂以激活人类乳腺肿瘤和任何其他类型的肿瘤中的cofilin途径，有必要描述激活cofillin途径的转移微环境，包括所涉及的基质细胞。在大鼠和小鼠的乳腺肿瘤中，这种激活所必需的基质细胞是巨噬细胞。然而，这项分析尚未使用其他类型肿瘤的动物模型进行，因此，刺激其他类型肿瘤中肿瘤细胞迁移的基质细胞尚不明确。

改变实验动物肿瘤中基因的表达，如对cofilin和极限1在乳腺肿瘤中⁴³，以确定必须改变哪些基因组合的表达或活性状态，以抑制cofilin途径的输出及其启动肿瘤细胞迁移。基于这些结果，可以对人类乳腺肿瘤和其他类型的肿瘤进行cofilin途径抑制剂的合理设计。直接测量从肿瘤中分离出来的活侵袭性肿瘤细胞中cofilin途径的输出量对于评估抑制剂的疗效是必要的。用于活体成像、侵袭性肿瘤细胞采集和表达谱分析以及测量cofilin通路活性的新技术，使得这一分析以及cofilin-通路抑制剂的测试成为可能。

致谢

词汇表

脚注

参考文献